急性髓系白血病FLT3基因突變研究進(jìn)展*

楊金榮 綜述,曾　云△，于　明 審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科/云南省血液病研究中心，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500)

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急性髓系白血病FLT3基因突變研究進(jìn)展*

楊金榮1綜述,曾云1△，于明2審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科/云南省血液病研究中心，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500)

[關(guān)鍵詞]急性髓系白血病；酪氨酸激酶；內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列；酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是由髓系造血干/祖細(xì)胞起源的一組在臨床及遺傳學(xué)上均有高度異質(zhì)性的克隆性疾病，是成人急性白血病的主要類型，分類復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要包括染色體易位或缺失、原癌基因及抑癌基因突變等，但其獨(dú)特的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)改變是分類的基礎(chǔ),對疾病診斷、預(yù)后分層、微小殘留病灶監(jiān)測，以及靶向治療的開發(fā)等具有極為重要的意義。近年來人們在AML中發(fā)現(xiàn)了越來越多的分子異常，例如NPM1、FLT3的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列(FLT3-ITD)、C-KIT等基因突變，在AML的分層治療中具有重要意義[1]，而FLT3/ITD是AML中最常見基因突變之一，該突變在AML發(fā)病機(jī)制中起驅(qū)動作用[2]，是提示預(yù)后不良的標(biāo)志[3]，動態(tài)檢測AML患者治療前后Fms樣酪氨酸激酶-3(FLT3)表達(dá)水平，可作為判斷AML預(yù)后和監(jiān)測微小殘留病灶的一項(xiàng)指標(biāo)。目前，在FLT3-ITD陽性AML患者治療方面，化療和自體干細(xì)胞移植的療效均不理想，異基因造血干細(xì)胞移植的療效尚存在爭議，靶向治療越來越受到人們的關(guān)注，也取得了一定療效，然而隨著耐藥的出現(xiàn)，克服耐藥的靶向藥物治療是人們面臨的一大挑戰(zhàn)，是治療FLT3-ITD陽性的AML患者的新方向?，F(xiàn)簡要綜述AML中FLT3基因突變的臨床意義、檢測方法及治療的最新研究進(jìn)展。

1FLT3基因結(jié)構(gòu)與功能

FLT3是Ⅲ型受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase Ⅲ,RTK Ⅲ)家族成員之一,FLT3基因位于第13號染色體長臂(13q12),全長約為100 kb，包括24個(gè)外顯子，其中有16個(gè)外顯子與c-kit具有高度保守性。FLT3蛋白結(jié)構(gòu)包括5個(gè)免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)，1個(gè)近膜區(qū)結(jié)構(gòu)域(JM)及胞內(nèi)由激酶插入?yún)^(qū)分隔而成的兩個(gè)酪氨酸激酶(TK1/TK2)區(qū)和1個(gè)C-末端結(jié)構(gòu)域。有關(guān)研究表明,JM結(jié)構(gòu)域?qū)S持激酶催化中心空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起主要作用，對激酶活性有負(fù)調(diào)控作用。FLT3優(yōu)先表達(dá)于定向造血干細(xì)胞的細(xì)胞表面,在正常造血及免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用,其配體(FL)可以作為一種膜復(fù)合物或者可溶的形式表達(dá)在骨髓基質(zhì)細(xì)胞上。FLT3結(jié)合FL后相互作用能導(dǎo)致受體形成二聚體、自身磷酸化及細(xì)胞基質(zhì)的磷酸化，激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖和分化。

2FLT3突變

2.1FLT3突變形式及致病機(jī)制1996年Nakao等首次報(bào)道AML患者FLT3的近膜區(qū)存在串聯(lián)重復(fù)突變，隨后多項(xiàng)研究報(bào)道，F(xiàn)LT3基因突變還存在累及酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(FLT3 tyrosine kinase domain，F(xiàn)LT3-TKD)的點(diǎn)突變。在AML患者中，F(xiàn)LT3-ITD和FLT3-TKD這2種突變類型可同時(shí)或單獨(dú)存在，且兩種突變均可活化FLT3酪氨酸激酶。

