胰島素抵抗肝癌細胞IGF-1R/NF-κB表達及多藥耐藥機制研究*

王以浪，印滇，楊莉，張亮，姚登福

·原發(fā)性肝癌·

胰島素抵抗肝癌細胞IGF-1R/NF-κB表達及多藥耐藥機制研究*

王以浪，印滇，楊莉，張亮，姚登福

目的探討胰島素抵抗（IR）肝癌細胞胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）和核因子-κB（NF-κB）表達變化及多藥耐藥（MDR）發(fā)生機制。方法采用高濃度胰島素誘導人肝癌細胞（HepG2和HepG2.2.15）建立胰島素抵抗（IR）細胞模型。采用Western blot法檢測胰島素受體（InsR）、IGF-1R、NF-κB和P-糖蛋白（P-gp）表達變化。使用流式細胞儀（Annexin V-FITC法）檢測阿霉素對細胞凋亡的影響。結果分別用100 nmol/L和1 000 nmol/L胰島素培養(yǎng)HepG2和HepG2.2.15細胞48 h，成功建立IR肝癌細胞模型；IR肝癌細胞IGF-1R、NF-κB、P-gp表達上調(diào)，而InsR表達下調(diào)；應用25μg/mL阿霉素作用細胞24 h后，IR-HepG2細胞組凋亡率（31.1%±1.9%）顯著低于HepG2細胞組【（49.7%±2.2%），P＜0.01】，IR-HepG2.2.15細胞凋亡率【（20.1±1.7）%】顯著低于HepG2.2.15細胞【（33.8±1.8）%，P＜0.01】；HepG2.2.15和IR-HepG2.2.15細胞凋亡率分別較HepG2和IR-HepG2細胞顯著降低（P＜0.01）。結論IGF-1R/NF-κB/P-gp過表達可能介導IR肝癌細胞對阿霉素的多藥耐藥。

HepG2細胞；胰島素抵抗；胰島素樣生長因子1受體；核因子-κB；P糖蛋白；多藥耐藥

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一。我國HBV相關性HCC約占80%，而代謝異常也是重要的致病因素[1-2]。近來研究顯示，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者HCC發(fā)病率明顯增高[3-4]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指各種原因使胰島素靶器官（肝、脂肪、骨骼肌等）對胰島素的敏感性降低，導致β細胞代償性分泌過多胰島素，出現(xiàn)高胰島素血癥。IR是T2DM發(fā)病的核心環(huán)節(jié)[5]。胰島素與胰島素受體（insulin receptor，Ins R）和胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）結合，介導下游信號通路傳遞，并與HCC發(fā)生關系密切[6]。P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表達上調(diào)與腫瘤多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）表型形成密切相關[7]。我們前期研究提示核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）可誘導肝癌細胞P-gp過表達及MDR形成,而抑制NF-κB表達可以逆轉MDR[8-10]。有研究顯示，胰島素可誘導多種細胞P-gp表達上調(diào)，介導MDR[11-12]，但胰島素能否誘導人肝癌細胞多藥耐藥以及其作用機制尚不清楚。本研究采用高濃度胰島素加入細胞培養(yǎng)液，誘導人肝癌細胞（HepG2和HepG2.2.15）培養(yǎng)，建立肝癌細胞IR模型，觀察了細胞Ins R、IGF-1R、NF-κB和P-gp等表達的變化，以探討IR肝癌細胞對阿霉素多藥耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人肝癌細胞HepG2和整合HBV DNA的HepG2.2.15細胞株購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。胰島素、瓊脂糖、溴化乙錠、二乙基焦炭酸、無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基（Sigma公司）；新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；鼠抗人InsR-β抗體（ab983）、兔抗人InsR-β磷酸化（Y1361）抗體（ab60946）、兔抗人IGF-1R抗體（ab39675）、抗IGF-1R磷酸化（Y1161）抗體（ab39398）、兔抗人p65磷酸化（S536）抗體（ab86299）、兔抗人P-gp抗體（ab10347，美國Abcam公司）；兔抗人核因子-κB抑制蛋白α（IκBα）抗體（SAB4501995，Sigma公司），羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（美國Jackson公司）。

