灌注法去細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建食管全層細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究*

侯　楠，朱　力，馬瑞娜，楊　松

1 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(成都　610500)；2 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(西安　710038)

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·論著·

灌注法去細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建食管全層細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究*

侯楠1，朱力1，馬瑞娜2，楊松1

1 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(成都610500)；2 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(西安710038)

【摘要】目的利用灌注法去細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)，為組織工程食管重建選擇1種理想的支架材料。方法成年新西蘭大白兔(雌雄不限)24只，隨機(jī)分為灌注組(n=16)和正常對(duì)照組(n=8)，采用灌注法去細(xì)胞技術(shù)處理兔食管，處理后的標(biāo)本均行大體、組織學(xué)、掃描電鏡、免疫熒光R染色檢測(cè)及MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)。結(jié)果大體觀察：離體食管經(jīng)灌注2 h后可見大部分變白，經(jīng)16 h灌注后食管變得蒼白剔透，清楚可見脈管紋理。組織學(xué)與掃描電鏡觀察：灌注法構(gòu)建的食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)的去細(xì)胞程度均勻，孔隙多，孔隙率為(88.25±2.37)%。免疫熒光染色：離體食管MHC-I和MHC-II染色呈陽(yáng)性表達(dá)，灌注法構(gòu)建的食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)MHC-I和MHC-II染色呈陰性表達(dá)。MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)：含食管外基質(zhì)浸提液培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與普通細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，細(xì)胞相對(duì)增殖率>1。結(jié)論采用灌注法構(gòu)建食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)可操作性強(qiáng)，安全性好，免疫原性極低，且食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞無毒性，有一定的促生長(zhǎng)作用，是組織工程食管重建的理想支架材料。

【關(guān)鍵詞】灌注法；食管；組織工程；細(xì)胞外基質(zhì)

近年來，由于Barret食管、食管腺癌等腫瘤及癌前病變發(fā)病率的逐年增高，加之外傷、放療、先天性疾病、感染等各種原因造成的食管缺損，仍是耳鼻咽喉頭頸外科難題[1]。目前，對(duì)于長(zhǎng)段食管缺損后的修補(bǔ)，多采用自體內(nèi)臟材料移植(如胃、空腸、結(jié)腸)或人工材料(如聚己酸內(nèi)酯、聚乙醇酸、聚乳酯等)[2-3]。自體材料由于與食管的生理不完全一致，術(shù)后易造成器官生理功能紊亂，并且造成機(jī)體新的缺損[4]。人工材料會(huì)發(fā)生各種慢性免疫排斥反應(yīng)，其生物相容性仍有待驗(yàn)證。無論人工材料或者自體材料，在組織結(jié)構(gòu)上都不能完全達(dá)到食管的結(jié)構(gòu)層次，從而無法完全達(dá)到功能修復(fù)，以至于術(shù)后出現(xiàn)各種并發(fā)癥，如瘢痕愈合、吻合口瘺、吞咽困難、胃運(yùn)動(dòng)障礙及胃食管反流等，這些并發(fā)癥又有可能導(dǎo)致細(xì)胞修復(fù)過程中異常生長(zhǎng)發(fā)生瘤變。理想的食管替代物需具有以下特性[5]：1)完整的解剖層次及功能；2)良好的機(jī)械強(qiáng)度和耐久性；3)生物相容性；4)無免疫排斥反應(yīng)；5)一定的抵抗力。組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料被稱為“3D”支架，來源于天然，是由富含蛋白質(zhì)、蛋白聚糖等一系列高分子材料構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，目前公認(rèn)的觀點(diǎn)是天然細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境是細(xì)胞附著、遷移、擴(kuò)增及分化的關(guān)鍵[6]。因此，在食管重建的支架材料研究中，仍將細(xì)胞外基質(zhì)作為支架材料的主要選擇之一，如膠原、絲纖蛋白、角蛋白和小腸黏膜下層(SIS)[7-8]。關(guān)于以上支架材料的報(bào)道，大多是將天然細(xì)胞外基質(zhì)制作為食管補(bǔ)片，修補(bǔ)小段或者局部食管缺損；對(duì)于長(zhǎng)段食管缺損或全層食管缺損，由于缺乏支撐及體內(nèi)降解速度過快，使用上述材料，術(shù)后新生組織未生成而支架結(jié)構(gòu)已經(jīng)降解，最終導(dǎo)致修補(bǔ)失敗[9-10]。對(duì)于長(zhǎng)段食管全層缺損的修復(fù)，最理想的支架材料是全層食管去細(xì)胞外基質(zhì)，因?yàn)槭彻芙馄蕦哟螐?fù)雜，包括黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層。近年來，Ott研究小組[11-17]在Nature Medicine上報(bào)道了一系列關(guān)于利用脈管系統(tǒng)灌注去細(xì)胞劑構(gòu)建器官全層去細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究,成功構(gòu)建了動(dòng)物心臟、肺臟及腎臟的全層去細(xì)胞外基質(zhì)。這一系列報(bào)道為全層器官去細(xì)胞外基質(zhì)支架的構(gòu)建開創(chuàng)了新思路，更有力說明灌注法有可能成為構(gòu)建組織或器官全層去細(xì)胞支架的首選方法。本課題組也曾利用灌注法去細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建出小腸全層去細(xì)胞外基質(zhì)支架材料及保留喉軟骨去除喉肌的全喉細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，通過既往的研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于解剖層次較復(fù)雜的組織或器官，可以使用脈管灌注的方式達(dá)到全層的去細(xì)胞效果。基于以上理論基礎(chǔ)，本研究通過頸總動(dòng)脈、甲狀腺下動(dòng)脈與食管的分支，進(jìn)行去細(xì)胞液持續(xù)灌注，構(gòu)建出解剖層次與食管完全一致的去細(xì)胞食管支架材料，為組織工程大段食管重建或全層食管重建提供理想的支架材料。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量(2.0±0.3) kg，雌雄不限，均購(gòu)于成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(川)2008-0076。將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為灌注組(n=16)和正常對(duì)照組(n=8)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

