廣州市2009－2010年DENV－3型病毒分子生物學(xué)特征分析

梁雪瑩 景欽隆 李意蘭 曹 慶 魏躍紅 羅 雷

廣州市2009－2010年DENV－3型病毒分子生物學(xué)特征分析

梁雪瑩 景欽隆 李意蘭 曹 慶 魏躍紅 羅 雷

目的探討廣州市DENV－3型病毒的基因變異及傳播模式，為登革熱疫情防控提供科學(xué)建議。方法對2009－2010年采集的疑似登革熱病例早期血標(biāo)本進(jìn)行檢測RT－PCR，陽性標(biāo)本血清接種至C6/36細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。對登革病毒E基因進(jìn)行測序，并與基因庫中全球和中國其他省份DENV－3代表病毒株進(jìn)行比對，對廣州病毒分離株的來源和同源性進(jìn)行分析。結(jié)果共分離獲得13份DENV－3型病毒樣本(2009年7份，2010年6 份)，基因樹系譜分析顯示DENV－3型病毒包括3個基因型(Ⅰ，Ⅲ，Ⅴ)，其中基因Ⅰ型來源于印度尼西亞，基因Ⅲ型的2個節(jié)點(diǎn)族中，A節(jié)點(diǎn)族來源于科特迪瓦，B節(jié)點(diǎn)族來源于坦桑尼亞，基因型Ⅴ來源于菲律賓。2009年和2010年病毒株E基因核酸分別存在1.3%～9.0%和0.5%～3.9%的差異。結(jié)論2010年分離病毒株并非2009年的延續(xù)，不同基因型的DENV－3型病毒可能是通過不同的地理路徑傳入。

登革熱;DENV－3型;分子生物學(xué)

【Author's address】Guangzhou Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510440，China

登革病毒(Dengue Virus)是黃病毒屬中的一個血清型亞群，形態(tài)結(jié)構(gòu)與乙腦病毒相似，體積約17～25 nm，依抗原性不同分為1、2、3、4四個血清型，同一型中不同毒株也有抗原差異［1］。感染登革病毒后可引發(fā)不同的臨床表現(xiàn)［2］，重癥者甚至出現(xiàn)登革出血熱或登革休克綜合癥［3－4］。1980年廣州市范圍內(nèi)首次分離出DENV－3型病毒，隨后四型登革熱在廣州相繼出現(xiàn)，2000年后，廣州登革熱暴發(fā)多由DENV－1引起。但DENV－3型在2009和2010年再次被分離出，且引發(fā)了較大規(guī)模的暴發(fā)流行［5］。連續(xù)兩年同型登革病毒的流行提示廣州可能存在本地化的風(fēng)險，而現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查無法證實(shí)上述風(fēng)險。因此，為探明DENV－3型病毒在廣州流行的分子生物學(xué)特征判斷兩年同一血清型登革病毒暴發(fā)疫情是否由同一基因型別引起，特對2009年和2010年所獲得的DENV－3型病毒E基因全序列進(jìn)行全面的分析?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 病例及標(biāo)本采集

2009－2010年間通過主動和被動監(jiān)測累計診斷登革熱病例55例，每例病例均采集急性期外周血5 mL，6 h內(nèi)送實(shí)驗室進(jìn)行登革病毒實(shí)驗室檢測。

1．2 病毒株獲取

陽性血標(biāo)本1∶10稀釋后取100 μL接種C6/36白蚊伊蚊傳代細(xì)胞，吸附1 h后棄去上清，加入含15%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置34℃孵箱中培養(yǎng)，7 d后傳代，以出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)殛栃裕B續(xù)傳代3次均無細(xì)胞病變則判斷為陰性。在細(xì)胞病變達(dá)+++時取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，－70℃凍存［6］。

1．3 RNA提取和擴(kuò)增

取病變細(xì)胞培養(yǎng)上清140 μL，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取登革病毒RNA。用PrimeScript One－Step RT－PCR(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下:50℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄，94℃2 min變性，94℃30 s，55℃30 s，72℃3 min，35個循環(huán)，最后72℃保溫7 min。用TBE緩沖液配制含0.5 μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR產(chǎn)物，與1 μL上樣緩沖液混和，在TBE緩沖液中以80 V恒壓電泳1 h，在透射式紫外分析儀上觀察，出現(xiàn)特異性條帶為陽性。

