頭狀莖點霉病菌的新寄主高粱及病菌的檢疫鑒定

王 穎，程穎慧，汪 瑩，高瑞芳，章桂明，史亞千，王紅英

（1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳 518045）

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頭狀莖點霉病菌的新寄主高粱及病菌的檢疫鑒定

王 穎1，2，程穎慧1，2，汪 瑩1，2，高瑞芳1，2，章桂明1，2，史亞千1，王紅英1

（1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳 518045）

摘 要：從進境美國高粱種子中分離到1種真菌，通過用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察菌落特征及病原菌形態(tài)特征，進行形態(tài)學鑒定；并結(jié)合分子生物學方法選取了目前常用的能夠用于對Phoma屬不同種進行區(qū)分的4個基因片段ITS、TUB、ACT和TEF進行PCR擴增、產(chǎn)物序列測定及比對分析，同時應(yīng)用柯赫氏法則進行致病性測定，結(jié)果均表明該真菌為頭狀莖點霉病菌Phoma glomerata。此病原真菌在高粱上發(fā)現(xiàn)屬于首次報道。該病菌是我國進境植物檢疫性有害生物，寄主范圍十分廣泛，但在高粱中未發(fā)現(xiàn)有為害的報道，此次檢出可判定高粱為該病菌的世界新寄主。

關(guān)鍵詞：高粱；Phoma glomerata；檢疫鑒定；新寄主

頭狀莖點霉﹝Phoma glomerata（Corda）Wollenweber & Hochapfel﹞又名葡萄莖枯病菌，英文名Phoma spot，系黑盤孢目（Sphaeropsidales）球殼孢科（Sphaeropsidaceae）莖點霉屬（Phoma）真菌，是我國進境植物檢疫性有害生物，美國、意大利、希臘、瑞典、印度、澳大利亞、以色列、秘魯、巴西、匈牙利、加納、南非、伊朗、中國等國家均有分布［1-8］，并且寄主范圍廣，能為害柑桔屬、蘋果、亞洲栽培稻、松屬、豌豆、黑麥、茄屬、馬鈴薯、普通小麥、蠶豆、葡萄等近100種寄主植物，造成寄主植物根、莖、葉及果實發(fā)病，如可在葡萄上引起莖枯、小麥葉斑等。葉片和果實上的斑點不規(guī)則，黃色或淡褐色，病斑長1～6 mm、寬1 mm。在高粱上沒有發(fā)生為害的報道。病菌可在穎片、果實和植物病殘體中存活?？赏ㄟ^風雨傳播，遠距離通過種子、土壤和繁殖材料傳播。本研究從美國進境高粱種子中分離到菌株，采用真菌形態(tài)學和分子生物學及致病性測定等多種方法進行確鑿鑒定，是在高粱上發(fā)現(xiàn)頭狀莖點霉的首次報道。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離培養(yǎng)

供試高粱樣品為船運散裝美國高粱，進境日期為2015年2月6日，貨物重量為53 757 t。按照SN/T 3682-2013《葡萄莖枯病菌檢疫鑒定方法》［2］對送檢樣品進行外觀檢查，挑取異常的高粱種子約500粒在25℃條件下保濕24 h，然后在-20℃冷凍24 h，用75%乙醇表面滅菌90 s，無菌水清洗3次后吸干水分，放置在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下黑暗培養(yǎng)，3 d后開始觀察。用解剖鏡觀察，如發(fā)現(xiàn)有菌絲長出，立即挑取菌落邊緣菌絲至PDA培養(yǎng)基上純化。將疑似P. glomerata分離物（2015SOU26）分別轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和高粱培養(yǎng)基上，25℃條件下黑暗培養(yǎng)，7 d后觀察記錄菌落正、反面的顏色、氣生菌絲的疏密程度及菌落特征，并測定病菌的生長速度、分生孢子器大小、分生孢子大小等。繼續(xù)培養(yǎng)25 d觀察記錄厚垣孢子的形態(tài)特征、大小等。

