黃芪注射液通過調(diào)節(jié)JNK和NF-κB通路抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡*

谷新怡，周 劍，閆曉玲，蘇 艷，吳魯華，趙朋波，劉昕妍

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078; 3.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

黃芪注射液通過調(diào)節(jié)JNK和NF-κB通路抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡*

谷新怡1，周 劍2△，閆曉玲2，蘇 艷2，吳魯華3，趙朋波1，劉昕妍1

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078; 3.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

目的:觀察黃芪注射液對視神經(jīng)牽拉傷大鼠視神經(jīng)保護作用并探討其作用機制。方法:將66只SPF級健康Wistar雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、視神經(jīng)牽拉傷模型組及黃芪注射液治療組3組各22只大鼠;橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，假手術(shù)組僅暴露視神經(jīng)不予牽拉;術(shù)后治療組給予黃芪注射液腹腔注射，模型組給予生理鹽水腹腔注射;治療14 d后取大鼠視網(wǎng)膜組織，利用蛋白免疫印跡法檢測JNK和NF-κB表達變化，并采用real time-PCR方法檢測p75NTR的mRNA水平。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)牽拉傷模型大鼠視網(wǎng)膜組織p75NTR mRNA水平及JNK蛋白表達明顯上升，NF-κB蛋白表達顯著下降;給藥14 d后與模型組比較，黃芪注射液治療組大鼠視網(wǎng)膜組織p75NTR mRNA水平及JNK蛋白表達顯著減少，NF-κB蛋白表達明顯升高。結(jié)論:黃芪注射液具有視神經(jīng)保護作用，其機制可能與抑制p75NTR mRNA的表達及JNK蛋白水平、促進NF-κB的蛋白表達有關(guān)。

視神經(jīng)損傷;黃芪;p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體;c-Jun氨基末端激酶;核因子κB

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)是視網(wǎng)膜的第三級神經(jīng)元，其軸突匯集成視神經(jīng)，將視覺信號輸入大腦，在視覺通路中起重要傳導作用;視神經(jīng)損傷后RGCs數(shù)目進行性減少，是導致視功能不可逆性損害的組織病理學基礎(chǔ)。在神經(jīng)元凋亡過程中，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-termianl kinase，JNK)和核因子 кB(nuclear factorkappaB，NF-кB)的表達起至關(guān)重要的作用。黃芪注射液是由中藥黃芪提取精煉而成，現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有抗氧化、清除氧自由基、保護神經(jīng)細胞等作用，近年來在視神經(jīng)保護研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。本課題組前期實驗證實［1］，黃芪注射液對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡有抑制作用，但是通過哪條信號傳導通路發(fā)揮抑制凋亡作用目前尚不清楚。本研究通過觀察黃芪注射液對視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡相關(guān)蛋白JNK及 NF-кB表達的影響，探討黃芪注射液抑制細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

1.1.1 動物與分組 選擇健康SPF級成年雄性Wistar大鼠66只，體質(zhì)量(220±20)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。行外眼及眼底檢查，無眼疾者納入實驗，實驗期間于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗中心飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，室內(nèi)通風干燥。按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組22只，模型組即視神經(jīng)牽拉傷+生理鹽水組22只及黃芪治療組即視神經(jīng)牽拉傷+黃芪注射液組22只。假手術(shù)組僅暴露視神經(jīng)，不予牽拉，不予任何藥物，模型組和治療組均選取左眼制作視神經(jīng)損傷模型，右眼為正常對照。

1.1.2 藥物及主要試劑 黃芪注射液購自杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司(批準文號國藥準字Z33020179)。RNAisoTMPlus提取試劑(D9108A)、SYBR Premix Taq II(2×)(DRR081S)購自TaKaRa; ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (FSK-100)購自TOYOBO公司;兔抗JNK抗體(9258S)、小鼠抗NF-кB 抗 體 (6956S)均 購 自 美 國 CellSignaling Technology公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記 anti-Rabbit抗體(ZB-2301)購自北京中杉金橋;辣根過氧化物酶(HRP)標記anti-Mouse抗體(7076S)購自Cell Signaling Technology公司;RI-PA 裂解液(R0010)、BCA法蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)及ECL超敏發(fā)光液(PE0010)均購自北京索萊寶科技有限公司。普通PCR儀器(型號MG96+)為杭州朗基科學儀器有限公司產(chǎn)品，熒光 PCR儀(型號ABI7500)為美國ABI公司產(chǎn)品，SDS-PAGE電泳設(shè)備均為美國BioRad公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型復制 采用橫向定量牽拉法制作視神經(jīng)損傷模型大鼠［2-3］:術(shù)前直接檢眼鏡查大鼠眼底視網(wǎng)膜及血管無異常。2%戊巴比妥(按100 mg/kg大鼠體質(zhì)量)腹腔注射全身麻醉動物，大鼠俯臥位，沿大鼠左眼顳側(cè)眶緣剪開皮膚長約1 cm，摘除部分眶脂肪，剪斷(亦可保留)上直肌和外直肌，向眶尖部鈍性分離并暴露視神經(jīng)，采用6-0聚酯縫合線在球后1～2 mm處圈住視神經(jīng)并打結(jié)(圈長等于視神經(jīng)橫截面周長，注意不能拉緊)，縫線另一頭連接壓力張力計(最小刻度0.01 N)，以0.10 N拉力垂直于視神經(jīng)水平牽拉并持續(xù)20 s。牽拉完成后立即觀察，如大鼠術(shù)眼瞳孔散大、直接對光反射消失、間接對光反射存在、眼底視網(wǎng)膜無血管閉塞、視網(wǎng)膜蒼白缺血不超過5 min予以納入，否則予以淘汰。術(shù)后縫合傷口，常規(guī)抗炎，回籠飼養(yǎng)。造模后第2天開始分組腹腔注射藥物進行干預。