1．4 E基因序列測定與同源性分析

擴(kuò)增的DENV－3型病毒DNA經(jīng)純化后采用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Germany)進(jìn)行序列測定。測定后的各片段序列采用Seqman II程序(DNASTAR，Inc．，Madison，WI，USA)進(jìn)行拼接并組裝成完整的E基因組序列，經(jīng)過核對校正后上傳至GenBank。序列測定所用引物見表1。采用BLAST引擎對核苷酸百分比和氨基酸一致性進(jìn)行同源性比對;應(yīng)用Clustal X v．1.83軟件進(jìn)行序列多重比對，然后運(yùn)用MEGA 4.0軟件采用Kimura校正模型的領(lǐng)接法(neighbor－joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［7］。

表1 用于DENV－3 E基因全序列擴(kuò)增和測序引物

2 結(jié)果

2．1 分離獲得病毒株情況

55例病例中17份標(biāo)本RT－PCR檢測陽性，共分離獲得13株DENV－3病毒，其中2009年7株，2010年6株，病毒株 E基因序列均上傳至 Gen-Bank，各病毒株基本信息及上傳序列號，見表2。

表2 廣州2009－2010年13株DENV－3病毒分離株基本信息

2．2 核苷酸和氨基酸序列比較

除10/GZ/10549病毒株外，2010年的其余5株DENV－3分離株非常近似，核苷酸和氨基酸一致性分別為99．5%～100%與98．7%～100%。2009年3株分離株(09/GZ/1483，09/GZ/10806，09/GZ/ 1081)表現(xiàn)出高度一致，核苷酸和氨基酸一致性均超過 99．7%。2009年其余 3株病毒(09/GZ/ 10616，09/GZ/11144，09/GZ/11194)與 09/GZ/ 13105分離株相似度較低(核苷酸一致性在99．3%～99．5%之間，氨基酸一致性在98．9% ～99．1%之間)。然而，2009年與2010年病毒分離株核苷酸和氨基酸差異分別在1．3% ～9．0%和0．5%～3．9%之間，提示兩年分離獲取的13株DENV－3可能來自不同的地區(qū)。13株DENV－3病毒E基因核苷酸百分比和氨基酸一致性見表3。

2．3 基因序列進(jìn)化分析

從GenBank檢索出90株代表全球不同地區(qū)DENV－3病毒E基因序列(表4)，與廣州2009年和2010年的13株DENV－3病毒E基因序列繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖1)，結(jié)果顯示廣州13株DENV－3病毒株分屬DENV－3型病毒的I、III和V基因亞型，其中2010年僅1株分離(10/GZ/10549)屬于I基因亞型，與2004至2007年印度尼西亞分離株相近似，3株2009年分離(09/GZ/1081，09/GZ/1483，和09/GZ/10806)屬于V基因亞型，這與廣西1980年分離株近似。其余9株病毒均分屬III基因亞型，且可分為A和B兩個節(jié)點(diǎn)族，A節(jié)點(diǎn)族包括2009 年 4株 (09/GZ/11144，09/GZ/11194，09/GZ/ 10616和09/GZ/13105)，B節(jié)點(diǎn)族包括2010年5株分離株(10/GZ/4898，10/GZ/5536，10/GZ/9119，10/GZ/9534，和10/GZ/9721)，這些毒株系統(tǒng)發(fā)生樹與2010年坦桑尼亞分離株相近似。

表3 2009－2010年廣州13株DENV－3病毒株間核苷酸和氨基酸一致性百分比

表4 用于E基因測序分析的DENV－3病毒參考株

3 討論

DENV－3病毒最初在1956年菲律賓暴發(fā)疫情中分離到［8］，之后該血清型迅速地擴(kuò)散至全球各地。截止目前，DENV－3可分為4～5個基因亞型。I～I(xiàn)II基因亞型是DENV－3感染的主要基因型，且與東南亞、印度次大陸、東非和美洲的DF/DHF發(fā)生有關(guān)。DENV－3病毒中的III基因亞型被認(rèn)為可能具有更強(qiáng)的傳播效率［9］，甚至更易導(dǎo)致登革出血熱的發(fā)生，一旦該基因亞型在局部地區(qū)形成傳播流行，其很快將導(dǎo)致跨區(qū)域的大流行［10］。

