基于氣相色譜-質譜聯用技術的痛風病人血清代謝特征分析

陳　嬌，周　佳，韋雙雙，李海昌，溫成平*，許國旺

(1.浙江中醫(yī)藥大學　基礎醫(yī)學院，中醫(yī)臨床基礎研究所，浙江　杭州　310053；

2.中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧　大連　116023)

?

基于氣相色譜-質譜聯用技術的痛風病人血清代謝特征分析

陳嬌1，周佳1，韋雙雙1，李海昌1，溫成平1*，許國旺2*

(1.浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，中醫(yī)臨床基礎研究所，浙江杭州310053；

2.中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧大連116023)

摘要：痛風是一組僅見于人類的異質性疾病，隨著時間的推移，將導致慢性關節(jié)炎并逐漸致殘。該研究將基于氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)的代謝組學方法應用于痛風病人的血清代謝特征分析。首先利用GC-MS獲得痛風病人和健康人的血清代謝指紋圖譜，采用多變量統(tǒng)計分析對所得數據進行分析。主成分分析(PCA)得分圖顯示，痛風病人與健康人的血清代謝譜有差異。通過偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)對樣品進行進一步分型，根據模型的變量重要性因子(VIP值)及非參數檢驗結果篩選差異代謝物。共篩選出43種可能與痛風相關的代謝物，并對其中22個變量進行結構鑒定，主要包括丙二醇、2,3-二羥基丁酸、2,4-二羥基丁酸、赤蘚糖醇、蘇糖醇、蘇糖酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖酸、肌醇、次黃嘌呤、尿酸、尿苷、3-羥基-3-甲基丁酸、鳥氨酸、吲哚-3-乳酸、單乙醇胺、甘油、甘油酸、月桂酸及亞油酸等代謝物。與健康人相比，痛風病人的糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝及脂類代謝均發(fā)生了明顯的紊亂。這些結果將為痛風臨床診斷及治療提供重要依據。

關鍵詞：痛風；代謝組學；氣相色譜-質譜聯用；血清

痛風曾被稱作“病中之王”，其與其他疾病的高并發(fā)率及日漸升高的死亡率，已經使之成為當今世界困擾人類的主要疾病之一[1]。痛風是由于尿酸或尿酸鹽結晶在細胞外液達到過飽和狀態(tài)導致晶體沉積而引發(fā)的一類以急性反復性發(fā)作的晶體性關節(jié)炎為臨床特征的嘌呤代謝紊亂疾病[2]。不同人群的總體患病率約為1.4%[3]，且在世界范圍內有增加的趨勢[4]，已成為男性中最常見的關節(jié)炎癥疾病[5]。

痛風是人類認識的最古老疾病之一，在與之斗爭的漫長歲月中，人類對它有著深刻的認識。但隨著臨床經驗的積累及新技術的應用，新的問題逐漸顯現[6]。1977年美國風濕病學會制定的痛風診斷標準，將高尿酸(男性>7 mg/dL,女性> 6 mg/dL)作為唯一的血清學診斷指標[7]，但有證據顯示將尿酸水平作為痛風的診斷標志易導致不確定診斷[8]。疾病分期對于正確認識痛風及臨床指導十分重要，目前普遍根據自然病程進行分期，但無法體現痛風不同階段的病理基礎[9]；而且這種分期方法側重于將痛風定義為反復發(fā)作的急性爆發(fā)性疾病而忽略了晶體慢性沉積的影響，將會給痛風的有效管理和治療造成一定的阻礙[10]?，F代醫(yī)學雖然對痛風的病因機制了解得較為深入，但是臨床仍存在治療不當的問題[4]。因此，需要對痛風這一古老疾病進行新的更深入的研究，從而更好地指導臨床診斷及治療。

代謝組學，作為系統(tǒng)生物學的一個分支，是通過考察機體受到刺激或擾動后體內小分子代謝物的變化來研究生物體系的一門科學[11-12]。主要研究反映病理生理等刺激和擾動引發(fā)的機體內源性代謝物的變化，在疾病診斷、發(fā)病機制探討及藥效學評價等方面具有極大的優(yōu)勢[13-15]?；?H-核磁共振(NMR)的關節(jié)液代謝組學方法已被用于包括痛風及類風濕性關節(jié)炎在內的各類關節(jié)炎的區(qū)分[16]。也有學者基于高效液相色譜-二極管陣列法(HPLC-DAD)的代謝組學方法對痛風患者血清和尿液代謝物變化進行研究[17]。但較少有報道將氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)應用于痛風的代謝組學研究。GC-MS是應用非常廣泛的一種代謝組學分析方法，其高靈敏度及高分離效率非常適合進行全組分分析。與液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)相比，GC-MS無明顯的離子抑制效應[18]，而且在色譜分析及質譜碎片的重復性方面有明顯優(yōu)勢。

