茶樹中甲基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展

陳 絲，羅 勇，石玉蘭，王坤波

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

茶樹中甲基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展

陳 絲，羅 勇，石玉蘭，王坤波*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

甲基轉(zhuǎn)移酶普遍存在于茶樹中，它與茶葉類黃酮物質(zhì)及咖啡堿的形成、茶樹冷馴化過程中DNA甲基化模式的變化和硒代半胱氨酸的形成有關(guān)。本文綜述了茶樹甲基轉(zhuǎn)移酶的基因研究、原核表達(dá)和催化特性研究，為以后茶樹體內(nèi)的甲基化修飾提供理論依據(jù)。

茶樹；甲基化轉(zhuǎn)移酶；基因克隆

從原核生物到真核生物，甲基化反應(yīng)廣泛存在于生物有機(jī)體內(nèi)，其產(chǎn)物也普遍存在于自然界中。甲基化反應(yīng)是甲基轉(zhuǎn)移酶催化的酶促反應(yīng)，特定的甲基轉(zhuǎn)移酶也有其特異的甲基化位點(diǎn)，通常以S-腺苷-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）作為甲基的供體。近年來，茶葉中的甲基化兒茶素成分因其有顯著的抗氧化、抗衰老、抗過敏等功效引起了科研工作者的關(guān)注，目前已在相關(guān)資源篩選[1-2]、基因克隆[3-4]以及生物活性評(píng)價(jià)[5-6]等方面取得了很大的研究進(jìn)展。通過綜述茶樹中甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的研究，有助于進(jìn)一步了解茶樹中甲基化物質(zhì)的種類及其形成代謝機(jī)理，對(duì)進(jìn)一步明晰和開發(fā)茶葉中的保健成分具有推動(dòng)作用。

1 甲基轉(zhuǎn)移酶的功能、分類及其特性

生物體內(nèi)多種重要生理過程都涉及甲基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控，如基因表達(dá)的抑制或關(guān)閉、DNA損傷的修復(fù)及微生物、動(dòng)物、植物體內(nèi)生理過程中間產(chǎn)物的合成與降解反應(yīng)等[7]。根據(jù)底物不同甲基轉(zhuǎn)移酶可分為兩類，即遺傳物質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶和非遺傳物質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶。前者催化遺傳物質(zhì)胞嘧啶生理性的甲基化和由誘變物質(zhì)導(dǎo)致的作為遺傳物質(zhì)附加體的甲基化兩種過程。對(duì)于非遺傳物質(zhì)的甲基轉(zhuǎn)移酶作用的底物非常廣泛，從無機(jī)小分子到生物大分子，包括激素類、磷酸甘油酯類、類黃酮類、葉綠素以及香氣物質(zhì)等。根據(jù)底物的作用位點(diǎn)分為氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-MT）、碳-甲基轉(zhuǎn)移酶（C-MT）、氮-甲基轉(zhuǎn)移酶（N-MT）、硫-甲基轉(zhuǎn)移酶（S-MT）和無機(jī)砷甲基轉(zhuǎn)移酶（Cyt19）等[8]。氧-甲基轉(zhuǎn)移酶是植物體內(nèi)非常重要的酶類，可以將甲基供體的甲基轉(zhuǎn)移到化合物的氧原子上形成甲基化產(chǎn)物，它不僅影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而且對(duì)植物與環(huán)境的相互作用也具有調(diào)控作用[9-10]。氮-甲基轉(zhuǎn)移酶是參與咖啡堿生物合成的關(guān)鍵酶類，其酶活性是咖啡堿合成最重要的限制因子之一。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化和維持DNA的甲基化，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)。硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SMT） 是植物硒代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶[11]。

1.1 O-甲基轉(zhuǎn)移酶

在植物體內(nèi)，氧-甲基轉(zhuǎn)移酶主要調(diào)控植物次級(jí)代謝中的甲基化反應(yīng)，尤其是苯丙類物質(zhì)和類黃酮物質(zhì)的甲基化。其中類黃酮氧-甲基轉(zhuǎn)移酶在植物的代謝途徑中起著非常重要的作用。氧-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用底物主要是酚類物質(zhì)，將甲基轉(zhuǎn)移到底物的酚羥基上形成甲基化產(chǎn)物。根據(jù)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和二價(jià)離子對(duì)酶活的影響，將氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMTs）分類為咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）與咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）。咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化咖啡酸等苯丙素類化合物以及一些類黃酮和生物堿類物質(zhì)[12]。重組大腸桿菌內(nèi)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（EOMT）的誘導(dǎo)表達(dá)條件已經(jīng)得到[13]，且 EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化EGCG后生成不同類型的EGCG甲基化衍生物[14]，并明確了甲基化衍生物酶促合成的反應(yīng)條件[15]。經(jīng)層析純化后，目前獲得了純度超過95%的重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，純化倍數(shù)為22.51倍，酶分子質(zhì)量約為27.6 kD，最適反應(yīng)溫度為35℃、最適pH值為7.5；以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作為底物，酶學(xué)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km為0.100 mmol/L，Vmax為7.485 mg/（L·min）[16]。

