超高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法篩查化妝品中12種糖皮質(zhì)激素

李　強(qiáng)，張曉光，馬俊美，李潤(rùn)巖，范素芳，張　巖*

(1．河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北　石家莊　050091；2.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北　石家莊　050091)

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超高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法篩查化妝品中12種糖皮質(zhì)激素

李強(qiáng)1,2，張曉光1,2，馬俊美1,2，李潤(rùn)巖1,2，范素芳1,2，張巖1,2*

(1．河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050091；2.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050091)

摘要：建立了超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜快速篩查和確證化妝品中可能添加的12種糖皮質(zhì)激素的分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取，用Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)分離，以0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。以正離子全掃描模式得到糖皮質(zhì)激素的精確質(zhì)量數(shù)，與理論精確質(zhì)量數(shù)對(duì)比，精確度偏差小于2×10-6。建立了篩查列表，并將12種糖皮質(zhì)激素物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)加入確證條件中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)12種糖皮質(zhì)激素類(lèi)物質(zhì)的快速篩查。檢出限為1~2 μg/kg，定量下限為3~5 μg/kg；加標(biāo)水平為10,20,40 μg/kg時(shí)，回收率為78.3%~112.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%~11.2%。該方法可作為化妝品中非法添加糖皮質(zhì)激素成分的高通量篩選和確認(rèn)檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜；四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜；糖皮質(zhì)激素；化妝品

隨著人們生活水平的提高，化妝品成為不可缺少的消費(fèi)類(lèi)產(chǎn)品。化妝品是指以涂擦、噴灑或其他類(lèi)似的方法，散布于人體表面任何部位(皮膚、毛發(fā)、指甲、口唇等)，以達(dá)到清潔、消除不良?xì)馕?、護(hù)膚、美容和修飾目的的日用化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)已成為全球最大的化妝品市場(chǎng)之一，化妝品年銷(xiāo)售額達(dá)2 000多億元，約占全球化妝品市場(chǎng)的8.8%，僅次于美國(guó)[2]。伴隨著化妝品市場(chǎng)的高增長(zhǎng)和高需求，化妝品質(zhì)量問(wèn)題日益突出，含毒化妝品嚴(yán)重危害人們的身體健康。

糖皮質(zhì)激素是皮膚科最常見(jiàn)的外用藥物，可抑制纖維細(xì)胞再生，對(duì)皮膚具有一定的美白功效，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生激素依賴(lài)癥及其他副作用，甚至引發(fā)癌癥，對(duì)人體造成嚴(yán)重傷害。我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2007版明確規(guī)定，糖皮質(zhì)激素屬于禁用物質(zhì)[3]。但是，由于其具有明顯的美白、祛痘等效果，不少?gòu)S家仍然非法向化妝品中添加糖皮質(zhì)激素類(lèi)物質(zhì)。近期曝光的含有糖皮質(zhì)激素的“毒面膜”事件，使得化妝品安全問(wèn)題又被推到了輿論的風(fēng)口浪尖。由此可見(jiàn)，研究糖皮質(zhì)激素類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，建立簡(jiǎn)單高效的篩查方法對(duì)于行業(yè)監(jiān)管和保障消費(fèi)者權(quán)益具有十分重要的意義。

目前，糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[4]、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法[5-9]以及毛細(xì)管電泳法[10-12]。但以上方法均存在分辨率低、檢測(cè)種類(lèi)有限、易造成假陽(yáng)性等問(wèn)題。近年來(lái)，以飛行時(shí)間質(zhì)譜和靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜為代表的液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法逐漸成為研究熱點(diǎn)。靜電場(chǎng)軌道阱的原理是利用不同物質(zhì)在阱中運(yùn)動(dòng)軌跡不同而實(shí)現(xiàn)精確定量，可得到一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)以及多級(jí)結(jié)構(gòu)碎片，且可以自建數(shù)據(jù)庫(kù)。靜電場(chǎng)軌道阱為目標(biāo)分析物提供精準(zhǔn)而全面的數(shù)據(jù)，大大降低了篩查和確證的誤差，在食品保健品非法添加檢測(cè)[13-14]、農(nóng)藥殘留檢測(cè)[15-16]、化妝品禁用物質(zhì)篩查[17-18]等領(lǐng)域得到了一定應(yīng)用，但將其用于檢測(cè)化妝品中激素的研究較少。本文利用超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀建立了化妝品中12種糖皮質(zhì)激素的快速篩查和確證方法，為政府部門(mén)對(duì)化妝品市場(chǎng)監(jiān)管提供了有效的補(bǔ)充方案。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、材料和試劑