本研究擬用GC-MS方法對痛風病人的血清代謝輪廓進行研究，并利用多變量統(tǒng)計分析對代謝物進行模式識別，分析痛風病人及正常人的血清代謝指紋譜差異，篩選差異代謝物并加以鑒定，尋找痛風病人體內潛在的代謝變化及其相關代謝途徑，并進行相關討論。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

甲醇(色譜純，Tedia公司，Fairfield,OH,USA)；甲氧胺、N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、吡啶及定性所用標準樣品(Sigma-Aldrich公司，St.Louis,MO,USA)；超純水由Milli-Q 系統(tǒng)(Millipore Corp,Millipore,MA,USA)提供。

Agilent 7890/5975C GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)；冷凍離心濃縮儀(Labconco CentriVap System,Labconco.Kansas,MO,USA)。

1.2樣品采集及預處理

血清樣本包括29例痛風患者及26例健康人對照組。痛風患者樣本納入標準符合1977年美國風濕病學會痛風診斷標準，平均年齡為50.3±11.4歲，血尿酸的平均值為514.3±102.7 μmol/L。所有樣本采集后置于-80 ℃保存。

血清樣本處理方法：分析時，先將樣本置于室溫下解凍并混勻；50 μL 血清中加入200 μL冷甲醇(此操作在冰水浴中進行)，渦旋30 s后離心10 min(4 ℃,12 000 g/min)；取上清液凍干，分析前復溶于50 μL甲氧胺吡啶(20 mg/mL)中，在40 ℃水浴中肟化反應90 min；再加入40 μL MSTFA，40 ℃水浴下衍生反應60 min。質量控制(QC)樣品制備：將進行分析的全部血清樣本取等量混勻后，按照上述方法進行相同處理，得到QC樣品。

1.3GC-MS分析條件

采用DB-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,J & W Scientific,Folsom,CA,USA)進行分離；進樣體積為1 μL，分流比為10∶1；載氣為氦氣(99.999 6%)，流速為1.2 mL/min；柱溫箱升溫程序：初始70 ℃保持3 min后，以5 ℃/min升溫至300 ℃，并保持5 min；進樣口溫度為300 ℃，傳輸線溫度為280 ℃；電子轟擊離子(EI)源溫度為230 ℃；溶劑延遲時間為4.8 min；質譜掃描范圍m/z33~600；分析過程中隨機安排樣本進樣順序，每隔10個樣本加入1個QC樣品檢測。

1.4數據處理

利用AMDIS 2.62軟件(NIST,Boulder,CO,USA)對GC-MS得到的代謝譜圖進行峰識別及重復峰解析，在MSD工作站(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)進行積分，得到由質荷比、保留時間及對應峰面積組成的數據矩陣。經方差歸一化標度(UV Scaling)后，用SIMCA-P 11.0(Umetrics AB,Umea°,Sweden)軟件對樣本進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)。根據VIP值篩選差異代謝物，并利用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件(SPSS 21,International Business Machines Cor.,Armonk,USA)進行t檢驗，顯著性水平設為p<0.05；依據所獲得的質譜圖，利用NIST05數據庫(National Institute of Standards and Technology,Gaithersburg MD,USA)對篩選的差異代謝物進行結構鑒定，最后用標準品對鑒定結果進行驗證。

2結果與討論

2.1代謝組學方法考察

圖1　QC樣品的PCA分析結果Fig.1　The PCA score plot of QC samples

圖2　痛風病人(A)和健康人(B)血清的典型總離子流色譜圖Fig.2　Representative total ion current(TIC)chromatograms of serum from patients with gout(A)and healthy controls(B)

經去卷積后，共檢測到324個代謝物信息。為了考察分析方法的穩(wěn)定性，在分析序列中每隔6個樣本加入1個QC樣品。對QC樣品進行PCA分析(如圖1所示)，所有QC樣品均在2倍SD范圍內，說明該方法的重復性好，能夠滿足代謝組學的分析要求。