1.2 IR肝癌細胞模型建立取HepG2和HepG2. 2.15細胞，復蘇后用含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞貼壁長滿后，傾去培養(yǎng)基,用0.25%胰蛋白酶消化。根據(jù)細胞生長情況傳代。取對數(shù)生長期細胞接種于無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，待細胞完全貼壁，分別加入1、10、100、1 000和10 000 nmol/L的胰島素，孵育24 h、48 h和60 h，用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)上清液葡萄糖含量。計算空白組與不同胰島素濃度組細胞葡萄糖消耗量差值，選擇葡萄糖消耗量差值最小，即達到胰島素抵抗最高狀態(tài)的胰島素作用濃度為胰島素最佳濃度。采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定各組細胞活性。

1.3 細胞蛋白表達檢測分別將各組細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，經(jīng)PBS洗滌，胰酶消化，1000 r/m離心5 min，收集細胞，棄上清液，冰上操作:按照1×106個細胞加細胞裂解液100 μl和PMSF 1μl裂解細胞，冰上靜置10 min，4℃，12000 r/m離心15 min，收集上清液，以BCA法測定蛋白濃度。采用Western blot法檢測蛋白表達，取蛋白樣品20μg，加至0.5 mL EP管內(nèi)，加上樣緩沖液按比例稀釋蛋白，混勻后于沸水中煮5 min，使蛋白變性。制作10%分離膠和4%濃縮膠。向電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，每道上樣蛋白樣品20μg，先80 V×35 min，然后改為100 V×60 min。在電泳結束后，以恒流300 mA×110 min轉膜。轉膜結束后，以TBS-T洗滌緩沖液脫色搖床上漂洗5 min，2次，TBS洗5 min。將膜轉移至封閉液，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。取出膜，用TBS-T漂洗10 min，2次，TBS洗滌10 min。然后，加入一抗，4℃過夜，TBS-T漂洗5 min，2次，TBS洗5 min，加入二抗，室溫孵育2 h，漂洗、DAB顯色并攝像。

1.4 細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC法，取25μg/mL阿霉素加入各組肝癌細胞培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)24 h。分別收集各組細胞，離心，吸凈上清，PBS洗滌細胞2次。加入Annexin V-FITC結合液195μl，輕輕重懸細胞，再加入Annexin V-FITC 5 μl，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。離心，棄上清，加入Annexin V-FITC結合液190μl，輕輕重懸細胞。加入PI染色液10μl，輕輕混勻，冰浴、避光放置。使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，每組檢測3次，取平均值。

2 結果

2.1 胰島素對肝癌細胞存活率的影響應用不同濃度的胰島素作用HepG2和HepG2.2.15細胞不同時間后，各濃度組胰島素均有抑制肝癌細胞增殖的作用。與1 000 nmol/L胰島素組比，10 000 nmol/L胰島素作用HepG2（t=5.57，P＜0.01）和HepG2.2.15細胞（t=7.25，P＜0.01）24 h，對細胞活性抑制明顯增強，差別有統(tǒng)計學意義（圖1）。

圖1 胰島素對肝癌細胞存活率的影響A：與1 000nmol/L胰島素作用HepG2細胞24 h組比，#P＝0.02；B：與1 000nmol/L胰島素作用HepG2.2.15細胞24 h組比，#P＝0.01

2.2 IR肝癌細胞模型建立成功100 nmol/L胰島素作用HepG2細胞24 h、48 h和72 h，培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度分別為（9.8±0.12）mmol/L、（9.5± 0.25）mmol/L和（8.9±0.21）mmol/L，作用48 h細胞培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度與作用24 h比無顯著性差異（t=1.87，P＝0.13），作用72 h培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度較作用48 h無明顯下降（t=3.18，P＝0.03，圖2A）；1 000 nmol/L濃度胰島素作用HepG2.2.15細胞24 h、48 h和72 h，培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度分別為（9.6±0.17）mmol/L、（9.2±0.20）mmol/L和（8.8± 0.18）mmol/L，作用48 h細胞培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度與作用24 h比無顯著性差異（t=2.64，P＝0.06），作用72 h培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度較作用48 h無明顯下降（t=2.57，P＝0.06，圖2B）；100 nmol/L和1 000nmol/L胰島素分別作用HepG2細胞和HepG2.2.15細胞48 h，細胞培養(yǎng)上清液葡萄糖消耗量較作用24 h無顯著降低，形成胰島素抵抗，并能維持72 h。