1.2 N-甲基轉(zhuǎn)移酶

咖啡堿是重要的風(fēng)味物質(zhì)及生理活性特征成分，對(duì)茶葉品質(zhì)有著重要影響[17-18]，含量在1.2%～5.9%[19]。茶樹中咖啡堿的生物合成途徑主要是多個(gè)氮-甲基轉(zhuǎn)移酶（NMT）參與甲基化而將黃嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為咖啡堿的過程，研究結(jié)果確認(rèn)咖啡堿合成主要通過：黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤→ 可可堿→咖啡堿路徑合成，包括 3次甲基化作用和 1 次核苷酸酶反應(yīng)的過程[20]。根據(jù)催化底物及轉(zhuǎn)移甲基的位置不同可將參與咖啡堿合成的氮-甲基轉(zhuǎn)移酶分成 3 類：第一類為黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶（Xanthosine methy transferase， XMT）；第二類為7-甲基黃嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（7-methy xanthine methyl transferase，MXMT）；第三類為 3,7-二甲基黃嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（3,7-dimethyl xanthine methyl transferase ，DXMT）。Negishi等從茶樹葉片中首次提取到黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶，其最適pH值為7.5～8.0，并且氯汞苯甲酸（PCMB）、 Zn2+及 Cu2+對(duì)其酶活性有強(qiáng)烈的抑制作用[21]。Waldhauser等首次從咖啡葉片中分離純化出黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶，分子量約為40 kDa，酶的最適pH值為7.0[22]。Simone等通過鹽析、離子交換、凝膠層析等一系列純化過程后， 得到7-甲基黃嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶和3,7-二甲基黃嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，結(jié)果顯示兩者具有很多相同的性質(zhì)，如催化反應(yīng)的最適pH值都為7.5，最適溫度都為35℃，等電點(diǎn)都在pH 4.5～5.0之間，但在催化性能上有所區(qū)別，3-氮-甲基轉(zhuǎn)移酶比1-氮-甲基轉(zhuǎn)移酶容易與甲基受體結(jié)合，相反，1-氮-甲基轉(zhuǎn)移酶 比3-氮-甲基轉(zhuǎn)移酶更容易與甲基供體結(jié)合[23]。

1.3 DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶

DNA甲基化是在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下完成的，甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷-甲硫氨酸（SAM）的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的 5-位碳原子上從而完成甲基化過程[24]。非DNA序列遺傳信息的傳遞稱為表觀遺傳，它不涉及基因序列的改變，不符合孟德爾式的遺傳方式，其中DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶能夠通過改變其表達(dá)水平調(diào)節(jié)植物DNA甲基化或去甲基化的進(jìn)行[25]。茶樹冷馴化過程中同時(shí)發(fā)生了甲基化和去甲基化現(xiàn)象，但總體變化趨勢(shì)表現(xiàn)為甲基化水平的增加[26]。研究利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（MSAP）和高效液相色譜法（HPLC），分析了不同冷馴化階段茶樹基因組DNA甲基化水平及狀態(tài)變化，表明茶樹在抗寒響應(yīng)中出現(xiàn)DNA甲基化現(xiàn)象[26]。

1.4 硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶

茶樹是天然富硒能力較強(qiáng)的植物，茶葉中的硒80%為有機(jī)硒[27]。硒是微生物和動(dòng)物必需的微量元素[28]，是至今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)烈也最具潛力的抗癌營(yíng)養(yǎng)素[29]。據(jù)地質(zhì)學(xué)家考證，我國(guó) 72 %的地區(qū)屬于缺硒地區(qū)，2/3 的人口存在不同程度的硒攝入量不足[30]。硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶專一催化硒半胱氨酸甲基化為甲基硒代半胱氨酸，降低了硒代半胱氨酸和硒甲硫氨的含量，從而阻止了氨基酸錯(cuò)誤進(jìn)入耐硒物種的蛋白質(zhì)中，在植物硒營(yíng)養(yǎng)代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31-32]。

2 甲基轉(zhuǎn)移酶的基因克隆及原核表達(dá)分析

2.1 O-甲基轉(zhuǎn)移酶

馬成英等研究獲得一類茶樹氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因 cDNA 全長(zhǎng)并構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體[33]。研究從茶樹葉片中克隆得到了一個(gè)類黃酮氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并使其在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)[34]。李小霞等以從茶樹葉子中提取的總RNA為模板，結(jié)合RT-PCR利用RACE技術(shù)，得到咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng)[35]。