1.2 分子生物學方法

1.2.1 菌絲DNA提取 用滅菌針刮取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)物，于研缽中液氮冷凍后研磨，采用植物總DNA提取試劑盒提取病原菌總DNA，置于-20℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴增及序列測定 選取目前常用的能夠用于對Phoma屬不同種進行區(qū)分的4個基因片段ITS、TUB、ACT和TEF進行PCR擴增及序列測定［9-14］。分別采用ITS4/5［9］、ACT-783R/ACT-512F［10］、TUB2Fd/TUB4Rd［11］、EF1-728F/ EF1-986R［12］4套引物擴增ITS區(qū)、Actin基因、β-tubulin基因及翻譯延長因子TEF等4個基因片段，并進行雙向測序。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中含10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq聚合酶1 U（大連寶生物），引物各0.2 mmol/L，模板DNA 為10 ng。PCR擴增程序為95℃預(yù)變性5 min；進入循環(huán)：95℃ 30 s，ITS4/5、ACT-783R/ACT-512F、TUB2Fd/TUB4Rd、EF1-728F/EF1-986R退火溫度依次為58℃、52℃、55℃、55℃ 30 s，72℃ 80 s；72℃ 7 min。

1.2.3 序列比對及分析 在NCBI網(wǎng)站上對培養(yǎng)物測序所得的4個基因片段ITS、Actin、β-tubulin 及TEF序列進行Blast比對分析，確認分離物DNA序列與GenBank上相關(guān)物種序列的相似度。

1.3 致病性測定

1.3.1 高粱苗致病性測定 選用栽培17 d長出兩葉一心或三葉一心的高粱苗進行接種實驗。先用75%酒精棉球?qū)︻A(yù)備接種的葉片進行消毒，用無菌的注射針針刺梅花點，分別取培養(yǎng)5 d的 2015SOU26菌株菌絲塊和孢子懸浮液（8 700個孢子/μL）進行接種，以無菌水和無菌的PDA培養(yǎng)基塊作對照，用塑料袋套保濕72 h，室溫培養(yǎng)。

1.3.2 小麥苗致病性測定 選用栽培12 d長出兩葉一心的小麥苗進行接種實驗。先用75%酒精棉球?qū)︻A(yù)備接種的葉片進行消毒，用無菌注射針針刺1～3個點，取培養(yǎng)5 d的2015SOU26菌株菌絲塊進行接種，以無菌的PDA培養(yǎng)基塊作對照，用塑料袋套保濕72 h，室溫培養(yǎng)。

1.3.3 大豆苗致病性測定 選用栽培15 d的大豆苗進行接種實驗。先用75%酒精棉球?qū)︻A(yù)備接種的大豆莖基部進行消毒，用無菌注射針針刺梅花點，分別取培養(yǎng)5 d的2015SOU26菌株菌絲塊和孢子懸浮液（8 700個孢子/μL）進行接種，以無菌水和無菌的PDA培養(yǎng)基塊作對照，用塑料袋套保濕72 h，室溫培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

菌落在PDA培養(yǎng)基生長最快，培養(yǎng)7 d生長74.7 mm。菌落在PDA和OA培養(yǎng)基上均有輕微聳立的菌絲體，菌落邊緣顏色稍淺，灰色至橄欖綠色；在MEA培養(yǎng)基上菌落中央因產(chǎn)生大量分生孢子溢濃而呈淺橙色，菌落邊緣白色，氣生菌絲濃密呈羊毛狀；在高粱培養(yǎng)基上，菌落橄欖綠色，邊緣顏色稍淺（圖1，封三）。

2.2 形態(tài)特征

菌落上產(chǎn)生大量分生孢子器，分生孢子器在培養(yǎng)基上表生或半埋生，分生孢子器球形、半球形或倒洋梨形，有乳頭狀突起，通常單生，后期聚生，直徑為50～300 μm；分生孢子器初期釋放出淺粉色分生孢子液，后期顏色變深成淺橄欖色。分生孢子單細胞，無色透明，橢圓形至近圓柱形，直或向內(nèi)稍彎曲，有油球，多為2個，老熟的分生孢子變成淺褐色，分生孢子壁稍粗糙。測量30個孢子，大小為2.37～3.17 μm×5.40～7.18 μm，平均為2.76 μm×6.22 μm；厚垣孢子在形狀和大小上變化很大，通常多細胞磚格狀，形成分枝或不分枝的孢子鏈，偶有獨立單生，厚垣孢子起初光滑，后期粗糙，淺褐色至深褐色，測量30個厚垣孢子，大小為13.60～30.67μm×23.34～60.00μm，平均為20.95 μm×35.31 μm，見圖2、圖3（封三）。

2.3 DNA 序列比對分析

經(jīng)在GenBank中進行Blast分析，結(jié)果表明ITS片段與GenBank中葡萄莖枯病菌FJ427017.1 等33條序列同源性為100%，ACT基因序列與GenBank中葡萄莖枯病菌FJ426896.1等序列同源性為100%，TUB基因序列與GenBank中葡萄莖枯病菌FJ427115.1等序列同源性為100%，TEF基因序列與GenBank中葡萄莖枯病菌EU543969.1等序列同源性為99%。

