糖蛋白的研究概述

侯清娥，董建偉，王錄軍

（渭南職業(yè)技術(shù)學院，陜西渭南　714000）

糖蛋白的研究概述

侯清娥，董建偉，王錄軍

（渭南職業(yè)技術(shù)學院，陜西渭南714000）

天然糖蛋白的研究成為繼多糖之后生物活性成分研究的又一熱點，它是一類具有重要生理和藥理活性作用的功能活性成分。針對糖蛋白的結(jié)構(gòu)、提取、純化、生理功能做簡要概述，旨在建立糖蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，為改變擴展蛋白質(zhì)的生理作用設計提供新思路。

糖蛋白；分子結(jié)構(gòu)；提??；純化；生理功能

0　引言

糖蛋白為生物體內(nèi)重要生物大分子之一，廣泛存在于動植物和微生物中，甚至在單細胞有機體和病毒中也有發(fā)現(xiàn)，其以各種形式、種類分布于生物體的細胞內(nèi)外液及組織中，構(gòu)成生物體內(nèi)的多種活性物質(zhì)。糖蛋白對于生長發(fā)育、信息傳遞、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種生命活動起重要作用，同時與多種疾?。ㄈ缧难芗膊?、肝腎病、糖尿病及腫瘤癌癥等） 的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［1-2］。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，天然糖蛋白功能性質(zhì)的研究已成為國內(nèi)外熱點，并在各個領域（如生物、化學、免疫、醫(yī)學及食品等）展開深入研究。

1　糖蛋白的結(jié)構(gòu)

1.1糖蛋白的組成

糖蛋白的結(jié)構(gòu)主要包括多肽鏈和糖2部分，二者之間以共價鍵連接［3］。已知糖蛋白中的多肽鏈含有幾乎所有的氨基酸，其中含量較高的主要包括絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、天門冬酞胺（Asn）、羥脯氨酸（Hyp）及羥賴氨酸（Hyl）等幾種氨基酸。對于單糖而言，通常出現(xiàn)在糖鏈中單糖主要包括D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖等［4］。

1.2糖肽鍵

糖蛋白中連接糖鏈和多肽鏈的共價鍵稱為糖肽鍵，主要連接方式有N型連接、O型連接、糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白及C型連接4種，其中以N型和O型糖蛋白最為常見［5］。

1.3糖鏈

糖蛋白的糖鏈在多肽鏈上的分布具有十分普遍的微觀不均一性，因此糖鏈結(jié)構(gòu)具有復雜性。但在生物體內(nèi)一些不同種類糖蛋白得的N-糖肽鍵型糖鏈可包括3種類型：簡單型糖鏈（或甘露糖型糖鏈）、復雜型糖鏈、混和型（或雜種型）糖鏈，其都具有相同的五糖核心結(jié)構(gòu)［6］。

2　糖蛋白的研究方法

2.1糖蛋白的分離、純化及純度鑒定

對糖蛋白的研究，首先對生物體樣品經(jīng)過提取、分離、純化所得糖蛋白為研究對象，通過結(jié)構(gòu)均一的純度鑒定證明之后再進行進一步研究。常見的提取純化步驟為生物材料→粉碎→浸提→濃縮→沉淀→干燥→糖蛋白粗品→除雜→純化→純度鑒定。

2.1.1糖蛋白的提取

在糖蛋白提取過程中，有水提、醇提、稀鹽溶液和緩沖溶液浸提、酸堿溶液提取以及酶解法等提取法。因為糖蛋白中糖鏈具有高度親水性，可采用蒸餾水直接提取，有時提取前利用醇或醚回流將原料脫脂、脫色，然后采用水浸提，水溫可根據(jù)糖蛋白的熱穩(wěn)定性而定。所得糖蛋白提取液采用（真空式）膜分離技術(shù)進行濃縮，再通過有機溶劑或鹽析方式進行沉淀。沉淀后的樣品可采用真空冷凍或者有機溶劑等干燥方法進行干燥處理，由此獲得的糖蛋白為粗糖蛋白。

2.1.2糖蛋白的純化

糖蛋白純化有除雜和分級2個步驟。雜蛋白一般采用Sevag法除去，對于粗糖蛋白樣品中一些小分子雜質(zhì)（如色素、無機鹽和低聚糖等）可采用膜分離法、透析法、凝膠過濾法等多種方法將其除去。分級純化常用方法有凝膠柱層析法、離子交換柱層法和親和層析法，其次有沉淀法、電泳法、超濾法、超離心法等，要實現(xiàn)糖蛋白的純化需要幾種方法結(jié)合處理進行分離提取。總之，尋找確定一種適合某種樣品分級純化是一個需要進行大量試驗來研究和探索的過程。