2.2 N-甲基轉(zhuǎn)移酶

謝果等提出植物中可能有多達(dá)14種的氮-甲基轉(zhuǎn)移酶，而茶樹的氮-甲基轉(zhuǎn)移酶類也十分復(fù)雜[36]。許煜華等研究表明茶樹存在著一個(gè)與嘌呤堿合成相關(guān)的氮-甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族，且多個(gè)基因的序列高度相似[37]。Mohanpuria 等利用 RNAi干擾技術(shù)抑制咖啡因合成酶（TCS）的表達(dá)，僅將茶樹的咖啡堿含量降低了 44%～61%[38]。金基強(qiáng)等研究克隆了多個(gè)氮-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因組DNA全長(zhǎng)，初步明確了它們的基因結(jié)構(gòu)和序列差異[39]。Moisyadi等首次報(bào)道從咖啡樹中克隆到催化咖啡堿合成第一步甲基化反應(yīng)的黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，其cDNA編碼1個(gè)含有371個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白沒有顯示出與其他甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白較高的同源性，并且通過RNA技術(shù)抑制該編碼基因可以調(diào)控咖啡中咖啡堿的含量[40]。 Kato 等人從茶葉嫩葉中純化得到咖啡堿合成酶， 并測(cè)定N端的部分氨基酸序列，利用 RACE 方法成功克隆得到N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因 TCS1，并通過體外表達(dá)和功能驗(yàn)證證實(shí)了TCS1為編碼茶樹咖啡堿合成酶的基因，它能有效催化 7- 甲基黃嘌呤生成可可堿，并催化可可堿生成咖啡堿[41]。余有本等從龍井43克隆得到氮-甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，得到的蛋白具有氮-甲基轉(zhuǎn)移酶的后兩步催化活性[42]。

2.3 DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶

基因表達(dá)的改變，涉及許多調(diào)控機(jī)制，其中DNA甲基化是一個(gè)調(diào)控基因功能的重要手段[43]。在低溫馴化過程中某些與抗寒相關(guān)的基因發(fā)生變化從而對(duì)低溫做出響應(yīng)[44]，茶樹通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)分離出一大批與冷馴化相關(guān)的基因, 這些基因在經(jīng)過冷馴化后上調(diào)或下調(diào)表達(dá)[26]。隨著冷馴化的進(jìn)行，茶樹中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶CsDRM2基因的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在脫馴化時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最大，說明CsDRM2的表達(dá)與茶樹冷馴化之間有一定關(guān)系；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2 基因的表達(dá)量逐漸增加，在冷馴化時(shí)期的表達(dá)量高于冷馴化之前，在脫馴化時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最大，說明茶樹能夠通過改變CsDRM2 基因的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)基因組 DNA 甲基化的變化[45]。

2.4 硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶

朱林等從富硒茶樹品種中已克隆出茶樹ATP硒半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA[46]。茶樹硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA全長(zhǎng)1368 bp，開放閱讀框位于50～1105 bp處，編碼產(chǎn)物為穩(wěn)定的親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽，定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主[47]。目前已經(jīng)將硒半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)敫┺r(nóng)桿菌中，獲得轉(zhuǎn)化工程菌[48]。

3 討論與展望

近年來，成熟的生物信息學(xué)技術(shù)為茶樹甲基化轉(zhuǎn)移酶的研究提供新的手段和方法，甲基化反應(yīng)逐漸清晰，而茶樹甲基化作用酶類氧-甲基轉(zhuǎn)移酶、氮-甲基轉(zhuǎn)移酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶以及硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的研究尚不夠深入。

茶樹中氧-甲基轉(zhuǎn)移酶基因分子水平研究[34-49]以及如何提高甲基化兒茶素得率的研究報(bào)道較少，且作用機(jī)制還未清晰，限制了進(jìn)一步探討茶樹中代謝產(chǎn)物的甲基化修飾；未來的研究應(yīng)進(jìn)一步闡明咖啡堿合成過程中氮-甲基轉(zhuǎn)移酶等相關(guān)酶類的基因克隆及功能研究，尤其是氮-甲基轉(zhuǎn)移酶在合成過程中的中間產(chǎn)物及調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚。此外，茶樹DNA甲基化與抗寒之間關(guān)系的研究尚未見報(bào)道，以及還未對(duì)分離到的差異片段進(jìn)行測(cè)序與功能驗(yàn)證。硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SMT）基因還未獲得全序列，SMT全基因的生物信息學(xué)有待深入研究?？傊?，進(jìn)一步豐富茶樹甲基轉(zhuǎn)移酶及甲基化修飾的理論將有助于茶樹甲基化代謝產(chǎn)物的開發(fā)與利用。

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Research Advances in Tea Methyl Transferase

CHEN Si，LUO Yong，SHI Yu-lan，WANG Kun-bo
（Landscape and Horticulture College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）

Methyl transferase is commonly found in tea plant. It is associated with the biosynthesis of flavonoids and caffeine, changes of DNA methylation levels and patterns in tea plant during cold acclimation & the biosynthesis of selenocysteine. Methyl transferase genes were cloned from Camellia sinensis and their prokaryotic expression vector for genes was constructed. The catalytic specificity for flavonoids of methyl transferase has been reviewed, which provide theoretical basis for the future synthesis of methylated modification.

Tea, Methyl transferase, Gene cloning

S571.1

A

1009-525X（2016）04-03-08

2016-06-16

2016-08-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470692）、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-11-096)

陳絲（1992-），女，湖南衡陽人，在讀碩士研究生，研究方向：茶樹種質(zhì)資源與生物技術(shù)。

*通訊作者：王坤波，wkboo163@163.com