Ultimate 3 000超高效液相色譜儀(美國(guó)ThermoFisher公司);Q-Exactive超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)ThermoFisher公司);高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);IKA Vortex Genius 3旋渦混合器(德國(guó)IKA公司)；KQ-250DV型超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲酸(色譜純，美國(guó)Sigma公司);甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司);實(shí)驗(yàn)用水為自制的二級(jí)水，符合GB/T6682規(guī)定；12種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥95%，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制，系列標(biāo)準(zhǔn)工作液用乙腈-水溶液(體積比3∶7)配制；化妝品購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2樣品前處理

稱(chēng)取1.00 g(精確至0.001 g)樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL水，渦旋3 min，再加入5 g NaCl、10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲15 min，于4 ℃下以10 000 r/min離心3 min，移取上層清液，加入10 mL正己烷，劇烈振蕩1 min后棄去正己烷層，剩余乙腈層再加入10 mL正己烷，劇烈振蕩1 min后棄去正己烷層，剩余乙腈層過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.3儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm;美國(guó)Waters公司)。流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸)，B為甲醇(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序:0~2 min，B相保持30%；2~6 min，B相從30%線性升至95%;6~8 min，B相保持95%;8~9 min，B相從95%線性降至30%;9~10 min，B相保持30%。

1.3.2質(zhì)譜條件質(zhì)量分析器：四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱；電噴霧離子源；鞘氣流量：35 Arb；輔助氣流量10 Arb；噴霧電壓：3.8 kV；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管溫度：320 ℃。

一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)獲取采用正離子全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍：m/z150~8 000。二級(jí)碎片圖譜獲取采用目標(biāo)離子監(jiān)測(cè)模式，分辨率17 500，碰撞能量為35%。

樣品檢測(cè)采用正離子全掃描+基于數(shù)據(jù)依賴(lài)的二級(jí)質(zhì)譜碰撞解離(Full MS+ddMS2)掃描模式；全掃描分辨率：70 000；基于數(shù)據(jù)依賴(lài)的二級(jí)質(zhì)譜碰撞解離分辨率：17 500；碰撞能量為35%。

2結(jié)果與討論

2.1樣品的提取

由于化妝品基質(zhì)較為復(fù)雜，因此需要選擇合適的提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)選取了3種不同的提取溶劑(甲醇、乙腈、乙酸乙酯)和不同的超聲時(shí)間(5，10，15，20，25 min)，按照“1.2”方法進(jìn)行樣品前處理，考察了12種糖皮質(zhì)激素的回收率(樣品空白基質(zhì)加標(biāo)濃度10 μg/kg)。結(jié)果表明，在相同的超聲時(shí)間下，以甲醇為提取溶劑時(shí)，甲醇和水無(wú)法分層，溶液較為渾濁，造成過(guò)濾膜困難；以乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，在加入鹽的情況下，乙腈和乙酸乙酯均能和水分層，12種糖皮質(zhì)激素的回收率分別為78.3%~111.1%和57.1%~119.8%，由于乙酸乙酯和正己烷互溶，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)加入正己烷以進(jìn)一步除去雜質(zhì)的目的。而在乙腈中加入正己烷后，對(duì)12種糖皮質(zhì)激素的回收率幾乎無(wú)影響。因此選取乙腈為提取溶劑，在該條件下，考察了超聲時(shí)間對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的增加，提取效果增加，當(dāng)超過(guò)15 min后，提取回收率增加不明顯，因此選擇超聲時(shí)間為15 min。

2.2色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察了4種不同的流動(dòng)相體系(水-甲醇、水-乙腈、 0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈)對(duì)色譜峰形和出峰強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，使用水-甲醇以及0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇2種流動(dòng)相體系得到的色譜峰形較優(yōu)；當(dāng)使用乙腈為流動(dòng)相時(shí)，潑尼松和地夫可特的出峰出現(xiàn)分叉，而使用甲醇為流動(dòng)相時(shí)，所有目標(biāo)分析物的峰形良好，但使用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇流動(dòng)相所得的峰面積大于水-甲醇流動(dòng)相所得的峰面積，這可能是由于加入甲酸，對(duì)正離子模式電離起到了增強(qiáng)作用。

