白細(xì)胞介素-4對(duì)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的影響*

楊　茜，單明慧，楊　明，蘇炳銀，李淑蓉△

1.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都　610500);2.發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (成都　610500)

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白細(xì)胞介素-4對(duì)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的影響*

楊茜1，單明慧2，楊明1，蘇炳銀2，李淑蓉1△

1.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都610500);2.發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (成都610500)

【摘要】目的探討白細(xì)胞介素-4(IL-4)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響。方法選取新生1～2 d的C57乳鼠，取大腦皮層制備原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代3次，檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞純度，IL-4刺激后，用Q-PCR來(lái)檢測(cè)多種炎癥因子的釋放。結(jié)果原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度高達(dá)95%，用IL-4刺激后，抗炎因子ARG1、CD206、TGFβ、IFNβ、IL-10表達(dá)升高，促炎因子TNFα、IL-6表達(dá)降低。結(jié)論IL-4對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞抗炎因子的分泌有促進(jìn)作用，對(duì)促炎因子的分泌有抑制作用。

【關(guān)鍵詞】星形膠質(zhì)細(xì)胞；IL-4；炎癥因子

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣泛的細(xì)胞，在分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元微環(huán)境等各方面均發(fā)揮著重要功能[1-2]，參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程。星形膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)免疫功能中通過(guò)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮重要作用[3]。白細(xì)胞介素-4(IL-4)的作用有刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、CD4+T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞，同時(shí)，在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫和體液免疫中起關(guān)鍵作用。IL-4能刺激小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型分化，產(chǎn)生炎癥抑制因子，也能抑制單核細(xì)胞IL-1、TNF和IL-6的產(chǎn)生。因此，探討IL-4對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞是否具有類(lèi)似對(duì)巨噬細(xì)胞的效應(yīng)，對(duì)了解星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)提供幫助。

1材料與方法

1.1主要試劑與設(shè)備

DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、胰酶(Gibco)、雙抗(Gibco)、IL-4(R&D)、多聚甲醛(Sigma)、BSA(Sigma)、DEPC(Sigma)、GFAP抗體(中杉金橋)、羊抗兔IgG/HRP(中杉金橋)、real-time PCR試劑盒(羅氏)、二氧化碳培養(yǎng)箱(BioRad)、PCR儀(BioRad)、CFX96 real-time system (BioRad)、倒置顯微鏡(Olympus)。

1.2星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)

取出生后1～2 d的C57乳鼠，置于75%乙醇中浸泡3 min，在超凈臺(tái)內(nèi)斷頭，剪開(kāi)頭骨，取出雙側(cè)大腦皮質(zhì)，置于盛有預(yù)冷的D-Hank′S液培養(yǎng)皿內(nèi)，剝離腦膜和血管組織，然后將大腦皮質(zhì)移至另一培養(yǎng)皿內(nèi)，并用D-Hank′S液沖洗2次。在培養(yǎng)皿內(nèi)，將其剪成碎組織塊，移入離心管中，加入適量DMEM/F12培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，產(chǎn)生均一的細(xì)胞懸液。將該細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞懸液均勻布滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部，繼而每瓶中加入約5 mL完全培養(yǎng)基(DMEM/F12，10%FBS，雙抗)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，差速黏附處理30 min，此步用來(lái)去除成纖維細(xì)胞成分。然后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸取細(xì)胞懸液接種至另一培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，培養(yǎng)9～10 d，并在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)并單層鋪滿(mǎn)瓶底后，進(jìn)行消化傳代。

1.3星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

將傳代的細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，孔內(nèi)預(yù)先放涂有多聚賴(lài)氨酸的蓋玻片，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育24 h后，進(jìn)行GFAP免疫組化顯色，用CD11b標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，觀(guān)察星形膠質(zhì)細(xì)胞純度。

1.4IL-4處理星形膠質(zhì)細(xì)胞并用RT-PCR測(cè)定炎癥因子的mRNA水平

不經(jīng)過(guò)任何處理的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞為對(duì)照組，用IL-4(20 ng/mL) 處理24 h的星形膠質(zhì)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，TRIZOL 法抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。根據(jù)羅氏試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Q-PCR， 分別觀(guān)察抑炎因子ARG1、CD206、TGFβ、IFNβ、IL-10以及促炎因子TNFα、IL-6的表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