2.2血清代謝組學分析

對痛風病人和健康人對照組的血清樣本進行GC-MS分析，得到的典型總離子流色譜圖如圖2所示。經過修正80%規(guī)則[19]去除缺失值后，共得到197個變量進行下一步的統(tǒng)計學分析。

PCA是一種無監(jiān)督的模式識別分析方法，可在多維空間對樣本間差異進行直觀顯示。如圖3A所示，在PCA模型中，痛風病人和健康人兩組樣品的代謝表型有一定的區(qū)分，說明痛風病人和健康人的血清代謝指紋存在差異。為了更好地對痛風病人與健康人的血清代謝譜進行分型并篩選差異代謝物，對代謝數據進行PLS-DA分析。PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法，目的是建立類別間的數學模型，使樣本間達到最大分離。建立的模型解釋能力參數R2Y=0.809，預測能力參數Q2=0.531，置換檢驗結果顯示該模型不存在過擬合的現象。圖3B是PLS-DA得分圖，可以看到痛風病人與健康人的血清代謝差異區(qū)分更加明顯。

根據PLS-DA模型的VIP值來篩選差異代謝物，VIP>1的變量被認為對分類起著關鍵作用(圖3C)。對篩選的差異代謝物進行顯著性檢驗，同時符合VIP>1且p<0.05的43個變量被認為與痛風有潛在關聯。利用NIST05數據庫對變量可能結構進行鑒定，并用標準品對鑒定結果的可靠性進行驗證，最終共鑒定出22種代謝物(見表1)。與健康人對照組相比，痛風病人的碳水化合物代謝(丙二醇、2,3-二羥基丁酸、2,4-二羥基丁酸、赤蘚糖醇、蘇糖醇、蘇糖酸、阿拉伯糖醇、D-葡萄糖酸、肌醇)、核苷酸代謝(次黃嘌呤、尿酸、尿苷)及氨基酸代謝(3-羥基-3-甲基丁酸、鳥氨酸、吲哚-3-乳酸)相關物質的水平均顯著上調；脂類代謝(單乙醇胺、甘油、甘油酸、月桂酸及亞油酸)水平及甘氨酸、亞?；撬岬难搴匡@著下降。

2.3痛風相關代謝途徑的變化

痛風是由于嘌呤類物質代謝紊亂，導致血尿酸水平升高而引發(fā)尿酸鹽晶體沉積所致的一組代謝性疾病。對痛風病人體內代謝途徑變化的研究將為痛風的診斷及治療提供重要依據。本研究結果(圖4)顯示，與健康人相比，痛風患者糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝及脂類代謝均發(fā)生了一定程度的紊亂。

本研究發(fā)現在痛風病人的血清中尿酸及次黃嘌呤水平發(fā)生了顯著升高，也有研究證明這兩項水平升高是痛風的典型特征[20]。尿酸鹽合成過多是繼發(fā)性痛風的重要病因之一。人尿酸合成的速度主要取決于細胞內磷酸核糖焦磷酸(PRPP)的濃度。尿苷是PRPP的下游產物，D-葡萄糖酸是葡萄糖氧化的產物，能夠轉化為PRPP，二者在本研究中均被檢測到顯著上調，說明痛風病人體內尿酸的合成速度加快。另外，鳥氨酸的顯著升高說明痛風病人的尿素循環(huán)也發(fā)生異常。

本研究中，痛風病人血清中多種有機酸的水平明顯上調，其中3-羥基-3-甲基丁酸(HMB)是亮氨酸的活性代謝產物，動物研究發(fā)現膳食補充HMB會導致膠原沉積，臨床樣本實驗也證明了這一點，且主要表現為羥脯氨酸含量升高[21]。血清中羥脯氨酸含量上升則與體內結締組織增生或破壞密切相關，而痛風的主要特征正是尿酸鹽結晶在關節(jié)、腎及周圍結締組織中沉積引發(fā)炎癥。2,3-二羥基丁酸是蘇氨酸的代謝產物[22]。蘇氨酸是人體必需氨基酸，是一種生糖氨基酸，而亮氨酸作為支鏈氨基酸，在機體能量供應中也起著重要作用，它們下游產物的增加提示痛風病人能量消耗可能增加。研究表明，炎癥和氧化應激在高尿酸血癥的形成中起重要作用[23]。蘇糖酸是抗壞血酸的主要代謝產物，而L-抗壞血酸是反映機體氧化應激狀態(tài)的代謝物[24]；本研究中蘇糖酸呈現明顯的上升趨勢，說明痛風與氧化應激密切相關。肌醇與細胞內脂肪酸的氧化有關，所以肌醇的升高可能會加劇能量代謝和脂代謝異常[25]。