FLT3-ITD突變指近膜結(jié)構(gòu)域插入氨基酸重復(fù)串聯(lián)序列，通常發(fā)生在近膜區(qū)的精氨酸殘基595附近。受體酪氨酸激酶(RTK)的近膜區(qū)有自身抑制的作用，氨基酸重復(fù)串聯(lián)序列異常插入激酶結(jié)構(gòu)域可導(dǎo)致FLT3在無配體結(jié)合的情況下發(fā)生二聚體化并持續(xù)自我磷酸化，且FLT3-ITD與野生型FLT3形成二聚體，引起非依賴配體的磷酸化，酪氨酸激酶活性增強(qiáng)，并激活STAT5、RAS/MAPK和PI3K/AKT下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制C/EBPα和PU.1，轉(zhuǎn)化生長因子依賴性細(xì)胞為生長因子非依賴性細(xì)胞，賦予細(xì)胞增殖和(或)存活優(yōu)勢[4]，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化并導(dǎo)致AML疾病的復(fù)發(fā)和難治[5]。

FLT3-TKD即為酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的激活中個(gè)別氨基酸的缺失或插入，主要突變類型為FLT3/D835和FLT3/I836，其突變位點(diǎn)都位于組成型激活環(huán)上，可以自身抑制ATP、底物和激酶活性中心的結(jié)合，改變了激活環(huán)的構(gòu)象空間，導(dǎo)致激酶過度活化。此外還有較少見的氨基酸殘突變，雖對預(yù)后影響不大，但對應(yīng)用FLT3激酶抑制劑的治療非常重要，因?yàn)槎鄶?shù)FLT3抑制劑對點(diǎn)突變類型無效或活性較低，目前TKD突變與FLT3抑制劑耐藥的相關(guān)性已引起研究者的關(guān)注。

2.2FLT3基因突變在AML中的臨床特征目前研究顯示，F(xiàn)LT3-ITD在成人AML中突變率為15%～30%[3-4，6]，而在CN-AML中突變頻率為31%～45%[7-8]。在FAB分型中，F(xiàn)LT3-ITD突變在M3中陽性率最高，M5次之，M2、M6、M7的陽性率較低。FLT3-ITD突變常與其他特殊的細(xì)胞遺傳學(xué)改變或基因的變異有關(guān)聯(lián),FLT3-ITD突變在伴有t(15；17)染色體異常的患者中發(fā)生率高，尤其是在同時(shí)伴有PML/RARa且mRNA縮短的M3變異型中，相關(guān)研究表明，與FLT3/WT的M3相比伴有FLT3-ITD突變M3患者外周雪白細(xì)胞計(jì)數(shù)高，但其完全緩解(CR)率、DFS、OS仍尚有爭議，有待進(jìn)一步研究。在伴t(6；9)易位的患者FLT3-ITD可高達(dá)90%[3],而伴t(8；21)易位或inv(16)的患者FLT3突變率較低，在預(yù)后較差的復(fù)雜核型和11q23，t(3；3)，t(9；22)，-5/del(5q)，-7/del(7q)中FLT3突變率也低[7]。另外，F(xiàn)LT3-ITD突變的AML患者還通常具有外周血WBC及骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)高、預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高和生存率低等獨(dú)特的臨床特征。

FLT3-TKD基因突變在AML患者中突變率為5%～10%[3-5]，而在CN-AML和伴有inv(16)/t(16；16)的AML患者中突變率分別約為12%和24%[8]，罕見于預(yù)后不良的復(fù)雜核型。與FLT3-ITD相比較，TKD點(diǎn)突變無明顯的高白細(xì)胞等臨床特征。

