生物化學綜合性實驗
——石蒜總生物堿的提取及抑菌活性的教學設(shè)計

向玉勇，殷培峰

（滁州學院，安徽 滁州 239000）

生物化學綜合性實驗
——石蒜總生物堿的提取及抑菌活性的教學設(shè)計

向玉勇，殷培峰

（滁州學院，安徽 滁州 239000）

根據(jù)應用型人才培養(yǎng)的要求，以石蒜總生物堿的提取及抑菌活性為主題設(shè)計為生物化學綜合性實驗，以激發(fā)學生的學習興趣，加強學生實踐能力的培養(yǎng)，提高人才培養(yǎng)質(zhì)量。

生物化學；綜合性實驗；石蒜；總生物堿；抑菌活性

綜合性實驗是指涉及本課程的綜合知識，或相關(guān)課程多個知識點的實驗，使學生綜合運用所學知識來設(shè)計和操作實驗，綜合訓練學生實驗技能的一種復合型實驗[1,2]。綜合性實驗主要包括教師擬定實驗題目，學生查閱文獻、設(shè)計實驗方案、獨立完成實驗操作并根據(jù)實驗結(jié)果撰寫實驗論文，教師總結(jié)和評定實驗結(jié)果等環(huán)節(jié)[3,4]。其目的主要是培養(yǎng)學生查閱文獻的能力、實驗操作能力、數(shù)據(jù)處理能力、綜合分析能力以及解決實際問題的能力[5，6]。綜合性實驗具有綜合性和探索性的特點，能啟發(fā)學生思維，激發(fā)學生創(chuàng)造力，是培養(yǎng)高素質(zhì)應用型人才的有力措施[7-,9]。生物化學實驗是生物科學專業(yè)學生必修的專業(yè)基礎(chǔ)課之一，在傳統(tǒng)實驗教學模式影響下，許多地方高校開設(shè)的生物化學實驗大多是一些內(nèi)容單一的驗證性實驗。整個實驗過程都是老師先講解實驗原理和方法，學生按照實驗指導書上的步驟依次進行實驗，學生沒有自主設(shè)計實驗方案和獨立操作的機會。結(jié)果是學生的主動性和創(chuàng)造性得不到發(fā)揮，不利于對知識整體性和系統(tǒng)化地把握，阻礙了實踐能力的培養(yǎng)。為了彌補傳統(tǒng)實驗教學內(nèi)容的不足，提高生物化學實驗教學質(zhì)量，增強學生的實踐能力，設(shè)計一些完善的綜合性實驗是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。

石蒜[Lycoris radiate(L.Herit.)Herb]為石蒜科石蒜屬多年生草本植物，別名又稱老鴉蒜、獨蒜、蟑螂花、龍爪花，在我國分布于安徽、山東、河南、廣東、廣西、江蘇、浙江、江西等省，多生于山地陰濕處、林緣、路旁或溪谷溝邊、石縫之間[10]。石蒜中含有多種活性成分，其中的生物堿不但具有抗癌、抗菌、抗炎等作用，還能抑制膽堿酯酶和興奮神經(jīng)肌肉，可以用來治療心血管疾病及老年癡呆癥[11]，具有良好的開發(fā)利用前景。針對生物化學實驗教學中存在的實際問題，筆者進行了改革和創(chuàng)新，設(shè)計了一個綜合性的生物化學實驗——石蒜總生物堿的提取及抑菌活性，以激發(fā)學生的學習興趣，使學生掌握相關(guān)的實驗操作技能，培養(yǎng)他們的科研思路和創(chuàng)新意識，從而達到更好的教學效果。

一、實驗原理

根據(jù)大多數(shù)生物堿或生物堿鹽能溶于乙醇的通性，以乙醇做溶劑，采用熱水回流法可以從植物中提取總生物堿。超聲波輔助乙醇熱水回流可以增加溶劑穿透力，縮短提取時間，提高生物堿的溶出速度和提取率。本實驗利用超聲波輔助乙醇熱水回流提取石蒜總生物堿，采用抑菌圈法測定總生物堿對大腸桿菌Escherichia col i）、枯草芽胞桿菌(Bacil lus subt ilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、巨大芽胞桿菌(Bacil lus magaterium)的抑菌活性，為石蒜的開發(fā)利用提供評價依據(jù)。

二、實驗材料與設(shè)備

（一）實驗材料

石蒜([L.radiate(L.Her it.)Herb])、大腸桿菌(E.col i)、枯草芽孢桿菌(B.subti l is)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、巨大芽孢桿菌(B.magater ium)。

（二）試劑

95%乙醇、石油醚、氯仿、碘—碘化鉀試劑、濃氨水、2%鹽酸

（三）設(shè)備

精密烘箱、生化培養(yǎng)箱、高速萬能粉碎機、超聲波細胞破碎儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵、數(shù)顯恒溫水浴鍋、立式壓力蒸汽滅菌鍋、單人單面垂直凈化工作臺、電子天平。

