寒凝血瘀證動物模型的建立和優(yōu)化篩選*

趙珊珊，郝艷玲，袁鳳剛，毛承飛，周欽榮，朱紅梅△

(1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221006;2.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州 221000)

寒凝血瘀證動物模型的建立和優(yōu)化篩選*

趙珊珊1，郝艷玲2，袁鳳剛2，毛承飛1，周欽榮1，朱紅梅1△

(1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221006;2.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州 221000)

目的:探索不同冷凍時間對造模的影響，為寒凝血瘀證動物模型的制作提供一種優(yōu)化造模方法。方法:將48只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、寒凝血瘀證3 d組、7 d組、14 d組、20 d組;瘀熱互結(jié)證組6組各8只，寒凝組大鼠在－20℃持續(xù)受凍1 h左右，每日1次，持續(xù)時間分別為3、7、14、20 d;瘀熱組大鼠采用角叉菜膠聯(lián)合干酵母懸液造模。結(jié)果:與正常對照組比較，寒凝3 d組TSH、ADR顯著增加，寒凝7 d組部分血流變學(xué)指標(biāo)、ET顯著增加，NO顯著降低;寒凝14 d組血流變學(xué)指標(biāo)、ET顯著增加，NO、TSH、ADR顯著降低;寒凝20 d組血流變指標(biāo)、ET、NO趨于正常;TSH、ADR顯著降低。結(jié)論:寒凝血瘀證大鼠最佳冷凍時間為14 d，這樣既可保證血瘀證模型成功，同時也符合寒證所具有的機體功能活動衰減的特點。

寒凝血瘀證;瘀熱互結(jié)證;動物模型

目前，中醫(yī)證候的動物模型研制長期處于探索性階段。造模首先應(yīng)符合中醫(yī)理論，中醫(yī)傳統(tǒng)辨證的依據(jù)是癥狀、體征、脈象和舌象，這在動物實驗中必然存在物種差異、缺少客觀量化標(biāo)準(zhǔn)等局限性。因此，判斷中醫(yī)證候動物造模的成功與否，應(yīng)將中醫(yī)理論與現(xiàn)代研究成熟的新理論相結(jié)合。而現(xiàn)代中醫(yī)研究成熟的新理論又使得中醫(yī)證候的診斷標(biāo)準(zhǔn)包涵了一些實驗室指標(biāo)和特殊檢查結(jié)果。如血液流變學(xué)、血漿內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)等指標(biāo)的變化與血瘀證有著密切的相關(guān)性。在血瘀證形成過程中，氣血運行不暢引起微循環(huán)障礙，血管舒縮功能和血管內(nèi)皮受損，其細(xì)胞分泌功能失調(diào)或紊亂，造成ET分泌增多、NO分泌減少，因而導(dǎo)致血管收縮、血液瘀滯、血細(xì)胞聚集、血液呈高凝狀態(tài)等血瘀的表現(xiàn)。以往多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［1-2］，不同造模方法的血瘀證模型與對照組比較，模型組ET顯著升高，NO顯著降低。而寒熱證與內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的變化或紊亂有密切關(guān)系。寒證是機體功能活動衰減所表現(xiàn)的證候，熱證是機體功能活動亢盛的反映。血清促甲狀腺素(TSH)、腎上腺素(ADR)含量在寒證動物模型中較低，在熱證動物模型中較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［3］。

本研究旨在通過觀察血流變學(xué)指標(biāo)、NO、ET、TSH、ADR在寒熱2種血瘀證動物模型中的變化，揭示不同冷凍時間對寒凝血瘀證動物模型建立的影響，提出寒凝血瘀證動物模型的優(yōu)化造模方法，為中醫(yī)證候動物模型研制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

角叉菜膠(Cas No.9000-07-1，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司);活性干酵母(安琪酵母股份有限公司，批號QS6540 2801 0001);大鼠內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)、腎上腺素(ADR)、促甲狀腺素(TSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海勁馬實驗設(shè)備有限公司，批號JM201504);血流變儀(北京眾馳，儀器型號ZL9600C);酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS儀器型號 352型);洗板機(芬蘭 Thermo Labsystems儀器型號AC8);國產(chǎn)離心機(微量高速離心機，儀器型號TG16W)。

1.2 動物及分組

清潔級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(250±10) g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2010-0011)。將48只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、寒凝血瘀證3 d組、7 d組、14 d組、瘀熱互結(jié)證組6組各8只。

1.3 造模方法

1.3.1 寒凝血瘀證動物模型 參考文獻(xiàn)［4］將造模方法進(jìn)行優(yōu)化改良，采用全身冷凍法造模，將雄性SD大鼠各自獨立置于罩有鐵網(wǎng)罩的小瓷盤上，放入低溫冰柜，在－20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍1 h左右，待大鼠出現(xiàn)蜷縮少動、反應(yīng)遲鈍、喜扎堆、呼吸微弱、唇周發(fā)黑、耳色暗紅、爪尾部紫暗、舌暗紅、被毛蓬松豎立無光澤、飲水量少、小便色清、大便濕爛等癥狀時，隨即將老鼠脫離冷環(huán)境。每日刺激1次，持續(xù)刺激時間分別為3、7、14、20 d，末次冷凍結(jié)束6 h后收集標(biāo)本。

1.3.2 瘀熱互結(jié)證動物模型 參考文獻(xiàn)［5］大鼠經(jīng)腹腔注射角叉菜膠50 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d。末次注射24 h后，于大鼠背部皮下注射20%干酵母懸液10mL/kg，6 h后收集標(biāo)本。

