豫北七豬場(chǎng)大腸埃希氏菌的分離及鑒定

崔迎亞,孟偉杰,唐柯,劉婷,趙坤

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

豫北七豬場(chǎng)大腸埃希氏菌的分離及鑒定

崔迎亞,孟偉杰,唐柯,劉婷,趙坤

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

從豫北地區(qū)7家規(guī)?；i場(chǎng)采得疑似仔豬黃痢、白痢、水腫病病料64份,實(shí)驗(yàn)室共分離到大腸埃希氏菌28株,經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)鑒定為O2的4株、O149的3株、O9的3株、O107的3株、O20的3株、O138的2株、O60的2株、O45的1株、O141的1株、O63的1株、O147的1株、O149的1株、O8的1株,另有2株未能定型,以O(shè)2、O149、O107、O138、O20、O60、O9等株血清型占優(yōu)勢(shì).對(duì)不同分離菌株做了藥物敏感性試驗(yàn),為該地區(qū)豬致病性大腸埃希氏菌病治療中藥物的選擇提供了依據(jù).

仔豬大腸埃希氏菌??；分離鑒定；血清型；藥敏試驗(yàn)

豬大腸桿菌病臨床上常見的有仔豬黃痢、白痢和仔豬水腫病.仔豬黃痢常發(fā)生于7日齡內(nèi)的哺乳仔豬,對(duì)仔豬成活率影響較大,危害比較嚴(yán)重[1-2].臨床上多根據(jù)發(fā)病日齡在7日內(nèi)、泄瀉出黃色痢疾樣糞便等特點(diǎn)而做出初步診斷.10～30日齡的仔豬,多發(fā)生白痢,主要癥狀是大便呈現(xiàn)乳白或灰白色.仔豬白痢發(fā)病率為10%～35%,發(fā)病率不高,但病死率非常高,在90%以上.水腫病多表現(xiàn)神經(jīng)癥狀,以胃壁、腸系膜等組織水腫為特征[3].根據(jù)特征性臨床癥狀、發(fā)病特點(diǎn)、病理變化,斷奶的健壯仔豬突然發(fā)病、顏面腫脹、發(fā)病率低、死亡率高等即可做出診斷.確診還需要采取前段小腸內(nèi)容物分離病原性大腸埃希氏菌并鑒定其血清型方可.為搞清楚豫北地區(qū)豬源大腸埃希氏菌類型,為進(jìn)一步控制本病提供理論依據(jù),我們對(duì)該地區(qū)的豬源致病性大腸埃希氏菌進(jìn)行了分離鑒定.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂平板、三糖鐵瓊脂平板、伊紅美蘭瓊脂平板、糖發(fā)酵管、MR、VP培養(yǎng)基、藥敏紙片由北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)O抗原血清從中國(guó)獸藥監(jiān)察所購(gòu)得,河南科技學(xué)院預(yù)防實(shí)驗(yàn)室保存[4].

1.1.2 試驗(yàn)小鼠小白鼠由河南科技學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng),20日齡小白鼠,體質(zhì)量20 g左右.

1.1.3 試驗(yàn)病料試驗(yàn)病料采集于河南省豫北地區(qū)的7家養(yǎng)豬場(chǎng)病死仔豬,無菌取病死仔豬肝臟、脾臟等64份病料.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離及鑒別培養(yǎng)每份病料取0.5～1.0 g,研缽內(nèi)細(xì)細(xì)研磨,之后加入稀釋液,1 500 r/min離心20 min,取上清液劃線接種到普通瓊脂平板培養(yǎng)基上,培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h,之后挑取可疑菌落進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)染色、鏡檢.

同時(shí),釣取典型菌落,培養(yǎng)于三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,進(jìn)行鑒別培養(yǎng),37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)菌菌落顏色等培養(yǎng)特性.

1.2.2 生化試驗(yàn)釣取典型菌落菌株,分別接種于蛋白胨水、糖發(fā)酵管、西蒙氏枸櫞酸鹽微量生化鑒定管、葡萄糖磷酸鹽胨水和MR、VP培養(yǎng)基,放置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d.觀察糖酵解情況、顏色變化等并記錄結(jié)果.