1.2.2 給藥方法 治療組于造模成功后1 d開始給予黃芪注射液腹腔注射0.5 ml/d×14 d，模型組于造模成功后1 d開始給予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射0.5 ml/d×14 d。

1.2.3 取材 假手術(shù)組、模型組及黃芪治療組均于造模后第15天取材。10%水合氯醛過量麻醉處死大鼠，剪開瞼裂，完整摘取雙眼眼球置于冰上操作，沿角膜緣剪開去除晶體和玻璃體，小心剝離視網(wǎng)膜置于凍存管中，立即投入液氮中保存。

1.2.4 指標檢測

①Western blot檢測視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織JNK、NF-кB蛋白表達:取視網(wǎng)膜組織，每4個視網(wǎng)膜為1個樣本(約40 mg)，采用冰浴超聲裂解組織，BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣50 μg進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，10%脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜(anti-JNK 1∶1000稀釋，anti-NF-кB 1∶1000稀釋，anti-GAPDH 1∶2000稀釋)，辣根酶標記二抗(1∶3000稀釋)，ECL發(fā)光液顯影、曝光并拍照。條帶灰度值分析采用Alpha View軟件測定，計算目標蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。②Real-time PCR檢測神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織p75NTR mRNA表達:取視網(wǎng)膜組織，采用 RNAisoTMPlus提取試劑抽提各組總RNA，按照ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。GenBanK上查找相關(guān)的基因序列，特異性引物由life technologies公司設(shè)計合成。P75NTR上游引物:5’-CCACCAGAGGGAGAGAAAC TG-3’，下游引物:5’-CCAGGTGTCACCATTGAGC AG-3’，擴增目標:186 bp。beta-actin上游引物:5’-CTTCCTTCTTGGGTA TGGAATCC-3’，下游引物:5’-GGAGCAATGATC TTGATCTTCATG-3’，擴增目標: 205 bp。實時定量 PCR反應(yīng)條件:預變性94℃ 10 min，94℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 15s，80℃ 30 s，循環(huán)40次，讀取 Ct(cycle threshold)值，首先分別計算各樣本目的基因p75NTR與內(nèi)參beta-actin Ct的差值，即△Ct=Ct(p75NTR)－Ct(beta-actin)，再用各處理樣本的△Ct減去對照組的△Ct，得到△△Ct，即［Ct (處理組目的基因)－Ct(處理組內(nèi)參基因)］－［Ct (對照組目的基因)－Ct(對照組內(nèi)參基因)］，利用2－△△Ct進行計算［4］，表示實驗組測定基因 p75NTR的表達相對于正常對照組樣本 p75NTR表達的變化倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊采用單因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)，組間比較用 LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠視網(wǎng)膜組織JNK蛋白表達的影響

鑒于以上我區(qū)的水果包裝中存在的問題來看，未來水果包裝的發(fā)展趨勢應(yīng)當順應(yīng)國家環(huán)保的號召，走綠色環(huán)保型的道路，要采用綠色環(huán)保的材料進行包裝，對于那些化學物質(zhì)嚴重超標的包裝物要盡量避免使用，以免造成對環(huán)境的破壞和對人體健康的危害。但是在低碳環(huán)保的同時，也要做到節(jié)約資源，保證產(chǎn)品的質(zhì)量，降低包裝資源的損耗率。只有這樣，才能做到資源的可持續(xù)利用和發(fā)展。