分別采用正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)12種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，12種糖皮質(zhì)激素均可產(chǎn)生[M+H]+以及[M-H]-分子離子峰，但在負(fù)離子模式下，產(chǎn)生的[M-H]-分子離子峰強(qiáng)度較小，約為正離子模式下[M+H]+峰強(qiáng)度的1/10，且產(chǎn)生的二級(jí)碎片信息較少，不利于定性篩查。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)確定以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相，正離子模式進(jìn)行全掃描，提取[M+H]+分子離子峰。12種糖皮質(zhì)激素的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

由于化妝品基質(zhì)較為復(fù)雜，提取液中的非目標(biāo)組分可能對(duì)目標(biāo)分析物產(chǎn)生影響。雖然靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜比三重四極桿質(zhì)譜具有更強(qiáng)的抗干擾能力，但仍然存在基質(zhì)效應(yīng)，因此，需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)將12種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)分別用乙腈和空白基質(zhì)提取液配制成一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(2，10,50,100,200，500 ng/mL)，以相同物質(zhì)在不同基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率大小來(lái)判斷基質(zhì)效應(yīng)情況(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明，12種糖皮質(zhì)激素在空白基質(zhì)中均為基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中哈西奈德的抑制效應(yīng)最為明顯。

表1　12種糖皮質(zhì)激素的基質(zhì)效應(yīng)比較

2.4理論精確質(zhì)量數(shù)的驗(yàn)證

本方法以正離子模式全掃描方式運(yùn)行，12種糖皮質(zhì)激素得到較好的分離效果，且提取的精確質(zhì)量數(shù)與理論精確質(zhì)量數(shù)相差較小，精確度誤差均小于2×10-6(5 ppm)，具體質(zhì)量精度見(jiàn)表2。

圖1　12種激素化合物的提取離子色譜圖

AnalyteRetentiontime/minTheoreticalmassm/zMeasuredmassm/zMassaccuracyerror/10-6Prednisolone3.85361.20152361.201350.47Prednisone3.15359.18581359.185640.47Methylprednisolone4.63375.21714375.217250.29Betamethasone4.48393.20770393.207470.58Flumethasone4.32411.19833411.198670.83Deflazacort5.00442.22304442.222750.66Budesonide5.59431.24348431.243290.44Diflorasonediacetate5.36495.21947495.219390.16Halcinonide5.81455.20018455.199651.16Amcinonide6.01503.24450503.244570.14Betamethasonedipropionate6.08505.26023505.260620.77Clobetasone17-butyrate6.00479.20018479.200290.23

2.5基于二級(jí)質(zhì)譜圖庫(kù)篩查方法的建立

利用Extract Finder軟件建立篩查方法，首先采用目標(biāo)離子監(jiān)測(cè)(Target MS2)方法，對(duì)12種糖皮質(zhì)激素的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，將采集的二級(jí)特征圖譜添加入二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。其次，建立12種糖皮質(zhì)激素的篩查列表，將理論分子式、保留時(shí)間、特征碎片離子、同位素理論分布、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)等加入篩查列表，并設(shè)置各指標(biāo)的偏差范圍，對(duì)于未知樣品，采用正離子全掃描+基于數(shù)據(jù)依賴(lài)的二級(jí)質(zhì)譜碰撞解離(Full MS+ddMS2)模式運(yùn)行，將采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入篩查列表，系統(tǒng)通過(guò)對(duì)各個(gè)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，最終得到確證結(jié)果。

2.6方法學(xué)驗(yàn)證

用空白基質(zhì)配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以12種糖皮質(zhì)激素的一級(jí)質(zhì)量數(shù)提取離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x,ng/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)。采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別作為方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表3。在空白基質(zhì)中添加12種糖皮質(zhì)激素，添加水平分別為10，20，40 μg/kg，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見(jiàn)表4。12種化合物在2~500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1~2 μg/kg，定量下限為3~5 μg/kg，回收率為78.3%~112.5%，RSD為1.0%~11.2%。該方法完全能夠滿(mǎn)足實(shí)際樣品的篩查和確證需要。

表3　12種化合物的線性關(guān)系、線性范圍、檢出限與定量下限

表4　12種糖皮質(zhì)激素的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖2　某化妝品樣品中倍他米松的提取離子色譜圖Fig.2　Extracted ion chromatogram of betamethasone in a real sample