星形膠質(zhì)細(xì)胞每次傳代時(shí)，取少量細(xì)胞種植于用多聚賴(lài)氨酸包被的玻片上，24 h后于鏡下觀(guān)察細(xì)胞貼壁，多聚甲醛固定，進(jìn)行兔抗GFAP多克隆抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)顯色鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞，為排除小膠質(zhì)細(xì)胞的干擾，也用CD11b進(jìn)行鑒定?？捎^(guān)察到，培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎均為星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1)，小膠質(zhì)細(xì)胞非常少(圖2)。傳代3次后，星形膠質(zhì)細(xì)胞純度計(jì)數(shù)高達(dá)95%。

2.2IL-4處理后對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子mRNA水平的影響

用IL-4(20 ng/mL) 處理原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，可觀(guān)察到，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥抑制因子ARG1、CD206的表達(dá)均升高；而分泌的炎癥促進(jìn)因子TNFα、IL-6則降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)(×20)

圖2原代星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞CD11b表達(dá)(×10)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種損傷都能刺激星型膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖，如病理?yè)p傷、化學(xué)性刺激和疾病等，星形膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)因子，有著保護(hù)作用，但同時(shí)過(guò)度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞也可釋放大量的炎癥因子和神經(jīng)毒素，誘導(dǎo)神經(jīng)元變性[4]，甚至形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)元修復(fù)再生的進(jìn)行。星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)。當(dāng)受到與免疫黏附分子有關(guān)的細(xì)胞接觸和黏附，或受到某些細(xì)胞因子和抗原抗體復(fù)合物刺激后，能分泌眾多活性成分，如 IL-6、IL-1、IL-3、TNF-α、NO、LT、白細(xì)胞三烯 B4、白細(xì)胞三烯 C4 等多種單核細(xì)胞趨化及活化因子[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的免疫細(xì)胞，在IL-4的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞能向M2表型轉(zhuǎn)化，分泌A(yíng)RG1、IL-10、CD206、IFNβ、TGFβ等炎癥抑制因子，以拮抗M1型的小膠質(zhì)細(xì)胞。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，是否也具有類(lèi)似的表現(xiàn)？本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的ARG1、IL-10、CD206、IFNβ、TGFβ等炎癥抑制因子是典型的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的抗炎因子，TNFα是小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)釋放的主要的炎性細(xì)胞因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中起重要作用。TNFα可促進(jìn)星型細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和黏附分子，并且促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6) 的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥的惡性循環(huán)[6]。IL-6具有協(xié)同加強(qiáng)TNFα的作用[7]。IL-4能抑制單核細(xì)胞IL-1、TNF和IL-6的產(chǎn)生，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，IL-4刺激后，同樣能抑制TNFα和IL-6的產(chǎn)生。星形膠質(zhì)細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的來(lái)源大相徑庭，卻在炎癥反應(yīng)方面，與巨噬細(xì)胞來(lái)源的小膠質(zhì)細(xì)胞有著一定的相似度，具體機(jī)制尚有待探討。但不可否認(rèn)的是，IL-4能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌更多的炎癥抑制因子以及能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子，在一定程度上促使星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。

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The Effect of Interleukin-4 on the Release of Inflammatory Factors in Primary Astrocytes

YangXi1,ShanMinghui2,YangMing1,SuBingyin2,LiShurong1△.

1.DepartmentofPathologyandPathophysiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SichuanKeyLaboratoryofDevelopmentandRegeneration,Chengdu610500,China

【Key words】Astrocytes; Interleukin-4; Inflammatory factors

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Interleukin-4 on the release of inflammatory factors in primary astrocytes. MethodsPrimary cultures of astrocytes were isolated from the suckling mouse which was born just for one or two days, and the astrocyte purity was detected after the third passages culture. Interleukin-4 was used to stimulate the astrocytes, and then Q-PCR was employed to detect the release of various inflammatory factors. ResultsThe purity of the primary astrocytes was up to 95%. The expressions of anti-inflammatory factors such as ARG1, CD206, TGF β, IFN β and IL-10 increased, while the expressions of pro-inflammatory cytokines such as TNFα and IL-6 decreased. ConclusionInterleukin-4 plays an active role in promoting anti-inflammatory cytokines and inhibiting pro-inflammatory cytokines in primary astrocytes.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.004

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No:31371215；31540032)

通信作者：△李淑蓉，E-mail：lsrsus@163.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R364

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1057.022.html

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