圖1表1顯示，與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)牽拉傷模型大鼠視網(wǎng)膜組織 JNK明顯上升，組間方差齊同，經(jīng)單因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)顯示(P=0.008＜0.05)。給藥 14 d后與模型組比較，黃芪注射液治療組大鼠視網(wǎng)膜組織 JNK蛋白表達明顯下降(P=0.003＜0.05)，說明中藥黃芪可以明顯下調(diào)大鼠視網(wǎng)膜組織 JNK的蛋白表達，且差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織JNK表達的Western blot電泳條帶

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織JNK蛋白表達的情況(±s)

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織JNK蛋白表達的情況(±s)

注:與假手術(shù)組(左眼)比較:*P=＜0.05;與模型組(左眼)比較:△P＜0.05

組別 鼠數(shù)JNK/GAPDH模型 組 ( 右 眼 )4 0.032 0.57±0.09模 型 組 ( 左 眼 ) 4 0.77±0.08*治 療 組 ( 右 眼 ) 4 0.56±0.10治 療 組 ( 左 眼 ) 4 0.52±0.12△假 手 術(shù) 組 (右 眼 ) 4 0.55±0.10假 手 術(shù) 組 (左 眼 ) 4 0.55±0.10 F 3.149 P

2.2 對大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達影響

圖2表2顯示，與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)牽拉傷模型大鼠視網(wǎng)膜組織 NF-кB明顯下降，組間方差齊同，經(jīng)單因素方差分析(One-Way ANOVALSD)顯示(P=0.002＜0.05)。給藥14 d后與模型組比較，黃芪注射液治療組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達明顯上調(diào)(P=0.003＜0.05)，說明中藥黃芪可以明顯改善大鼠視網(wǎng)膜組織 NF-кB的蛋白表達，且差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB表達的Western blot電泳條帶

2.3 對大鼠視網(wǎng)膜組織 p75NTR mRNA表達的調(diào)節(jié)作用

表3顯示，各組間方差齊同，經(jīng)單因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)，模型組p75NTR mRNA表達較假手術(shù)組升高(P=0.000)，假手術(shù)組的表達僅為模型組的0.23倍。黃芪注射液治療組的p75NTR mRNA表達較模型組降低(P=0.04)，治療組的表達為模型組的0.56倍。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達的情況(±s)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達的情況(±s)

注:與假手術(shù)組(左眼)比較:*P＜0.05;與模型組(左眼)比較:△P＜0.05

組別 鼠數(shù) NF-кB/GAPDH模型組 ( 右 眼 )4 0.001 0.82±0.05模 型 組 ( 左 眼 ) 4 0.63±0.06*治 療 組 ( 右 眼 ) 4 0.81±0.06治 療 組 ( 左 眼 ) 4 0.80±0.06△假 手 術(shù) 組 (右 眼 ) 4 0.83±0.05假 手 術(shù) 組 (左 眼 ) 4 0.82±0.06 F 7.274 P

表3 p75NTR mRNA的表達情況(相對定量法)

3 討論

P75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體 (p75 neurotrophin receptor，p75NTR)因其促神經(jīng)元細胞凋亡的效應(yīng)近年得到廣泛研究［5-6］。p75NTR是一種跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員之一［7］。TNF受體家族在氨基酸排序上有很大的保守性，它們的胞內(nèi)域都存在一個短的同源區(qū)域，稱為死亡結(jié)構(gòu)域(death domain)，當它與配基結(jié)合時可誘導相應(yīng)細胞發(fā)生凋亡。Lebrun-Julien等［8］進一步對 Müller細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)與P75NTR受體結(jié)合后產(chǎn)生了對RGCs有害的毒性信號，可抵消NFG的神經(jīng)保護作用;此外，即使不使用NGF，藥物抑制p75NTR或者使用敲除p75NTR基因的小鼠也可減少軸索斷裂造成的 RGCs死亡，進一步證實p75NTR的毒性作用。通過對p75NTR信號傳導途徑的研究發(fā)現(xiàn)，一些信號分子參與 p75NTR引起的細胞凋亡過程，如神經(jīng)酰胺(ceramide)、JNK (c-Jun N-termianl kinase)、Bax、caspase、calpain等。研究表明，神經(jīng)酰胺可以激活JNK，JNK活化后可與線粒體共同產(chǎn)生促凋亡作用，因此 JNK的活化在p75NTR介導的細胞凋亡中起重要作用［9-10］。