圖2 不同濃度胰島素誘導肝癌細胞葡萄糖消耗變化（A、B）與0 h組比，#P＞0.05；與24 h組比，△P＜0.05；與48 h組比，*P＜0.05

2.3 IR肝癌細胞IsnR-β和IGF-1R表達變化與HepG2細胞和HepG2.2.15細胞比，胰島素誘導后形成的IR-HepG2細胞和IR-HepG2.2.15細胞IsnR-β和P-IsnR-β表達下調(diào)，而IGF-1R和P-IGF-1R表達上調(diào)（圖3）。

圖3 IR肝癌細胞蛋白表達變化IR肝癌細胞IsnR-β蛋白表達對照組肝癌細胞下調(diào)，而IGF-1R表達上調(diào)

2.4 IR肝癌細胞P-p65、IκBα和P-gp表達變化與HepG2細胞和HepG2.2.15細胞比，IR-HepG2細胞和IR-HepG2.2.15細胞P-p65和P-gp表達上調(diào)，而IκBα表達下調(diào)；整合HBV DNA的HepG2.

2.15 和IR-HepG2.2.15細胞P-gp表達較HepG2和IR-HepG2增強（圖4）。

圖4 IR肝癌細胞P-p65和P-gp表達的變化IR肝癌細胞P-p65和P-gp表達較對照組肝癌細胞上調(diào)，而IκBα表達下調(diào)

2.5 IR肝癌細胞耐受阿霉素誘導凋亡在25μg/ mL阿霉素作用細胞24 h后，IR-HepG2細胞凋亡率為（31.1±1.9）%，顯著低于HepG2細胞的【（49.7± 2.2）%，P＜0.01】；IR-HepG2.2.15細胞凋亡率為（20.1± 1.7）%，顯著低于HepG2.2.15細胞組的【（33.8± 1.8）%，P＜0.01】；HepG2.2.15和IR-HepG2.2.15細胞凋亡率分別較HepG2和IR-HepG2細胞顯著降低（P＜0.01，圖5）。

圖5 肝癌細胞凋亡率的變化（A、B）經(jīng)阿霉素誘導后，IR肝癌細胞凋亡率顯著低于對照組肝癌細胞

3 討論

IR是T2DM發(fā)病的主要始動因素，也是代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)和基本致病基礎。T2DM與HCC發(fā)生、發(fā)展、治療和預后密切相關[13]。IR和高胰島素血癥介導了T2DM和代謝綜合征與惡性腫瘤發(fā)病之間的橋梁關系。有研究表明T2DM與許多實體惡性腫瘤密切相關，尤其是HCC[14，15]。意大利學者的一項研究表明有31.2%HCC患者患有T2DM，而正常人群T2DM患病率僅為12.7%。一項薈萃分析顯示患有T2DM患者患HCC的風險是正常人的2.31倍，其中使用外源性胰島素治療的糖尿病患者患HCC風險是不使用胰島素患者的4倍，而死亡風險增加1.43倍，提示胰島素不僅參與HCC的形成，而且通過增加化療藥物的多藥耐藥而影響HCC患者的治療效果。由此可見，T2DM是HCC的獨立危險因素，其中高胰島素血癥可能起了重要作用[16，17]。

胰島素、IsnR、IGF-1R和下游靶基因構成胰島素信號軸，介導機體病理生理過程[18]。其中IGF-1R與惡性腫瘤密切相關，其在HCC表達上調(diào)，阻斷IGF-1R使肝癌細胞生長受抑、誘導細胞凋亡，增加放、化療敏感性[19，20]。本研究用高濃度胰島素誘導肝癌細胞，在胰島素作用肝癌細胞后24 h即能誘導肝癌細胞形成IR，并能維持72 h。經(jīng)Western blot檢測顯示IsnR和磷酸化IsnR表達下調(diào)，抑制細胞對葡萄糖消耗，符合胰島素抵抗特征。但作為胰島素的另一受體IGF-1R和磷酸化IGF-1R表達卻明顯上調(diào)，推測其可能介導了胰島素誘導的細胞分裂、增殖和凋亡抑制等。