表1　鑒定得到的痛風病人和健康人的血清差異代謝物

*:p<0.05,** :p<0.01

圖4　重要差異代謝物在相關代謝通路中的變化

一碳單位是嘌呤、嘧啶的合成原料，甘氨酸分解代謝是體內一碳單位的主要來源。甘氨酸水平的下降可能是由于甘氨酸分解代謝加強，導致痛風病人體內嘌呤合成增加，引發(fā)嘌呤代謝紊亂。肥胖是痛風發(fā)病的一個重要相關因素，在肥胖癥患者體內能夠發(fā)現?；撬崴浇档蚚26]。有研究進一步發(fā)現?；撬嵊锌寡譡27]、抗氧化[28]及改善胰島素敏感性[29]的作用，在本研究中明顯下降的亞?；撬崾桥；撬岷铣傻那绑w物質，這部分解釋了痛風患者并發(fā)肥胖及糖尿病的原因。甘油、甘油酸、月桂酸及亞油酸的顯著下調則說明痛風病人體內脂類代謝水平下降。

3結論

利用GC-MS對痛風病人及健康人的血清進行了代謝輪廓分析。利用多變量統(tǒng)計學分析對兩組樣本進行分析，結果顯示痛風病人與健康人的血清代謝圖譜有明顯的差異，并鑒定出22個差異代謝物。與健康人相比，痛風病人核苷酸代謝、糖代謝及氨基酸代謝呈現顯著的上升趨勢，而脂類代謝則有明顯下降。本研究證明GC-MS是進行疾病血清特征分析的有效手段，鑒定的差異代謝物有望成為潛在的生物標志物，并為痛風的臨床診斷及機制的深入研究提供參考依據。

參考文獻：

[1]Robinson P C,Dalbeth N.Expert.Opin.Pharmacother,2015,16(4):533-546.

[2]Sarawate C A,Patel P A,Schumacher H R,Yang W Y,Brewer K K,Bakst A W.J.Clin.Rheumatol.,2006,12(2):61-65.

[3]Annemans L,Spaepen E,Gaskin M,Bonnemaire M,Malier V,Gilbert T,Nuki G.AnnRheumDis.,2008,67(7):960-966.

[4]Crittenden D B,Pillinger M H.Annu.Rev.Med.,2013,64:325-337.

[5]Mikuls T R,Saag K G.Curr.Opin.Rheumatol.,2006,18(2):199-203.

[6]Wu D H.Chin.J.Rheumatol.(吳東海.中華風濕病學雜志),2015,19(1):1-3.

[7]Wallace S L,Robinson H,Masi A T,Decker J L,McCarty D J,Yu T F.ArthritisRheum.,1977,20(3):895-900.

[8]Guggi V,Calame L,Gerster J C.JointBoneSpine,2002,69(1):58-61.

[9]Bardin T,Richette P.Curr.Opin.Rheumatol.,2014,26(2):186-191.

[10]Harrold L R,Mazor K M,Negron A,Ogarek J,Firneno C,Yood R A.Rheumatology(Oxford),2013,52(9):1623-1629.

[11]Madsen R,Lundstedt T,Trygg J.Anal.Chim.Acta,2010,659(1/2):23-33.

[12]Priori R,Scrivo R,Brandt J,Valerio M,Casadei L,Valesini G,Manetti C.AutoimmunRev.,2013,12(10):1022-1030.

[13]Williamson M P,Humm G,Crisp A J.Br.J.Rheumatol.,1989,28(1):23-27.

[14]He H B,Ren X B,Wang X Y,Shi X Z,Wang X L,Ding Z J,Gao P,Xu G W.J.Pharm.Biomed.Anal.,2012,59:130-137.

[15]Gu Y,Lu C,Zha Q L,Kong H W,Lu X,Lu A P,Xu G W.Mol.Biosyst.,2012,8(5):1535-1543.

[16]Hügle T,Kovacs H,Heijnen I A,Daikeler T,Baisch U,Hicks J M,Valderrabano V.Clin.Exp.Rheumatol.,2012,30:240-245.

[17]Liu Y,Sun X M,Di D L,Quan J X,Zhang J,Yang X F.Clin.Chim.Acta,2011,412(23/24):2132-2140.