十二烷基磺酸鈉(SDS)、辛基酚聚氧乙烯醚(Triton X-100)、抗生素、DMEM培養(yǎng)液、甲苯胺藍(lán)、2.5%胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(Sigma公司)；Hera cell 150 CO2培養(yǎng)箱(Heaeus 公司，德國(guó))；靶控麻醉泵(北京西化醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；熒光/光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼攝像系統(tǒng)(Leica公司，德國(guó))；AG240DR 電子天平(梅特勒公司，瑞士)；S-900 掃描電鏡(Hitachi 公司，日本)； ZYJLT3超凈工作臺(tái)(西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1灌注法制備食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)支架取新西蘭大白兔自耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)行全身麻醉，麻醉成功后，將兔仰臥固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)上。麻醉兔頸部脫毛后，常規(guī)消毒鋪巾，自頸部中線縱行切開皮膚，分離頸前筋膜、頸前帶狀肌及喉，暴露頸段食管及頸部血管。保留該段頸總動(dòng)脈及其與食管動(dòng)脈的主要分支，結(jié)扎該段食管其余各級(jí)分支血管。由于頸段食管與喉部所共用分支血管較多，因此游離頸段食管時(shí)將喉一同游離，經(jīng)頸總動(dòng)脈用0.45 mm針頭插管，并采用靶控麻醉泵進(jìn)行持續(xù)灌注。灌注順序參照Ott[11]等首次報(bào)道的灌注法構(gòu)建心臟全層去細(xì)胞外基質(zhì)的順序，簡(jiǎn)要描述如下：1)含有腺苷和肝素的PBS 灌注15 min；2)含有1% SDS的去離子水灌注16 h；3)去離子水灌注15 min；4)含1% Triton X-100 的去離子水灌注30 min；5)含抗生素的PBS灌注48 h。 食管離體后，所有操作均在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行。為避免離體食管在灌注期間長(zhǎng)時(shí)間浸泡于去離子劑中干擾去細(xì)胞效果，灌注期間離體食管置于無菌200目銅篩網(wǎng)上，保持底部懸空，以確保去細(xì)胞灌注液及時(shí)流出，銅篩網(wǎng)下放置容器以確保灌注液及時(shí)流出。