1.2.3 紙片法藥敏試驗(yàn)把分離的大腸埃希氏菌分別接種到普通肉湯培養(yǎng)基,增菌培養(yǎng).37℃下,培養(yǎng)16～18 h后,稀釋,含細(xì)菌量為105個(gè)/mL,稀釋之后的菌液均勻涂布在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上,然后取各種藥敏紙片,貼附在含菌瓊脂平板上,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,之后測(cè)量抑菌圈直徑大小,根據(jù)其抑菌圈直徑大小可以確定菌株對(duì)藥物的敏感性.判定標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑大于15 mm者為該種抗生素高敏菌株；抑菌圈直徑10～15 mm者為該種抗生素中敏菌株；抑菌圈直徑小于10 mm可判定該種抗生素耐藥[4-5].

1.2.4 血清型鑒定分離菌株的血清型鑒定用平板凝集試驗(yàn).從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上挑取各株菌落1～2個(gè),將各菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,用0.5%的石碳酸生理鹽水2 mL洗下瓊脂斜面上的細(xì)菌培養(yǎng)物,制成菌懸液,121℃下高壓滅活2 h,制成高壓抗原,先用多因子血清篩查,然后用單因子血清玻板凝集試驗(yàn)定型[6].

1.2.5 致病力試驗(yàn)選取20 g左右的小白鼠為對(duì)象.每組接種6只,用營(yíng)養(yǎng)肉湯37℃下培養(yǎng)16～18 h后的純化菌株培養(yǎng)液,分別進(jìn)行腹腔接種,每只腹腔注射接種0.3 mL.6只小白鼠接種無菌肉湯作為對(duì)照組.觀察統(tǒng)計(jì)注射后小白鼠發(fā)病、死亡情況,并從死亡鼠的心、肝中回收接種菌[6].

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

分離菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,可見圓形、較濕潤(rùn)、隆起的灰白色中等大小菌落[7].在營(yíng)養(yǎng)肉湯中經(jīng)37℃培養(yǎng)箱內(nèi)16～18 h培養(yǎng)后,可見在肉湯內(nèi)有均勻一致的混濁物,在試管底部有灰白色沉淀物,液面管壁處可見菌環(huán)形成；培養(yǎng)物經(jīng)涂片、革蘭氏染色之后鏡檢,視野下可見到大多數(shù)是單個(gè)存在的兩端鈍圓、革蘭氏陰性粗短桿菌.在麥康凱瓊脂、三糖鐵等鑒別培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性列于表1.這些特性均符合典型大腸埃希氏菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特性[7].

表1 鑒別培養(yǎng)結(jié)果Tab.1 The results of identification culture

2.2生化試驗(yàn)

分離菌株可以分解葡萄糖,且產(chǎn)酸、產(chǎn)氣.能發(fā)酵山梨醇、甘露醇.多數(shù)菌株能發(fā)酵水楊素[5-7].乳糖能被大多數(shù)菌株分解,只有個(gè)別菌株出現(xiàn)遲緩發(fā)酵乳糖,或者不規(guī)則發(fā)酵乳糖.對(duì)賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸,大多數(shù)菌株具有脫羧能力.V-P試驗(yàn)判定為陰性.靛基質(zhì)試驗(yàn)產(chǎn)生紅色環(huán)狀物,判定為陽性.M-R試驗(yàn)指示劑變紅,判定為陽性.硫化氫實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基不變色,判定為陰性.尿素酶試驗(yàn)培養(yǎng)基不變色,判定為陰性.具體情況列于表2.

表2 致病性大腸埃希氏菌的生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Biochemical experiment results of Escherichia coli

依據(jù)前面所進(jìn)行的各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可以判定,所分離菌株為大腸埃希氏菌.

2.3 致病性試驗(yàn)

在腹腔接種分離菌株8 h后,可見試驗(yàn)組小白鼠開始陸續(xù)發(fā)病,繼而死亡,接種菌株72 h內(nèi),所有參試小白鼠全部死亡.而對(duì)照組的6只小白鼠隔離飼養(yǎng)7 d無一例死亡.無菌取死亡小白鼠肝、脾,按照本文所述的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法,接種鑒別培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后,出現(xiàn)典型紅色菌落,分離菌株進(jìn)行染色、鏡檢,其形態(tài)特征符合大腸埃希氏菌的特點(diǎn).說明從病死仔豬中分離的大腸埃希氏菌具有致病性.