[18]Koek M M,Jellema R H,van der Greef J,Tas A C,Hankemeier T.Metabolomics,2011,7(3):307-328.

[19]Smilde A K,van der Werf M J,Bijlsma S,Werff v d,van der Vat B J,Jellema R H.Anal.Chem.,2005,77(20):6729-6736.

[20]Zhu S Y,Zhou Y D,Du G H.HeraldMed.(朱深銀,周遠大,杜冠華.醫(yī)藥導報),2006,8(25):803-806.

[21]Williams J Z,Abumrad N,Barbul A.Ann.Surg.,2002,236(3):369-375.

[22]Thompson J A,Markey S P,Fennessey P V.Clin.Chem.,1975,21(13):1892-1898.

[23]Violi F,Cangemi R,Brunelli A.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,2005,25(4):e37;author reply e37.

[24]Vincent A M,Russell J W,Low P,Feldman E L.Endocr.Rev.,2004,25(4):612-628.

[25]He H B,Shi X Z,Chen J,Gao P,Lei Y Y,Xu G W.Chin.J.Chromatogr.(和紅兵,石先哲,陳靜,高鵬,雷雅燕,許國旺.色譜),2012,30(3):245-251.

[26]Jeevanandam M,Ramias L,Schiller W R.Metabolism,1991,40(4):385-390.

[27]Marcinkiewicz J,Grabowska A,Bereta J,Stelmaszynska T.J.Leukoc.Biol.,1995,58(6):667-674.

[28]Hwang D F,Hour J L,Cheng H M.FoodChem.Toxicol.,2000,38(7):585-591.

[29]Haber C A,Lam T K,Yu Z,Gupta N,Goh T,Bogdanovic E,Giacca A,Fantus I G.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.,2003,285(4):E744-E753.

Analysis of Serum Metabolic Characteristics in Patients with Gout Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry

CHEN Jiao1,ZHOU Jia1,WEI Shuang-shuang1,LI Hai-chang1,WEN Cheng-ping1*，XU Guo-wang2*

(1.College of Basic Medical,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou310053,China;2.CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian116023,China)

Abstract：Gout is a highly heterogeneous disease which occurs only in human being,it would cause gouty arthritis,and even lead to disability.There could be obvious alterations of metabolites in the serum of the patient with gout,and the discovery of metabolic characteristics may be helpful for the clinical diagnosis and treatment of gout.A gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) based metabolic profiling method was employed to analyze the distinctive metabolic patterns of serum in gout patients.Serum samples collected from 29 gout patients and 26 healthy controls were analyzed.The principal component analysis(PCA) and partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) were used to assess the metabolic data.Marked differences between gout patients and healthy controls were shown in PCA score plot.Variable importance for project values(VIP) and Student’s t-test were combined to pick out the significant metabolic changes.Compared with that of the control group,the serum metabolic characteristics of the gout group were featured by increased levels of metabolites related to nucleotide metabolism(hypoxanthine,uric acid and uridine),carbohydrate metabolism(2,3-dihydroxybutyrate,D-threitol,D-gluconic acid,myo-inositol,etc.) and amino acid metabolism(3-hydroxy-3-methylbutyrate,L-ornithine and indole-3-lactic acid),decreased levels of lipids(monoethanolamine,glycerol,glyceric acid,etc.),glycine and hypotaurine.The preliminary results suggest that GC-MS based metabolic profiling method appears to be a useful tool in the exploration of the serum metabolic characteristics of gout.These revealed disease-associated metabolic perturbations involved in multiple metabolic pathways including purine metabolism and the urea cycle,which could help to elucidate the pathogenesis of gout and provide a potential aid for the accurate diagnosis or treatment of gout.

Key words：gout；metabolomics；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；serum

中圖分類號：O657.63;S852.5

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)02-0137-06

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.003

*通訊作者：許國旺，博士，研究員，研究方向：代謝組學分析技術平臺及其在疾病、中藥、植物表型、食品安全等方面應用的研究，Tel：0411-84379530,E-mail：xugw@dicp.ac.cn

基金項目：浙江省科技廳計劃項目-分析測試科技計劃項目(2015C37045)；國家自然科學基金青年科學基金項目(81403269)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃資助項目973計劃(2014CB543001)

收稿日期：2015-08-17；修回日期：2015-10-19

溫成平，博士，教授，研究方向：免疫風濕病的中醫(yī)臨床基礎治法與臨床研究,Tel：0571-86613131,E-mail：wengcp@163.com