2.4 致病性測定

將菌株2015SOU26分別接種高粱、小麥、大豆，接種后15 d發(fā)現(xiàn)高粱葉片、小麥葉片、大豆莖稈均發(fā)病。高粱、大豆接種部位變?yōu)楹诤稚“撸←溄臃N部位褪綠、黃化，對照植株均無上述癥狀，見圖4（封三）。對發(fā)病植株進行病原菌再分離，所有發(fā)病部位均分離到該病菌。

3 結(jié)論與討論

通過觀察分離物菌落性狀及形態(tài)學特征完全符合行業(yè)標準SN/T 3682-2013《葡萄莖枯病菌檢疫鑒定方法》等［2，15-16］對該病菌的判定依據(jù)，致病性測定表明該病菌能夠人工侵染高粱葉片、小麥葉片及大豆莖稈，經(jīng)序列分析和與GenBank中P. glomerata比對表明本次分離菌的ITS、TUB、ACT 和TEF與已經(jīng)登錄的葡萄莖枯病菌相應(yīng)序列高度一致。綜上所述，從美國高粱中截獲的病原真菌為葡萄莖枯病菌，雖然現(xiàn)有的文獻資料未見該病菌在高粱上發(fā)生為害的報道，但是由于該病菌寄主范圍廣泛，生存能力極強，不排除其在高粱上發(fā)病的可能性，本次從高粱上分離截獲到該病菌可判定高粱為該病菌的世界新寄主。

傳統(tǒng)的真菌鑒定，以形態(tài)學為依據(jù)，通過直接鏡檢、培養(yǎng)后菌落特征、孢子形態(tài)、大小等進行鑒定。但是由于有些真菌產(chǎn)孢時間長或不易產(chǎn)孢及形態(tài)變異較大，對準確鑒定造成一定的困難。20世紀80年代至今，分子生物學技術(shù)得到了長足的進步，其中DNA 序列分析對于了解真菌的基因結(jié)構(gòu)、表達及分子進化關(guān)系等具有十分重要的意義。序列測定是對致病真菌分類鑒別的重要手段。目前ITS區(qū)最常用于真菌的分類研究，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，但是針對Phoma屬真菌，ITS區(qū)就不能完全區(qū)分各個種間差異，需要利用一些蛋白編碼區(qū)，如β-微管蛋白基因（β-tubulin gene）、肌動蛋白基因（Actin gene）、延長因子-1α基因（EF-1α鈣調(diào)蛋白基因（calmodulin gene）等序列分析把菌株鑒定到種水平。P. glomerata為我國進境植物檢疫性有害生物，是我國首次從美國進境高粱上檢疫截獲。本次鑒定依據(jù)為行業(yè)標準SN/T 3682-2013《葡萄莖枯病菌檢疫鑒定方法》［2］，由于該病菌在高粱上沒有發(fā)生為害的報道，慎重起見，檢疫人員根據(jù)文獻報道［11-14］，選取了目前公認的能夠用于對Phoma屬不同種進行區(qū)分的4個基因片段進行序列分析，并完成致病性測定試驗，以準確鑒定P. glomerata。

我國雖然在一些寄主上有報道［3-8，17-22］，其中一些為植物內(nèi)生真菌，但未做致病性測定，與此次從美國高粱上截獲的P. glomerata致病性有可能存在差異，有必要作進一步研究。

參考文獻：

［1］ Farr D F，Rossman A Y. Fungal Databases，Systematic Mycology and Microbiology Laboratory，ARS，USDA ［EB/OL］. http：//nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/ index.cfm，2016.

［2］ 賀艷，趙良娟，段維軍，等. 葡萄莖枯病菌檢疫鑒定方法（SN/T 3682-2013）［S］. 北京：中國標準出版社，2014.

［3］ Wang X，Wang J，Gao J，et al. First report of leaf spot disease on Schisandra chinensis caused by Phoma glomerata in China［J］. Plant Disease，2012，96：289.

［4］ Zhao D，Kang Y B. First report of branch blight of tree peony caused by Phoma glomerata in China［J］. Plant Disease，2013，97：1114.

［5］ 田蘊慧，薛夢林，趙國柱，等. 冬棗貯藏期病害病原菌的鑒定［J］. 果樹學報，2010，27（3）：422-426.