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果列于表3.

表3 28株大腸埃希氏菌對(duì)抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Drug sensitivity test results of Escherichia coli to different antibiotics%

（續(xù)表3）

由表3可以看出,28株大腸埃希氏菌對(duì)慶大霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星最為敏感,敏感率超過50%[8].而對(duì)乙酰螺旋霉素、苯唑青霉素、頭孢唑林、青霉素、頭孢氨芐、強(qiáng)力霉素、磺胺甲基異惡唑等藥物敏感率較低,耐藥率居高不下（均大于80%）.

2.5 血清型鑒定結(jié)果

從64份病料中共分離出大腸埃希氏菌28株,經(jīng)O抗原玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè),其O抗原血清型包括：O2的4株、O149的3株、O107的3株、O138的2株、O20的3株、O60的2株、O9的3株、O45的1株、O63的1株、O141的1株、O149的1株、O147的1株、O8的1株,另有2株未能定型,而以O(shè)2、O149、O107、O20、O9等菌株血清型占優(yōu)勢(shì).

28株大腸埃希氏菌經(jīng)O抗原單因子血清檢測(cè),鑒定出共有13種血清型存在,而以O(shè)2、O149、O107、O20、O9株血清型占優(yōu)勢(shì).

3 小結(jié)

28株大腸埃希氏菌經(jīng)O抗原單因子血清檢測(cè),鑒定出共有13種血清型存在,而以O(shè)2、O149、O107、O20、O9株血清型占優(yōu)勢(shì).

大多數(shù)菌株具有多重耐藥性.本研究發(fā)現(xiàn),最少耐藥4種,最多達(dá)到20種.本地菌株對(duì)慶大霉素敏感率最高（52.40%）,其次為氧氟沙星（51.74%）和環(huán)丙沙星（50.97%）.敏感率最高者也僅僅超過50%,說明耐藥菌株較多,必將給防治工作帶來較大困難.從耐藥情況來看,對(duì)乙酰螺旋霉素耐藥率最高,達(dá)100%,其次是苯唑青霉素95.24%、頭孢唑林91.96%、青霉素85.72%、頭孢氨芐84.82%、強(qiáng)力霉素84.13%和磺胺甲基異惡唑82.52%,這也符合革蘭氏陰性菌株對(duì)抗生素耐藥的規(guī)律.

[1]李運(yùn)龍,李繼偉,任家琰.仔豬大腸埃希氏菌桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2009（2）：4-7.

[2]李冰,唐峰,馬鳴瀟.錦州地區(qū)雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27（29）：38-41.

[3]薛雨佳,于大勇,崔敏,等.引發(fā)仔豬水樣腹瀉的多重耐藥、高致病性大腸埃希菌的分離與鑒定[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40（9）：204-208.

[4]汪洋,易力,王紅寧,等.川西北牦牛致病性大腸埃希氏菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2008,44（5）：36-37.

[5]楊山虹,劉琪,梁培松,等.2007—2010年臨床分離大腸埃希菌藥物敏感性分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2012（6）：467-468.

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（責(zé)任編輯：盧奇）

Isolation and identification of Escherichia coli from seven swine farms in the north of Henan

CUI Yingya,MENG Weijie,TANG Ke,LIU Ting,ZHAO Kun
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Twenty-eight strains of Escherichia coli were isolated from seven swine farms in the north of Henan,and were identified by serologic test as four O2,three O149,three O9,three O107,three O20,two O138,two O60,one O45,one O141,one O63,one O147,one O149,one O8,and two uncertained.O2,O149,O107,O138,O20,O60,and O9were superior main.Drug sensitivity of different strains was tested,which can provide evidence for the choose of drug to the E.coli in this region.

Escherichia coli；isolation and identification；serogroups；drug sensitivity test

S852.61

A

1008-7516（2016）02-0045-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.02.011

2016-02-29

2012年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201210467013）

崔迎亞（1990―）,河南夏邑人,本科生.

趙坤（1968―）,男,河南南陽人,博士,教授.主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)教學(xué)與研究工作.