2.1.3糖蛋白的純度鑒定

糖蛋白為大分子化合物，因其小分子種類的比例及種類的多樣性，其純度通常不能用小分子化合物的純度標準來衡量。純度鑒定方法包括超離心法、層析法、色譜法、電泳法等，通常在實際的操作中需要2種及2種以上的鑒定方法才能完成其純度鑒定。

2.2糖蛋白分子量的測定

物質(zhì)的性質(zhì)常與其結(jié)構(gòu)、分子量大小相關(guān)，因此對糖蛋白結(jié)構(gòu)及分子量的測定成為糖蛋白研究的前提。測定糖蛋白分子量的方法有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、凝膠色譜法、超濾法、高效液相色譜法，以及滲透壓法、端基法、黏度法和光散射法等。糖蛋白的分子量一般是不均一的，采用不同的測量方法所得分子量結(jié)果存在一定差異，因此在記錄糖蛋白的分子量測定值時一定要說明測定方法及其相關(guān)信息。

2.3糖蛋白中糖肽鏈的鑒定

2.3.1N-糖肽鍵的確定

N-糖肽鍵即D-GlcNAc β-Asn，又稱Ⅰ型糖肽鍵，其天冬酰胺（Asn）總出現(xiàn)在多肽鏈中的Asn-X-Thr/Ser順序中。因此，確定了糖蛋白中肽鏈的氨基酸連接順序，即可初步判定N-糖肽鍵的連接位點。采用生物酶解或化學方法釋放與天冬酰胺連接的糖鏈，特異地使N-糖肽鍵斷裂，從而證明該糖蛋白為N-糖肽鍵類型［4］。

2.3.2O-糖肽鍵的確定

O-糖肽鍵（Ⅱ型、Ⅲ型糖苷鍵） 在溫和條件下，采用稀堿水解糖蛋白，即可將與肽鏈上絲氨酸或蘇氨酸羥基相連的糖鏈或單糖水解下來。水解后，肽鏈上的絲氨酸和蘇氨酸分別轉(zhuǎn)變?yōu)榘被┧岷桶被∠┧?，而后者于紫外?40 nm處有明顯的吸收峰。因此，根據(jù)糖蛋白水解前后吸光度的變化來判定糖蛋白中O-糖肽鍵的存在情況。

3　糖蛋白的生物活性

通常糖蛋白相對分子質(zhì)量為1.5×104～1.5×106Da，其以溶解狀態(tài)或與細胞膜結(jié)合狀態(tài)廣泛存在于細胞內(nèi)外。糖蛋白作為生物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，在生物體內(nèi)起著信號的傳遞和識別、物質(zhì)的運輸、刺激生長和分裂等一系列生物活性功能［2］。

3.1糖蛋白免疫調(diào)節(jié)活性

截至目前，已發(fā)現(xiàn)許多糖蛋白具有免疫調(diào)節(jié)作用。程顯好等人［7］對蟲花菌菌絲體中糖蛋白活性研究中表明糖蛋白可增強小鼠免疫能力，具體表現(xiàn)在小鼠單核巨噬細胞吞噬能力的提高和免疫器官脾臟的明顯增重。闞健全等人［8］在甘薯中提取的糖蛋白，對其活性研究發(fā)現(xiàn)，其能促進人體免疫細胞活性的提高，同時使小鼠腹腔巨噬細胞的活力和增殖明顯增強，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。彭雪梅等人［9］采用枸杞提取分離得到糖蛋白化合物，試驗結(jié)果表明，糖蛋白不僅具有顯著的免疫增強作用，而且還具有很好抗氧化性。顧謙群等人［10］用熱水煮提和凝膠過濾層析，從櫛孔扇貝分離而得到的糖蛋白，研究表明該糖蛋白具有顯著的腫瘤抑制作用，該作用可能與小鼠免疫功能增強密切相關(guān)。