需要指出的是，p75NTR也可通過核因子 кB (nuclear factor kappaB，NFкB)促進 RGCs細胞存活。NF-κB是 p75NTR參與促進 RGCs細胞存活的重要信使，自然狀態(tài)下 NF-κB普遍存在于細胞漿中，與其抑制性蛋白 IκB結(jié)合而呈非活性狀態(tài)。當機體受到創(chuàng)傷如被病毒、氧化劑、炎癥細胞因子等刺激后，NF-κB被激活與 IκB解離，從胞漿中進入到細胞核內(nèi)，結(jié)合到靶基因啟動子序列上的 κB位點，誘導基因轉(zhuǎn)錄，合成各種細胞因子，并通過反饋環(huán)路將基因表達放大、持續(xù)。NF-κB與細胞凋亡的關(guān)系十分密切。一方面 NF-κB能通過刺激IL-1β轉(zhuǎn)化酶蛋白酶、c-myc、TNF-α基因的表達而誘導細胞凋亡。同時又有大量的證據(jù)表明，NF-κB在活體和不同的細胞培養(yǎng)模型中均有抗凋亡作用［11-12］。

黃芪注射液是由中藥黃芪提取精制而成，黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. Var.mongholicus(Bge.)Hsia或 膜 莢黃芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，其味甘、性溫，有補氣升陽、固表止汗、托毒排膿和生肌等功效［13］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有增強心肌收縮力、保護心肌細胞、清除氧自由基、改善微循環(huán)灌注、提高超氧化物歧化酶活性、調(diào)節(jié)免疫功能、降低血液黏稠度、抑制血小板凝聚等作用［14］。臨床廣泛用于治療循環(huán)、神經(jīng)、呼吸和內(nèi)分泌等疾病。近年來，黃芪在缺血性視網(wǎng)膜病變、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼科疾患中的應(yīng)用也日益廣泛。

本實驗以橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，從基因和蛋白水平觀察黃芪注射液對視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織 p75NTR、JNK及NF-кB的影響。實驗證實，在視神經(jīng)損傷之后，模型組手術(shù)眼JNK蛋白表達量明顯高于非手術(shù)眼，這提示橫向牽拉法造模導致的視神經(jīng)節(jié)細胞凋亡通過 JNK蛋白介導。黃芪注射液治療組p75NTR的mRNA及JNK的蛋白表達水平均較模型組降低，而NFкB蛋白表達量較模型組明顯升高，提示黃芪注射液可以降低視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織中p75NTR mRNA的表達，從而減少神經(jīng)生長因子與p75NTR的結(jié)合，進而阻斷下游JNK信號傳導通路的激活，發(fā)揮抗細胞凋亡的作用，并通過上調(diào)NF-кB的蛋白表達而促進神經(jīng)再生，從而提高神經(jīng)元的抗損傷能力，起到視神經(jīng)保護作用。

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Astragalus Injection Inhibits Retinal Ganglion Cell Apoptosis by Regulating JNK and NF-κB Pathway

GU Xin-yi1，ZHOU Jian2△，YAN Xiao-ling2，SU Yan2，WU Lu-hua3，ZHAO Peng-bo1，LIU Xin-yan1
(1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2.Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 3.The Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To observe the optic nerve protective effects of astragalus membranaceus injection on tractive optic nerve injury in rats and to explore its possible mechanism.Methods:66 healthy male Wistar rats were randomly divided into sham operated group，model group and astragalus membranaceus injection group，with 22 rats in each group; The optic nerve of model rats was injured by the transverse quantitative traction(tension given to the optic nerve:0.10N; tractive direction:perpendicular to the optic nerve;duration:20 seconds)，and that of sham-operation group was only exposed but not pulled;After model establishment，treatment group were given with astragalus membranaceus injection by intraperitoneal injection，and model group were given with normal saline for testing.14 days later，the changes of expression of JNK and NF-κB in rat retinal tissue were detected with Western blotting，and the expression of p75NTR mRNA was detected by real-time PCR.Results:Compared with the sham operation group，the expression level of p75NTR mRNA and JNK protein in the optic nerve injury group increased.On the contrary，the protein expression level of NF-κB significantly declined;After treatment for 14 days，the expression of p75NTR mRNA and JNK protein decreased in the astragalus injection treatment group compared with the model group.However，the protein expression level of NF-κB increased.Conclusion:Astragalus membranaceus injection could has the function of protecting the optic nerve.The mechanism may be related with decreasing p75NTR mRNA and the protein expression of JNK，and increasing the protein expression of NF-κB.

Optic nerve injury;Astragalus membranaceus;P75 neurotrophin receptor;C-Jun N-termianl kinase; Nuclear factor kappaB

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0358-04

2015-06-15

國家自然科學基金資助項目(81173307)-補氣活血法對視神經(jīng)p75NTR/TrK信號通路調(diào)控的分子機制研究

谷新怡(1986-)，女，黑龍江人，在讀博士，從事中醫(yī)藥治療視神經(jīng)疾病的臨床與研究。

△通訊作者:周 劍(1964-)，男，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，博士研究生導師，從事中醫(yī)藥治療視神經(jīng)疾病的臨床與研究，Tel:010-67689733，E-mail:zhj9667@126.com。