廣州近10年均為DENV－1流行，2009年和2010年流行的DENV－3是距1980年29年之后的再現(xiàn)［3］，系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果顯示2009年和2010年雖然均分離到III基因亞型病毒株，但兩年的病毒株卻分屬兩個不同的節(jié)點(diǎn)族(節(jié)點(diǎn)A和節(jié)點(diǎn)B)，兩者之間的病毒株核苷酸的一致性相對較低(97.7%～98.7%)，尚不能證明兩年之間的流行存在關(guān)聯(lián)。相反，廣州市分離到的病毒株與境外發(fā)現(xiàn)病毒株存在高度同源性:A節(jié)點(diǎn)族與2008年科特迪瓦分離株更相近，2010年5株病毒與坦桑尼亞2010年分離株AB549332共同組成B節(jié)點(diǎn)族，提示兩年的DENV－3型病毒可能來源于不同的國家或地區(qū)，DENV－3病毒可能存在多條輸入途徑進(jìn)入廣州，既往研究顯示2010年3株白云區(qū)分離株，1株南沙區(qū)分離株和1株越秀區(qū)分離株與坦桑尼亞2010年分離株近似，而2010年番禺區(qū)分離株印度尼西亞病毒株相近似［5，6，10］。隨著國際旅游和對外貿(mào)易的發(fā)展，登革病毒跨國傳播風(fēng)險也急劇增加。因此，在今后的防控工作中，應(yīng)在機(jī)場等出入境關(guān)口建立切實(shí)有效的發(fā)熱病例篩檢系統(tǒng)及時發(fā)現(xiàn)可疑輸入性病例以及加強(qiáng)登革病毒的實(shí)驗室監(jiān)測以及時發(fā)現(xiàn)早期輸入病例［11］。輸入病例進(jìn)入廣州后未得到有效控制是境外基因亞型DENV－3病毒在廣州流行的重要原因，因此病例監(jiān)測系統(tǒng)的靈敏性和輸入病例控制的能力也亟待提高。

綜上所述，2009和2010年廣州登革疫情并非同一流行株的連續(xù)傳播或2009年毒株在2010年的再現(xiàn)，不同基因型的DENV－3型病毒可通過不同的地理路徑傳入，DENV－3不同基因亞型毒株的反復(fù)輸入是引發(fā)廣州2009年和2010年登革熱暴發(fā)流行的主要因素，分子流行病學(xué)研究提示DENV－3在廣州的再現(xiàn)流行尚未表現(xiàn)出本地化的趨勢。雖然對獲取到的所有病毒株進(jìn)行了同源性分析，但由于僅有13份病毒株，本研究的結(jié)論仍需大樣本的驗證，在今后的研究中，將繼續(xù)加強(qiáng)廣州登革熱病例監(jiān)測和登革病毒分離培養(yǎng)工作，進(jìn)一步探討輸入病例在本地的傳播模式，同時驗證登革熱是否存在本地化的趨勢。

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The Molecular Characteristics of Envelope Gene of DENV－3 in Guangzhou During from 2009 to 2010

LIANG Xueying，JING Qinlong，LI Yilan，et al

Objective To explore the variation and transmission pattern of DENV－3 in order to provide scientific suggestions for control and prevention dengue fever．MethodsRT－PCR test was conducted in blood samples collected from suspected dengue fever cases during 2009 and 2010．Positive serum was arranged for viral culture on C6/36 cell．The envelope(E)genes of viruses were sequenced and compared with previously published E gene sequences of global representative DENV－3 strains available in GenBank，which also included isolates circulating in other provinces of China．ResultsA total of 13 isolates(7 from 2009 and 6 from 2010，respectively)were obtained from human serum samples．Phylogenetic analysis revealed that the isolates were grouped into three genotypes(I，III，V)and then two clades within genotype III(genotype I from Indonesia，genotype III clade A from Cote dIvoire，genotype III clade B from Tanzania and genotype V from Philippines)．In addition，there were 1．3%－9．0%and 0．5%－3．9%differences in the nucleic and deduced amino acid sequences between the 2009 and 2010 strains，respectively．ConclusionsThe DENV－3 viruses from 2009 to 2010 may not come from the continuous spread of an epidemic strain or the re－emergence of the 2009 strains in the 2－year period．The introduction of different DENV－3 genotypes following more than one geographical route may be an important contributing factor during 2009－2010 dengue epidemics in Guangzhou．

Dengue;DENV－3 serotype;Molecular Biology

R181．2+4

A

10．3969/j．issn．1671－332X．2016．09．005

廣東省自然科學(xué)基金(編號:2015A030313784);傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗室項目(編號:2014SKLID308);廣東省科技計劃項目(編號:2013A020229006;2013A020229005)

梁雪瑩 景欽隆 李意蘭 曹 慶 魏躍紅 羅 雷:廣州市疾病預(yù)防控制中心 廣東廣州 510440

羅 雷