［6］ Gao L L，Zhang Q，Sun X Y，et al. Etiology of moldy core，core browning and core rot of Fuji apple in China ［J］. Plant Disease，2012，97（4）： 510-516.

［7］ 王雪，王晶，高潔，等. 五味子褐斑病病原菌生物學特性研究［J］. 北方園藝，2013（7）：142-145.

［8］ 白飛榮，劉洋，李輝，等. 香山黃櫨枯萎病葉片真菌的分離與鑒定［J］. 生物學通報，2014，49（5）：51-53.

［9］ White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplicication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR protocols：Aguide to methods and applications［M］. San Diego：Aeademic Press，1990：314-322.

［10］ Carbone I，Kohn L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes ［J］. Mycologia，1999，91：553-556.

［11］ Aveskamp M M，Verkley J M，De Gruyter J，et al. DNA phylogeny reveals polyphyly of Phoma section Peyronellaea and multiple taxonomic novelties［J］. Mycologia，2009，101（3）：363-382.

［12］ Druzhinina I，Kubicek C P. Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea：from aggregate species to species cluster［J］. Journal of Zhejiang University Science，2005，6B：100-112.

［13］ Aveskamp M M，De Gruyter J，Woudenberg J H C，et al. Highlights of the Didymellaceae：A polyphasic approach to characterize Phoma and related pleosporalean genera［J］. Studies in Mycology，2010，65：1-60.

［14］ László IRINYI，Gy?rgy János K?VICS，Erzsébet SáNDOR. Taxonomical re-evaluation of Phoma-like soybean pathogenic fungi［J］. Mycological Research，2009，113：249-260.

［15］ Boerema G H，De Gruyter J，Nordeloos M E，et al. Phoma Identification Manual［M］. London：CABI Publishing，2004.

［16］ Morgan-Jones G. Phoma glomerata. CMI Descriptions of pathogenic fungi and bacteria［M］. Wallingford，UK：C.A.B. International Mycological Institute，1967：134.

［17］ 錢龍，楊明飛，冉雪琴，等. 銀杏產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離與鑒定［J］. 山地農(nóng)業(yè)生物學報，2007，26 （4）：305-310.

［18］ 路浩，盧圍，趙寶玉，等. 我國主要瘋草內(nèi)生真菌分離鑒定及其進化分析［J］. 中國獸醫(yī)學報，2012，32 （12）：1819-1827.

［19］ 臧威，孫翔，孫劍秋，等. 南方紅豆杉內(nèi)生真菌的多樣性與群落結(jié)構(gòu)［J］. 應(yīng)用生態(tài)學報，2014，25 （7）：2071-2078.

［20］ 賈敏，蔣益萍，張偉，等. 浙江天目山和建德地區(qū)產(chǎn)銀杏中內(nèi)生真菌多樣性的比較研究［J］. 現(xiàn)代藥物與臨床，2014，29（3）：262-268.

［21］ Sun X，Guo L D，Hyde K D. Community composition of endophytic fungi in Acer truncatum and their role in decomposition［J］. Fungal Diversity，2011，47：85-95.

［22］ 楊憶，武海燕，李朋華，等. 新鄭灰棗棗果內(nèi)生真菌的分離和鑒定［J］. 菌物學報，2015，34（1）：164-168.

（責任編輯 楊賢智）

Sorghum as a new host of Phoma glomerata and identification of this pathogen

WANG Ying1，2，CHENG Ying-hui1，2，WANG Ying1，2，GAO Rui-fang1，2，ZHANG Gui-ming1，2，SHI Ya-qian1，WANG Hong-ying1
（1. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518045，China；2. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine，Shenzhen 518045，China）

Abstract：The isolate 2015SOU26 was intercepted from sorghum imported from American in Shenzhen port. The methods of morphology，pathogenicity，sequencing，including ITS，TUB，ACT，TEF that usually used in indentifying Phoma and blast analysis were used in this study. The results indicated that the isolate was Phoma glomerata. The pathogen is the first report in sorghum，and it is a plant quarantine disease in China. Its host range is very extensive，but no damage report is found in sorghum，this result can preliminary judge that the pathogen has new host：sorghum in the world.

Key words：sorghum；Phoma glomerata；identification；new host

中圖分類號：S41-30

文獻標識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）02-0098-04

收稿日期：2015-11-05

基金項目：國家質(zhì)量監(jiān)督與檢驗檢疫總局項目（2014 IK008，2015IK267）

作者簡介：王穎（1968-），女，碩士，研究員，E-mail：mswy2008@163.com