1.3.2大體觀察分別觀察新鮮離體頸段食管與灌注法16 h后，去細(xì)胞全層食管外基質(zhì)的大體情況變化。

1.3.3組織學(xué)觀察取實(shí)驗(yàn)標(biāo)本固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。脫水及染色過程簡(jiǎn)要描述如下：1)二級(jí)二甲苯各15 min；2)乙醇梯度脫水15 min；3)蒸餾水3 min；4)蘇木精中染色10～30 min；5)自來水流水沖洗15 min；6)1%鹽酸乙醇液中褪色約10 s；7)0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色3～5 min；8)封片后于光鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.3.4掃描電鏡觀察取新鮮離體頸段食管及灌注法去細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建的食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)支架。簡(jiǎn)要步驟如下：1)2.5%戊二醛固定；2)2%鋨酸染色固定；3)50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水；4)乙腈真空干燥；5)表面噴金；6)掃描電鏡觀察正常食管表面狀態(tài)及去細(xì)胞食管支架孔隙結(jié)構(gòu)。圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0進(jìn)行食管去細(xì)胞外基質(zhì)支架孔隙率測(cè)定。

1.3.5MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：取2月齡新西蘭大白兔，左側(cè)大腿備皮，骨髓穿刺針于無菌條件下自兔左腿股骨大轉(zhuǎn)子處穿刺抽取骨髓組織，注入50 mL離心管中，加入適量肝素致離心管，適當(dāng)振動(dòng)離心管后，再加入等體積的不完全DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打成細(xì)胞懸液。加入淋巴細(xì)胞提取液，通過密度梯度離心法提取出單個(gè)核細(xì)胞，加入等體積的不完全DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，使細(xì)胞分散均勻后，在離心機(jī)中，1 500 r/min，離心半徑15 cm，離心10 min，然后棄上清液，重復(fù)此操作2遍。向離心管中加入體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清，吹打分散成細(xì)胞懸液，接種于25 mL塑料培養(yǎng)瓶，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與去細(xì)胞支架材料浸提液共同培養(yǎng)：首先制備食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)浸提液：細(xì)胞培養(yǎng)液與食管去細(xì)胞外基質(zhì)之比為10 mL/cm2，加入含20%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃孵箱內(nèi)靜置24 h，制備食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)浸提液。取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，稀釋成1×107/L，接種于3塊96孔板上。其中，食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)浸提液為實(shí)驗(yàn)組，未含浸提液的細(xì)胞培養(yǎng)液為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各10孔，每孔100 μL ，5%CO2飽和濕度、37 ℃下，培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)浸提液，對(duì)照組加新配制的20%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于2、4、7 d各取出1塊96孔板，每孔加入5 g/L的MTT液 20 μL， 置于培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育4 h后取出，吸去上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，振蕩10 min后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定各孔光吸光度(A)值，計(jì)算兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)，進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。計(jì)算公式如下：RGR=(實(shí)驗(yàn)組A值/ 對(duì)照組A值)×100%。

1.3.6免疫熒光染色分析取新鮮離體頸段食管及經(jīng)灌注去細(xì)胞處理的食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)支架，4% 甲醛固定后石蠟包埋，切片。標(biāo)本分別在鼠抗兔MHC-Ⅰ抗體稀釋液及鼠抗兔MHC-Ⅱ抗體稀釋液中孵化12 h后，PBS清洗3次，再將標(biāo)本放置在2抗FITC中30 min，然后PBS清洗3次，免疫熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1通過脈管進(jìn)行去細(xì)胞液灌注的食管大體觀察結(jié)果

新鮮離體食管色澤紅潤(rùn)，可清楚看見頸總動(dòng)脈內(nèi)有紅色血液(圖1A)，保留頸總動(dòng)脈及分支的喉及食管復(fù)合體在未進(jìn)行肝素及腺苷灌注前體積縮小，顏色變暗(圖1B)，經(jīng)過去細(xì)胞液灌注16 h后，離體食管體積較圖1B增大，血管顏色剔透，肉眼未見明顯血色素殘留，整個(gè)食管及喉完全變得蒼白透明，仍保持食管及喉的大體形狀，且食管管腔通暢(圖1C)。