3.2糖蛋白的抗氧化活性

自由基是機體氧化反應過程中產(chǎn)生的化合物，具有強氧化性，可損害機體的細胞及組織，并與多種疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)，因此從生物活性成分來尋找無毒高效的自由基清除劑及抗氧化劑的研究成為熱點。研究發(fā)現(xiàn)，許多糖復合物都具有提高抗氧化酶、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等活性。高居易等人［11］對紅花建蓮的蓮子通過鹽析沉淀，進而采用親和層析和凝膠層析分離純化得到2種糖蛋白GLP-Ⅰ和GLP-Ⅱ，活性研究表明2種糖蛋白均有清除自由基的作用。王仲孚等人［12］從鈍頂螺旋藻中分離純化得到的糖綴合物對氧自由基及氫基自由基都有良好的清除作用。聶少平等人［13］對茶葉糖蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)其對超氧自由基及DPPH自由基有一定的清除作用。

3.3糖蛋白的降血脂、降血糖活性

高血脂是指血液中的血脂水平過高的病癥，研究表明糖蛋白具有良好的降血脂功效。于秋英等人［14］利用高血脂癥模擬小鼠的灌胃試驗，表明莼菜多糖蛋白有降低小鼠血脂功效。李亞娜等人［15］從甘薯中提取的一種所謂蛋白薯糖卵白的甘薯糖蛋白，其具有明顯的降血脂功能，并具有顯著抑制肝臟膽固醇含量升高的功效。楊立明等人［16］曾報導日本研究人員從甘薯中發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白，對人體中血液黏稠、血管阻塞以及器官老化速度等都有一定的抑制及減緩作用。劉主等人［17］研究發(fā)現(xiàn)，甘薯中的一種糖蛋白明顯降低高血糖大鼠的血糖值，并增強其胰島素的分泌功能。張琪等人［18］從小麥中獲得一種糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其對糖尿病小鼠的淀粉耐量有明顯增強作用，從而起到降低小鼠血糖的作用，其作用機制可能與多糖復合物調(diào)節(jié)小腸內(nèi)各腸段代謝酶的活性有關(guān)。

3.4糖蛋白的抗腫瘤活性

據(jù)報道，有科研人員從扇貝中分離所得幾種抗腫瘤組分最大抑瘤率達99%以上，經(jīng)鑒定其主要成分為糖蛋白，其作用機制是通過影響宿主的免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用［19］。童朝陽等人［20］從褶紋冠蚌（Cristaria plicata）中提取的相對分子質(zhì)量約為30 kDa的糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其對小鼠病瘤細胞表現(xiàn)出一定的抵抗效果，并對免疫細胞的殺傷活性有明顯增強作用。張夢杰等人［21］從陰溝腸桿菌中提取到一種糖蛋白，并對其研究表明該糖蛋白對肝、肺、腸、胃等癌細胞均有明顯殺傷作用。Sasaki T等人［22］對一些軟體動物進行研究，證明從其體內(nèi)分離的一種糖蛋白，具有顯著抑制小鼠腫瘤細胞的生長和抗白血病作用。

結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，多糖結(jié)構(gòu)的復雜性決定了其生物學活性的多樣性。糖蛋白除上述生物學活性外，還具有包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗水腫、抗輻射、止喘等其他生物活性。

4　展望

糖蛋白的性質(zhì)特殊，其價值被廣泛認可并大量研究應用。目前，主要在生化試劑、新型特種藥物和功能性食品中有相應的應用，如一些保健食品、特殊人群食品中免疫球蛋白的添加來提高人體對各種疾病的免疫力；采用基因工程應用于糖蛋白對其進行研究及改善，從而得到新型的重組產(chǎn)物?，F(xiàn)在，科學家們結(jié)合計算機軟件專業(yè)對糖鏈轉(zhuǎn)移酶和代謝酶的基因芯片攻關(guān)，建立糖蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，為擴展蛋白質(zhì)的生理作用設計提供新思路。

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Review on Glycoprotein Research Progress

HOU Qing'e，DONG Jianwei，WANG Lujun
（Weinan Vocational&Techical College，Winan，Shaanxi 714000，China）

The research on natural glycoprotein has become another spotlight after the bioactive constituents of polysaccharide. glycoprotein is a kind of functional active components which have important physiological and pharmacological activities.This article reviews the latest research on configuration，extraction purification and physiological function.In order to buildagly coprotein database，and to provide new methods on the design of protein's funcation.

glycoprotein；molecules structure；extraction；purification；physiological function

R979.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.050

2016-11-23

渭南市科技創(chuàng)新扶持資金項目（2014TCPT-7）。

侯清娥（1983— ），女，碩士，助教，研究方向為水產(chǎn)品深加工及貯藏。