MDR基因編碼的細胞膜P-gp是一種ATP依賴的流出泵，一旦與抗腫瘤藥物結合，通過ATP提供能量就可將藥物從細胞內(nèi)泵出細胞外，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。惡性腫瘤細胞往往高表達P-gp[21]。有研究顯示胰島素可誘導P-gp表達，其具體機制尚不明確[22，23]。NF-κB是首先在B細胞中發(fā)現(xiàn)的一種結合于免疫球蛋白κ輕鏈增強子上的核蛋白，有RelA（p65）、RelB、C-Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）五個亞基，亞基間可形成同源或異源二聚體，其中p50/p65二聚體最常見。NF-κB是胰島素信號通路下游重要靶點，我們前期研究顯示抑制NF-κB后HepG2細胞P-gp表達顯著下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)IR肝癌細胞NF-κB亞單位磷酸化的p-65（P-p65）和多P-gp表達較肝癌細胞顯著增強；采用流式細胞儀檢測經(jīng)阿霉素誘導的細胞凋亡顯示阿霉素誘導的IR肝癌細胞凋亡率較肝癌細胞明顯減低。上述結果提示NF-κB可能介導了胰島素誘導的肝癌細胞P-gp表達及對阿霉素的多藥耐藥。

HBV相關性肝癌高耐藥性是HCC化療不敏感的主要原因。本研究提示整合HBV DNA的HepG2.2.15細胞P-gp蛋白表達較HepG2細胞增高，對阿霉素有更高的耐藥性，但其具體機制尚不清楚。

本研究以高濃度胰島素誘導肝癌細胞形成IR肝癌細胞模型，研究提示NF-κB介導了胰島素/IGF-1R誘導肝癌細胞P-gp表達及對阿霉素的多藥耐藥，推測HBV可能與肝癌細胞多藥耐藥相關，這些結果可能為肝癌的耐藥逆轉提供了潛在的靶點。

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（收稿：2016-06-20）

（本文編輯:陳從新）

Exp ression of IGF-1R/NF-kappa B and multi-d rug resistance in insulin resistance-HepG2 and HepG2. 2.15 cells in vitro

Wang Yilang，Yin Dian，Yang Li，et al.
Department of Oncology，Research Center of Clinical Medicine，F(xiàn)irst People's Hospital A ffiliated to Nantong University，Nantong，226001，Jiangsu Province，China Corresponding author:Yao Dengfu，E-mail:yaodf@ahnmc.com

Ob jective To investigate the expression of insulin-like growth factor 1 receptor（IGF-1R），nuclear factor-κB（NF-κB）and the mechanism of multi-drug resistance（MDR）in insulin resistance（IR）-hepatoma cells in vitro.Methods The human hepatoma cells（HepG2 and HepG2.2.15）were induced by high concentration of insulin to establish a insulin resistance model.The expression of insulin receptor（InsR），IGF-1R，NF kappa B，P glycoprotein（P-gp）were detected by Western bloting and the effect of adriamycin on cell apoptosis were detected by flow cytometry（annexin V-FITC）.Resu lts IR model of hepatoma cells were established successfully by subjecting the HepG2 and HepG2.2.15 cells to 100 nmol/L and 1 000 n mol/L insulin respectively for 48 hours.The expression of IGF-1R，NF-kappa B and P-gp were up-regulated in IR hepatoma cells，while the InsR expression was down-regulated；After treatment of the two cells with 25μg/m l doxorubicin for 24 hours，the apoptosis rate of IR-HpeG 2 cells（31.1%±1.9%）was significantly lower than HepG2 cells[（49.7± 2.2）%，P＜0.01]，and the apoptosis rate of IR-HepG2.2.15 cells（20.1±1.7）%was significantly lower than HepG2.2.15 cells[（33.8±1.8）%，P＜0.01]；The apoptotic rates of HepG2.2.15 or IR-HepG2.2.15 cells were significantly lower than HepG2 or IR-HepG2 cells（P＜0.01），respectively.Conclusion The expression of IGF-1R，NF-kappa B and P-gp are up-regulated in IR-hepatoma cells，which might induce the MDR to adriamycin.

HepG2 cells；Insulin resistance；Insulin-like growth factor I receptor；NF-kappa B；P-glycoprotein；Multi-drug resistance

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.016

南通市衛(wèi)生局青年醫(yī)學人才科研基金項目（編號：WQ2014005）

226001江蘇省南通市第一人民醫(yī)院腫瘤科（王以浪，印滇，楊莉，張亮）；南通大學附屬醫(yī)院臨床研究中心（姚登福）

王以浪，男，34歲，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師。從事腫瘤學基礎及臨床研究。E-mail：oncowang@163.com

姚登福，E-mail：yaodf@ahnmc.com