2.2組織學(xué)HE染色觀察及掃描電鏡觀察結(jié)果

HE染色可見，新鮮離體頸段食管黏膜層中含有上皮細(xì)胞和腺細(xì)胞，黏膜下層中的結(jié)締組織及小血管內(nèi)皮細(xì)胞，肌肉層里的環(huán)形肌細(xì)胞及縱向肌細(xì)胞均整齊排列(圖2A)。經(jīng)過去細(xì)胞劑灌注后的頸段食管黏膜上皮層內(nèi)未見明顯上皮細(xì)胞及腺細(xì)胞殘留，黏膜下層未見明顯血管內(nèi)皮細(xì)胞殘留，肌肉層內(nèi)未見明顯肌細(xì)胞殘留，但細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整保留(圖2B)。掃描電鏡下觀察到，新鮮離體食管的結(jié)構(gòu)緊密，無明顯孔隙(圖2C)。食管去細(xì)胞基質(zhì)支架纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在，無細(xì)胞殘留，達(dá)到了均勻的去細(xì)胞效果(圖2D)。經(jīng)Image - Pro Plus6.0軟件分析檢測(cè)孔隙率為(88.25±2.37)%。

2.3免疫熒光染色結(jié)果

新鮮離體頸段食管的黏膜層、肌肉層及腺體中均能觀察到MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗體熒光染色。食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)則不能觀察到MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ免疫熒光染色標(biāo)記(圖3)。

圖1大體觀察結(jié)果比較

注：A.離體前食管；B.離體后保留頸總動(dòng)脈及其分支的食管喉氣管復(fù)合體；C.經(jīng)過灌注后的食管及喉氣管復(fù)合體

圖2HE染色觀察及掃描電鏡觀察結(jié)果比較

注：A.新鮮食管的HE染色；B.經(jīng)過去離子劑灌注的食管HE染色；C.掃描電鏡下的新鮮食管；D.掃描電鏡下經(jīng)過去離子劑灌注的食管

圖3免疫熒光染色結(jié)果比較

注：A.新鮮食管MHC-I免疫熒光染色；B.去離子劑灌注的食管MHC-I免疫熒光染色；C.新鮮食管MHC-II免疫熒光染色；D.去離子劑灌注的食管MHC-II免疫熒光染色

2.4MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

第2天、第4天及第7天檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對(duì)增殖率均>1，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，A值明顯升高(P<0.05)，說明食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯抑制作用，未增高細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn)(表1)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3討論