2.3FLT3對AML預(yù)后的影響一系列研究已證明，F(xiàn)LT3-ITD是AML獨(dú)立的預(yù)后因素。FLT3-ITD陽性的AML患者化療后CR率低、疾病復(fù)發(fā)(RR)率高、總體生存期短、預(yù)后差[9]。目前，許多研究將FLT3-ITD突變特點(diǎn)分析得越來越細(xì)，主要包括突變序列長度、突變序列數(shù)目、突變序列插入位置以及突變等位基因含量，并將這些突變特點(diǎn)與預(yù)后相聯(lián)系。Meshinchi等[10]研究提示，F(xiàn)LT3-ITD的長度是獨(dú)立的預(yù)后不良因素，較長的ITD序列更易改變原激酶構(gòu)象的自穩(wěn)狀態(tài)，影響其對治療的反應(yīng)。Kayser等[11]研究表明，非近膜區(qū)比近膜區(qū)FLT3/ITD突變的患者預(yù)后差，F(xiàn)LT3-ITD出現(xiàn)在TKD1的B1折疊區(qū)與低CR率有關(guān)。近年來定量PCR研究[12-13]表明，AML患者中突變等位基因含量與預(yù)后密切相關(guān)，其預(yù)后不良程度與突變基因/野生型基因比例呈正相關(guān)，RR、DFS和OS隨其升高均有惡化趨勢，F(xiàn)LT3/WT的缺失的FLT3突變患者預(yù)后更差，且高突變比例的AML患者中白細(xì)胞升高更加突出。研究還顯示，AML患者的FLT3基因突變的拷貝量在診斷和復(fù)發(fā)時(shí)不同，高拷貝量的FLT3-ITD預(yù)測價(jià)值更大，提示預(yù)后更差。因此，動態(tài)監(jiān)測AML患者治療前后FLT3表達(dá)水平，可作為判斷AML預(yù)后和監(jiān)測微小殘留病灶的一項(xiàng)指標(biāo)。

TKD點(diǎn)突變是繼ITD突變之后在AML患者中發(fā)現(xiàn)的FLT3基因的另一種突變形式，與AML患者預(yù)后的關(guān)系目前還存在爭議。目前研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)FLT3激酶抑制劑(TKI)對FLT3-ITD陽性的AML患者有效，而對有FLT3-TKD突變的AML患者，其有效性也隨TKD突變的多樣性呈現(xiàn)多變性。Leung等[14]研究表明,FLT3-ITD與TKD雙突變可能微量的存在FLT3抑制劑使用之前，在TKI選擇性抑制FLT3-ITD后,TKD克隆逐漸成為主導(dǎo)地位而產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致不良預(yù)后。

3FLT3基因突變的檢測

2010年美國血液學(xué)會(American Society of Hematology)會議已明確提出FLT3-ITD基因突變檢測可用于早期診斷難治復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后[15]。目前，F(xiàn)LT3-ITD突變檢測已逐漸成為AML患者的常規(guī)檢測項(xiàng)目。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[3，16]，F(xiàn)LT3-ITD突變的重復(fù)片段為3～400堿基不等。經(jīng)典的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法不足以分辨小于3個(gè)堿基的FLT3基因突變，直接測序法是檢測FLT3突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但過程繁瑣，耗時(shí)較長，敏感性有限(約為20%～30%)。下面介紹幾種目前最新的檢測方法。

3.1聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染分析法PAGE法檢測突變所依靠的是不同核酸分子的序列結(jié)構(gòu)和長度差異，導(dǎo)致其在PAGE凝膠電泳中移動的速度不同。突變的雙鏈核酸分子長度比未突變的雙鏈核酸分子要長，在PAGE凝膠電泳中移動得慢，從而將突變檢出。尤其變性PAGE在變性尿素作用下雙鏈DNA變成單鏈，單鏈的電泳遷移率只由DNA長度決定，分辨率非常高，可達(dá)2 bp，常用于分離小于500 bp的DNA片段。PAGE操作相對簡單，結(jié)果敏感可靠且成本低[17],采用銀染法顯色靈敏度高，可在基層醫(yī)院開展初步篩查。但PAGE銀染法結(jié)果受試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等因素影響較大，易出現(xiàn)檢測失敗、漏檢等情況[18]。

3.2毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)法CE主要是根據(jù)單鏈DNA片段空間構(gòu)象及所帶電荷不同來檢測突變。單鏈DNA片段的空間折疊構(gòu)象復(fù)雜，主要由堿基相互作用力來維持，堿基發(fā)生改變時(shí)，將影響其空間構(gòu)象，不同構(gòu)象分子的表面所帶電荷不同，從而可將突變與正常單鏈DNA區(qū)分開來。Lu等[18]報(bào)道CE檢測無需凝膠，樣品用量小，幾乎不消耗溶劑，高效敏感且圖像清晰，可區(qū)分1 bp的差異，操作簡單且結(jié)果可靠，也可用于定量檢測。CE檢測還可同時(shí)檢測多重PCR產(chǎn)物，保證其準(zhǔn)確性的同時(shí)可提高FLT3-ITD突變的檢出率。但其引物探針及CE儀器價(jià)格昂貴，在國內(nèi)基層醫(yī)院難以開展。