三、實驗內(nèi)容

（一）石蒜總生物堿的提取

采用超聲波輔助乙醇熱水回流提取法[12]。將石蒜鱗莖洗干凈，經(jīng)烘箱（60℃）烘干后用粉碎機粉碎，過60目篩，制成干粉。稱取干粉30g放于燒瓶中，加入95%乙醇600mL，用超聲波處理15min，80℃熱水回流2h，過濾后濾渣再重復提取1次，合并所得的淡黃色濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至膏狀物，再用2%鹽酸溶解，石油醚脫脂，pH值用濃氨水調(diào)至8～9，然后加氯仿萃取數(shù)次，用碘—碘化鉀試劑檢驗至無生物堿反應為止。將氯仿蒸去，所得粘稠浸膏經(jīng)45℃烘干，得到白色粉末即為總生物堿。稱重后，用無菌水配制成0.1g/mL的溶液，放入冰箱中低溫保存，待用。

（二）抑菌實驗

1、菌懸液的制備

在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少量已活化的待測菌株于潔凈試管中，加入無菌水充分混勻，制備成各種菌懸液。

2、抑菌活性測定

吸取各種菌懸液0.2ml滴加于已經(jīng)制備好的培養(yǎng)基上，用滅菌的涂布玻璃棒將菌懸液涂布均勻。將滅菌的濾紙片（Φ=6mm）分別浸入配制好的生物堿溶液中，取出后在無菌條件下晾干。再將浸過生物堿提取液的濾紙片，間隔一定距離貼在含菌平板上（3片/皿），輕壓濾紙片使其與培養(yǎng)基接觸良好，以浸有蒸餾水的濾紙片作對照，每個處理重復3次。然后將培養(yǎng)皿倒翻，置于37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用十字交叉法測定抑菌圈的直徑。

四、驗安排

（一）實驗準備

本實驗需將學生分成5人一個小組，指導老師提前2周發(fā)布實驗題目，通知給學生上網(wǎng)查閱文獻資料、設(shè)計實驗方案。實驗方案經(jīng)審閱和修改后予以實施。

（二）實驗過程

本實驗可以安排在小學期中進行，實驗室全天開放，實驗教師和實驗員加強實驗過程的指導和管理。實驗所需的材料、試劑和設(shè)備的準備等均由學生自己動手完成，實驗過程中要對每一步進行詳細的記錄。實驗教師必須指導學生對實驗中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象進行分析并提出相應的解決辦法。

（三）實驗結(jié)果評價

實驗結(jié)束后，各小組分別匯報自己的實驗情況，包括實驗方案、實驗結(jié)果、遇到的問題和解決方法等。然后，按照科技論文的要求撰寫研究報告，應包括實驗材料、實驗方法、實驗結(jié)果、存在的問題分析與討論，以及進一步的改進措施等方面內(nèi)容，訓練學生的科研技能。最后，教師要從以下幾個方面客觀公正地評定每個小組的實驗成績，如平時成績30分（實驗態(tài)度10分、出勤20分）、實驗技能30分(實驗設(shè)計15分，實驗操作15分)、實驗結(jié)果及創(chuàng)新占40分（解答問題10分，探索能力10分，研究報告20分）。

五、實驗特點及教學效果

本實驗利用超聲波輔助乙醇熱水回流提取石蒜總生物堿，采用抑菌圈法測定總生物堿對大腸桿菌(E.col i)、枯草芽孢桿菌(B.subtil is)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、巨大芽孢桿菌(B.magaterium)的抑菌活性，涉及總生物堿的提取及純化、減壓濃縮、高壓滅菌、培養(yǎng)基制備、細菌培養(yǎng)等多個生物化學實驗技術(shù)。要求學生不但要有扎實的生物化學基礎(chǔ)理論知識,而且還應具備烘箱、超聲波細胞破碎儀、恒溫顯數(shù)水浴鍋、超凈工作臺、滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、生化培養(yǎng)箱等設(shè)備的操作技能。該實驗內(nèi)容將生物化學基礎(chǔ)理論知識與技能訓練相結(jié)合，促使學生把握基礎(chǔ)理論知識，訓練學生對多學科知識綜合運用的能力。在實驗開展前，老師提出具體的實驗目的和研究目標，學生獨立查閱資料，設(shè)計實驗方案。讓學生自主完成整個實驗過程，老師輔以適當?shù)闹笇В浞煮w現(xiàn)了學生的主體地位，能調(diào)動學生上實驗課的積極性，使學生在有限的時間內(nèi)掌握更多的理論知識和實驗技術(shù)。通過對生物科學專業(yè)2012、2013、2014級學生進行該項綜合性實驗教學，極大地激發(fā)了學生的科研熱情，增強了主觀能動性，提高了動手能力，全面訓練了學生的實驗技能，提高了學生的實踐創(chuàng)新能力。

總之，綜合性實驗能把生物化學的相關(guān)知識點貫聯(lián)起來，使實驗內(nèi)容具有系統(tǒng)性，可給學生一個連貫的、有機組合的實驗技能訓練，是培養(yǎng)學生的科研創(chuàng)新能力、激發(fā)學生學習興趣、全面提高綜合素質(zhì)的有效實驗教學模式。在生物化學實驗教學中開設(shè)石蒜總生物堿的提取及抑菌活性這一綜合性實驗，符合培養(yǎng)應用型人才的要求，通過該實驗教學可以真正提高人才培養(yǎng)質(zhì)量。

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Q503

A

1671-5993（2016）03-0059-03

2016-05-01

安徽省高等學校省級教學研究項目（2015jyxm360）；滁州學院教學研究重點項目（2015jyz006）；滁州學院專業(yè)綜合改革試點項目（2013zysd02）。

向玉勇（1974—），男，湖南麻城人，博士，副教授，從事生物化學教學與研究。