組織工程再生醫(yī)學(xué)的終極目標(biāo)是構(gòu)建功能與形態(tài)相似的組織或者器官，以替代缺損的組織器官。目前，組織工程技術(shù)修復(fù)頸段食管的方式大致分為以下兩類：1)單純使用支架材料修復(fù)；2)種子細(xì)胞復(fù)合支架材料修復(fù)。無論哪種方式其首要任務(wù)都是支架材料的選擇。組織工程食管支架材料主要分為以下三大類：膠原、合成材料及去細(xì)胞外基質(zhì)[21]。其中，膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)結(jié)締組織的組成部分[22]，廣泛存在于皮膚、肌腱、韌帶或軟骨內(nèi)，其優(yōu)點(diǎn)是免疫原性低、易降解、有良好的組織相容性等，適合于皮膚替換和燒傷治療[23]，但由于其材料單薄，缺乏支撐，很少在長(zhǎng)段全層食管缺損中作為單一的修復(fù)材料，目前對(duì)于膠原在組織工程食管支架材料中的研究[24]報(bào)道多以膠原復(fù)合人工合成材料為主。人工合成材料如聚乙烯塑料和硅膠也廣泛用于食管缺損替代的研究，大量研究[25-26]報(bào)道，運(yùn)用聚偏二氟乙烯(PVDF)、乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)及聚羥基烷酸脂(PHA)等材料對(duì)動(dòng)物小面積食管缺損進(jìn)行，術(shù)后發(fā)現(xiàn)缺損處愈合良好，并且有血管上皮化。但對(duì)于長(zhǎng)段全層食管缺損的人工材料修補(bǔ)卻很少有成功的報(bào)道。可見人工材料的本質(zhì)不利于細(xì)胞的遷徙、增殖及血管化。組織工程技術(shù)的廣泛發(fā)展為食管缺損功能重建提供了一類可行的生物材料替代品[27]。目前組織工程技術(shù)修補(bǔ)食管缺損的研究報(bào)道包括了同種異體及異種異體的人或動(dòng)物的組織細(xì)胞外基質(zhì)，比如膀胱細(xì)胞外基質(zhì)，皮膚，心包膜及小腸黏膜下層。細(xì)胞外基質(zhì)優(yōu)于自體材料及人工材料不僅是因?yàn)閬碓磸V泛，更是由于其釋放生長(zhǎng)因子和生物活性肽有利于組織再生、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞擴(kuò)增、遷徙及分化。在組織工程食管支架材料方面最初的研究起源于小腸黏膜下層(SIS)。大量研究[28]表明，運(yùn)用SIS修補(bǔ)食管黏膜及黏膜下缺損效果尚可，但單純用SIS修補(bǔ)食管全層缺損者最終都會(huì)產(chǎn)生狹窄，并且死亡率較高。Badylak等[29-30]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于缺損面積小于3 cm×5 cm的患者，SIS可作為食管補(bǔ)片，進(jìn)行成功修復(fù)，且術(shù)后長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)，缺損部位在功能和形態(tài)上均可恢復(fù)。但在運(yùn)用狗作為模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)，全層食管缺損模型或環(huán)形食管缺損模型運(yùn)用SIS修補(bǔ)，術(shù)后由于缺乏機(jī)械應(yīng)力仍然會(huì)出現(xiàn)管腔狹窄及縫合口撕裂。因此，該方法僅僅適用于修補(bǔ)病變局限于食管黏膜上皮的情況。然而，臨床上食管修復(fù)的病例多為需要進(jìn)行食管切除的食管癌患者、后天獲得性食管閉鎖、穿孔或先天性食管結(jié)構(gòu)異常的患者，因此，長(zhǎng)段環(huán)狀食管缺損后的修補(bǔ)成為頭頸外科醫(yī)生、胸外科醫(yī)生和小兒外科醫(yī)生亟待解決的問題。曾有研究[31]報(bào)道，將骨骼肌細(xì)胞和口腔上皮細(xì)胞分別種植于SIS和羊膜，然后機(jī)械疊加成復(fù)合人工食管。但食管是一個(gè)解剖層次復(fù)雜的整體，單純的機(jī)械性疊加能否構(gòu)造出生理功能與天然食管相似的人工器官仍是疑問。