3.3微芯片電泳(microchip electrophoresis，ME)法ME的工作原理是突變的DNA片段空間構(gòu)象及所帶電荷不同，DNA分子在電場里泳動，荷正電的向負(fù)極運(yùn)動，荷負(fù)電的向正極運(yùn)動，經(jīng)過一定時(shí)間的電泳，不同電荷的DNA分子被分開。其優(yōu)勢是微量、自動化，可采用熒光檢測器檢出。PCR-微芯片電泳可作為FLT3基因突變篩查的簡便方法，但作為新的檢測手段，其技術(shù)還未成熟，準(zhǔn)確度有待于改進(jìn)[19]。

3.4變性高效液相色譜技術(shù)(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)相對定量檢測DHPLC相對定量檢測方法是基于異源雙鏈的形成，根據(jù)PCR產(chǎn)物變性復(fù)性后，形成了同源雙鏈和異源雙鏈，而異源雙鏈由于堿基對不匹配，會在部分變性的溫度條件下形成部分解鏈。由于單鏈DNA帶負(fù)電荷減少，結(jié)合力弱，異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來，可將同源雙鏈和異源雙鏈分離。因此，就可分離檢測出由于ITD的插入而引起的FLT3基因長度多態(tài)性，可通過洗脫峰的面積計(jì)算進(jìn)行定量分析。該技術(shù)方法穩(wěn)定可靠、快速、準(zhǔn)確，且具有高通量、高重復(fù)性、成本低、步驟簡單等的特點(diǎn)。但突變等位基因含量極高時(shí)該法不如CE精確[16]。

4FLT3-ITD陽性的AML治療進(jìn)展

4.1FLT3基因突變的AML患者骨髓移植在治療FLT3-ITD陽性AML患者方面，化療和自體干細(xì)胞移植的效果均不理想，復(fù)發(fā)后再次誘導(dǎo)緩解時(shí)間長，緩解率低。為改善這組患者的預(yù)后，迫切需要新的治療方案，而異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是否改變FLT3-ITD陽性的AML患者的預(yù)后仍有爭議。成人AML(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南(2011年版)中指出首次緩解后行allo-HSCT可作為該類患者一線治療，可以提高該類患者的臨床療效[20]。但多個(gè)單中心的回顧性研究比較了FLT3-ITD陽性及FLT3-ITD陰性患者行allo-HSCT的療效，發(fā)現(xiàn)allo-HSCT并不能完全改變FLT3-ITD陽性患者的不良預(yù)后[21-23]。而Lin等[24]也研究報(bào)道了，行allo-HSCT改善了FLT3-ITD陽性AML患者的預(yù)后，與未行allo-HSCT的FLT3-ITD陽性AML患者相比提高了無復(fù)發(fā)生存率，但與FLT3-ITD陰性AML患者相比仍有較高的復(fù)發(fā)率。