2.7實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用本方法對(duì)購(gòu)自超市的20份化妝品進(jìn)行篩查分析，在某品牌化妝品中檢出倍他米松(見(jiàn)圖2)，含量為280 μg/kg。將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入建立的篩查列表進(jìn)行篩查，結(jié)果顯示，該化妝品中含有倍他米松，其在保留時(shí)間、一級(jí)母離子、二級(jí)碎片離子、同位素理論分布等方面與倍他米松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)高度一致(提取的母離子、主要子離子誤差小于5 ppm)。根據(jù)歐盟2002/657/EC的規(guī)定，利用高分辨率質(zhì)譜對(duì)禁用藥物確認(rèn)至少需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn)，而利用本方法，獲得了大于9個(gè)識(shí)別點(diǎn)(母離子505.260 62,碎片離子149.023 51,71.086 33,279.174 20)的定性分?jǐn)?shù)。利用國(guó)標(biāo)GB/T24800.2-2009《化妝品中四十一種糖皮質(zhì)激素的測(cè)定 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法和薄層層析法》對(duì)該樣品進(jìn)行測(cè)定，得到倍他米松的含量為302 μg/kg，與本方法測(cè)定的含量相差較小。由此可見(jiàn)，利用本方法對(duì)化妝品中糖皮質(zhì)激素進(jìn)行篩查和確認(rèn)是可行的。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)化妝品中的12種糖皮質(zhì)激素物質(zhì)進(jìn)行篩查。在10 min內(nèi)完成了對(duì)12種糖皮質(zhì)激素較好的分離，建立了篩查列表以及二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，篩查確證結(jié)果可信度較高，該方法前處理簡(jiǎn)便、抗干擾性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)在無(wú)標(biāo)物情況下對(duì)樣品的篩查，且自建數(shù)據(jù)庫(kù)可擴(kuò)充，是對(duì)現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)化妝品中糖皮質(zhì)激素物質(zhì)的有力補(bǔ)充。

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[16]Sun Y A，Wang K，Li Z X，Yu W H，Wang G Q.J.HenanNormalUniv.：Nat.Sci.Ed.(孫雨安，王珂，李振興，于文浩，王國(guó)慶.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版)，2015,43(3):69-73.

[17]Li Z Y，Wang F M，Niu Z Y，Luo X，Chen J H，Wang X R.J.Anal.Sci.(李兆永，王鳳美，牛增元，羅忻，陳軍輝，王小如.分析科學(xué)學(xué)報(bào))，2015,31(2):171-177.

[18]Li Z Y，Wang F M，Niu Z Y，Luo X，Zhang G，Chen J H.Chin.J.Chromatogr.(李兆永，王鳳美，牛增元，羅忻，張罡，陳軍輝.色譜)，2014,32(5):477-484.

Screening of 12 Glucocorticoids in Cosmetics by High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

LI Qiang1,2，ZHANG Xiao-guang1,2，MA Jun-mei1,2，LI Run-yan1,2，F(xiàn)AN Su-fang1,2，ZHANG Yan1,2*

(1.Hebei Food Inspection and Research Institute，Shijiazhuang050091，China;2.Key Laboratory of Food Safety of Heibei Province,Shijiazhuang050091，China)

Abstract：A method was developed for screening of 12 kinds of glucocorticoids in cosmetics by high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high-resolution mass spectrometry(Orbitrap MS) .The samples were extracted with acetonitrile,and separated with an Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) using a binary solvent system composed of 0.1% formic acid methanol solution and 0.1% formic acid water solution by gradient elution.Accurate mass number of target compound were got in full scan mode.Compared to accurate mass number in theory,the mass accuracy error was below 2×10-6.The screening list was built,and the database of secondory characteristic fragment ions for the glucocorticoids were added in screening option.Qualitative screen was achieved.The limits of detection(LOD) of the method ranged from 1 μg/kg to 2 μg/kg，and the limits of quantitation(LOQ) ranged from 3 μg/kg to 5 μg/kg．Satisfactory recoveries from 78.3% to 115.2% were obtained at spiked concentration levels of 10,20,40 μg/kg,and the relative standard deviations(RSDs) were in the range of 1.0%-11.2%.The method could be used for the determination of glucocorticoid in cosmetics as a high-throughput and confirmatory method.

Key words：ultra high performance liquid chromatography;orbitrap mass spectrometry(Orbitrap MS);glucocorticoid;cosmetic

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.63；O629.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1004-4957(2016)02-0179-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.008

*通訊作者：張巖，博士，高級(jí)工程師，研究方向：化學(xué)生態(tài)學(xué)，Tel：0311-67568335，E-mail：snowwinglv@126.com

收稿日期：2015-08-19；修回日期：2015-09-16