全層去細(xì)胞外基質(zhì)目前被組織工程界稱為“智能基質(zhì)”，因?yàn)樗芴峁┙M織再生重建所必須的生長(zhǎng)因子，規(guī)避植入的各種風(fēng)險(xiǎn)，在體內(nèi)保持標(biāo)準(zhǔn)化生物反應(yīng)[3,32]。從理論上講，全層食管去細(xì)胞外基質(zhì)更能保留組織化學(xué)和結(jié)構(gòu)信號(hào)而利于細(xì)胞再生和分化。本研究將食管全層作為一個(gè)整體，利用頸總動(dòng)脈、甲狀腺下動(dòng)脈及其他食管分支動(dòng)脈進(jìn)行去離子劑灌注，去除掉食管黏膜層、黏膜下層及肌層的細(xì)胞，構(gòu)建出食管全層去細(xì)胞支架。由于食管的各個(gè)層次均富含血管，該食管全層細(xì)胞外基質(zhì)支架的構(gòu)建則利用組織的脈管系統(tǒng)進(jìn)行去細(xì)胞劑的持續(xù)灌注。本研究中，去離子劑SDS和Triton X-100能在第一時(shí)間到達(dá)食管組織的各個(gè)層面，使各層面的細(xì)胞幾乎同時(shí)進(jìn)行去細(xì)胞處理，因此，構(gòu)建的食管去細(xì)胞支架孔隙率較高，去細(xì)胞效果較均勻，同時(shí)去細(xì)胞時(shí)間較短，可以最大程度保留細(xì)胞外基質(zhì)的生長(zhǎng)因子。本研究通過HE染色及掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其空間結(jié)構(gòu)層次與食管一致，包含了黏膜層、黏膜下層及肌層的細(xì)胞外基質(zhì)，但不同的是細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)未見細(xì)胞核殘留，這種與食管空間結(jié)構(gòu)完全一致的食管全層細(xì)胞外基質(zhì)更適合食管種子細(xì)胞的附著及生長(zhǎng)。本研究在制備食管全層去細(xì)胞支架的同時(shí)，保留了相關(guān)血管灌注，支架制備完成后，血管也達(dá)到了去細(xì)胞作用，為下一步大段組織工程材料的再血管化提供了基礎(chǔ)。本研究中，采用MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗體熒光染色發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的新鮮食管全層均有抗體染色，而經(jīng)過去離子劑處理的食管全層去細(xì)胞外基質(zhì)則不能觀察到免疫熒光抗體染色，說明未經(jīng)過去細(xì)胞處理的食管免疫原性較大，而經(jīng)過去細(xì)胞處理后的食管外基質(zhì)幾乎沒有免疫原性。行細(xì)胞毒性試驗(yàn)時(shí)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與去細(xì)胞外基質(zhì)浸提液共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該支架浸提液對(duì)細(xì)胞無害，并且適合細(xì)胞生長(zhǎng)，從而說明該支架具有較好的生物相容性。

綜上所述，灌注法可以作為食管全層去細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，同時(shí)食管全層去細(xì)胞基質(zhì)是大段食管缺損重建較理想的組織工程支架材料。

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Experimental Study on the Construction of 3D Esophageal Extracellular Matrix by the Method of Perfused Decellularization

HouNan1,ZhuLi1,MaRuina2,YangSong1.

1.DepartmentofOtlaryngologyHeadandNeckSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.DepartmentofOtlaryngologyHeadandNeckSurgery,TangduHospitalofTheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710038,China

【Key words】Perfusion method; Esophagus; Tissue engineering; Extracellular matrix

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of the 3D architecture of the rabbit esophageal scaffold by the perfusion method and provide an alternative scaffold for the reconstruction of the tissue engineered esophagus. MethodsTwenty-four adult New Zealand rabbits of either gender were randomly divided into the perfusion group (n=16) in which the rabbits′ esophageal muscle and mucosa were decellularized by perfusion, and the normal group (n=8) in which the rabbits were given fresh esophagi without treatment. All the specimens were detected by gross observation, histological observation, scanning electron microscopy (SEM), Immunofluorescence staining detection and MTT toxicity assay. ResultsThe gross observation showed that the perfused esophageal extracellular matrix became mostly white after 2 hours of being perfused and whitely translucent after 16 hours and the vessels were observed clearly. The histological and SEM observation indicated that the perfused esophageal extracellular matrix was characterized by the perfect acellular effect and many ventages, and the porpsity was (88.25±2.37)%. The Immunofluorescence staining detection showed that the MHI-Ⅰ and MHC-Ⅱ were positive in the fresh esophagus but negative in the perfused esophagus. The MTT cytotoxicity assay showed that the relative growth rate (RGR) of mesenchymal stem cells in each experimental group was more than one and the decellularized esophageal matrix reinforced the growth of mesenchymal stem cells instead of adding cytotoxicity to cells. ConclusionThe perfusion method can achieve better acellular effects, low immunogenicity and retain scaffold vitality to the greatest extent in the acellular esophageal scaffold, therefore, it is a better way to construct acellular esophageal scaffold.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.010

*基金項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No:2014JY0160)；四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No:120485)

【中圖分類號(hào)】R762

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A