4.2FLT3基因突變的靶向治療目前靶向藥物治療作為一種新的研究方向已引起了臨床工作者的關(guān)注，針對AML的靶向藥物多數(shù)是FLT3酪氨酸激酶抑制劑(TKI)。目前將TKI分為兩型：Ⅰ型和Ⅱ型抑制劑，Ⅰ型抑制劑可以結(jié)合未激活或激活的受體酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)形式,而Ⅱ型抑制劑只結(jié)合未激活FLT3[25]。無論是Ⅰ型或Ⅱ型抑制劑,都可以抑制FLT3的下游信號關(guān)鍵通路促進(jìn)白血病細(xì)胞的分化和凋亡。迄今為止,大多數(shù)FLT3 TKI研究主要是Ⅱ型屬性,如Sorafenib(索拉非尼)、midostaurin(PCK412)、quizartinib(AC220)、lestaurtinib (CEP701)等,均可較強(qiáng)的抑制FLT3-ITD,但對FLT3-TKD、FLT3-ITD/TKD作用較小或無效，且在FLT3 TKI的臨床試驗(yàn)中，已出現(xiàn)對FLT3 TKI耐藥的病例,嚴(yán)重影響了FLT3 TKI的推廣使用[2]。進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制發(fā)現(xiàn)，其耐藥因素可能是以下幾點(diǎn)：(1)受體內(nèi)部機(jī)制，F(xiàn)LT3 TKI可誘導(dǎo)如D835和F691L等點(diǎn)突變，F(xiàn)LT3 TKI強(qiáng)效的抑制FLT3-ITD，使FLT3-TKD的克隆逐漸凸顯出來而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。這一點(diǎn)在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均被證實(shí)[26]。且不同的FLT3 TKI誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥突變位點(diǎn)往往不同，如AC220和PKC412使用后出現(xiàn)F691、N676、D835而產(chǎn)生耐藥[2]。(2)骨髓的微環(huán)境的保護(hù)，有關(guān)研究表明[27],部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)白血病細(xì)胞AKT、ERK和STAT3信號通路并持續(xù)激活及增強(qiáng)FL的表達(dá),導(dǎo)致白血病細(xì)胞的長期生存和發(fā)展。且骨髓微環(huán)境也可減少體內(nèi)對藥物的敏感性,也可減弱PKC412和CEP701在抑制FLT3自身磷酸化的作用。(3)高水平的FLT3配體(FL)，近期的研究[28]顯示，化療如阿糖胞苷誘導(dǎo)治療后血漿中FL的濃度顯著增高，可減弱FLT3 TKI的功效也是導(dǎo)致FLT3 TKI耐藥的重要因素之一。

目前克服耐藥成為FLT3 TKI新的挑戰(zhàn),新一代應(yīng)用前景較好的FLT3 TKI藥物如：Crenolanib[25]、G-749[29]、TTT-3002[30]可強(qiáng)有力的抑制AML患者幼稚細(xì)胞FLT3-ITD、FLT3-TKD、FLT3-ITD/TKD突變包括TKI耐藥基因(如：FLT3-D835H/Y、FLT3-ITD/F691L)，即使在復(fù)雜的骨髓微環(huán)境下，仍表現(xiàn)很強(qiáng)的抗白血病活性，但不影響正常的骨髓細(xì)胞。這使他們成為有前途新一代候選藥物，但能否納入一線治療AML伴FLT3-ITD突變和(或)FLT3-TKD突變及治療后出現(xiàn)點(diǎn)突變的患者仍需進(jìn)一步研究。也有證據(jù)表明，單個(gè)FLT3抑制劑治療維持時(shí)間短或部分有效，阻礙了FLT3-TKIs治療[2]。因此,聯(lián)合Ⅰ類型和Ⅱ類型TKI治療FLT3陽性的AML患者可能是克服耐藥，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高療效的新選擇。

5小結(jié)與展望

FLT3基因突變是AML患者常見的分子突變類型，在AML患者發(fā)病過程中可能起著十分重要的作用，而且與患者的治療、預(yù)后密切相關(guān)。FLT3突變已逐漸成為AML患者的常規(guī)檢測項(xiàng)目，其主要檢測方法有PCR產(chǎn)物直接測序法、毛細(xì)管電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法及多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳等，尋找到一種簡便、低成本的檢測方法，以便在基層醫(yī)院開展篩查，提高檢出率，有效評估患者的病情，更有針對性的治療，提高療效。目前FLT3突變的AML患者對常規(guī)化療不敏感，allo-HSCT療效尚有爭議。因此，有效的靶向藥物治療成為臨床治療的新方向，對改善AML患者的治療、預(yù)后有深遠(yuǎn)意義。

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doi:·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.035

* 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40110012)；云南省聯(lián)合專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2013FB122；2014FB027)；云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014NS167)。

作者簡介：楊金榮(1986-)，碩士在讀，主要從事血液系統(tǒng)疾病的研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：zengyun_fyy@sina.com.cn。

[中圖分類號]R733.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1104-04

(收稿日期：2015-09-17修回日期：2015-11-22)