1.4 標(biāo)本收集及檢測

實驗結(jié)束后，各組動物10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，按血流變、大鼠內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)、腎上腺素(ADR)、促甲狀腺素(TSH)檢測要求處理。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 4.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血流變學(xué)指標(biāo)比較

表1顯示，與正常對照組比較，瘀熱組血漿黏度、全血高、中、低切黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著增加(P＜0.05);寒凝7 d組血漿黏度、全血低切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著增加(P＜0.05);寒凝14 d組血漿黏度、全血高、中、低切黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著增加(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血流變學(xué)指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠ET、NO、ADR、TSH比較

表2顯示，與正常對照組比較，瘀熱組ET顯著增加(P＜0.01)，NO顯著降低(P＜0.01)，TSH、ADR顯著增加(P＜0.01)。寒凝3 d組TSH、ADR顯著增加(P＜0.05)。寒凝7 d組ET顯著增加(P＜0.05)，NO顯著降低(P＜0.05)。寒凝14 d組ET顯著增加(P＜0.01)，NO顯著降低(P＜0.05)，TSH、ADR顯著降低(P＜0.05)。

表2 各組大鼠ET、NO、ADR、TSH比較

3 討論

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，瘀熱組血流變學(xué)指標(biāo)顯著增加，ET顯著增加，NO顯著降低，TSH、ADR顯著增加。而寒凝組造模時間對大鼠血流變、TSH、ADR等指標(biāo)影響較大，大鼠接受寒冷刺激早期(寒凝3 d組)血流變學(xué)指標(biāo)、ET、NO與正常對照組比較未見明顯變化，TSH、ADR變化情況與瘀熱組一致，均高于正常對照組，反映大鼠尚處于應(yīng)激狀態(tài)。這一點與生理、病理學(xué)知識相符即在寒冷環(huán)境中，皮膚血管會收縮，同時骨骼肌會不自主收縮，垂體分泌更多地促甲狀腺激素作用于甲狀腺，使甲狀腺分泌的甲狀腺激素增加，在甲狀腺激素的作用下，機體的新陳代謝活動增強，從而產(chǎn)生更多的熱量以御寒。寒凝7 d組可見，部分血流變學(xué)指標(biāo)、ET顯著增加，NO顯著降低，但TSH、ADR變化與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，反映大鼠在寒冷刺激下首先引起微循環(huán)障礙，血管舒縮功能和血管內(nèi)皮受損，其細(xì)胞分泌功能失調(diào)或紊亂，造成ET分泌增多，NO分泌減少，因而導(dǎo)致血管收縮、血液瘀滯、血細(xì)胞聚集、血黏度增加等血瘀表現(xiàn)，而內(nèi)分泌系統(tǒng)則表現(xiàn)為逐漸適應(yīng)寒冷環(huán)境。寒凝14 d組可見，血流變學(xué)指標(biāo)均顯著增加，ET顯著增加，NO顯著減低，TSH、ADR均顯著降低，反映大鼠同時存在微循環(huán)障礙以及機體功能活動衰減表現(xiàn)。而寒凝20 d組雖然TSH、ADR亦顯著降低，但血流變指標(biāo)、ET、NO卻趨于正常，可能是由于大鼠的適應(yīng)性反應(yīng)所致。因而在實驗室指標(biāo)方面，寒凝14 d組最符合寒凝血瘀證模型的特點。此結(jié)果與其他方法建立的寒凝血瘀證動物模型在這方面的研究一致［6］。

本實驗從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點出發(fā)，通過對比寒熱2種血瘀證動物模型的多種實驗室指標(biāo)，揭示其對機體內(nèi)皮功能、血流變學(xué)及內(nèi)分泌系統(tǒng)的不同影響。同時，在探索寒凝血瘀證動物模型制作方法的過程中，通過實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，造模時間較短(造模3 d)不僅不會引起血瘀證(內(nèi)皮功能、血流變學(xué)無明顯變化)，還可見內(nèi)分泌系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)，即呈現(xiàn)瘀熱互結(jié)證動物模型的變化特點，即TSH、ADR顯著增加。造模7 d雖然出現(xiàn)部分血流變學(xué)指標(biāo)、ET、NO的顯著異常，但反映寒熱性的內(nèi)分泌系統(tǒng)指標(biāo)無明顯變化。而造模時間過長(造模20 d)，血流變指標(biāo)、ET、NO卻趨于正常。因而本實驗研究認(rèn)為，寒凝血瘀證大鼠最佳冷凍時間為14 d，這樣既可保證血瘀證模型的成功，同時也符合寒證所具有的機體功能活動衰減的特點。本實驗為寒凝血瘀證動物模型的制作提供了一種優(yōu)化造模方法，可供研究人員參考。

［1］唐照亮，宋小鴿，章復(fù)清，等.艾灸對寒凝血瘀證大鼠血漿內(nèi)皮素及一氧化氮的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002，8 (3):57-58.

［2］李興琴，張俊剛，郝娜，等.2種血瘀證動物模型內(nèi)皮功能及血液流變學(xué)的比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(8):479-480.

［3］李文宏，潘琳娜，等.寒、熱證與機體功能活動相關(guān)性的初步研究［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，21(6):59-60.

［4］鄭小偉.寒凝血瘀證動物模型的量化研究［J］.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1999，23(2):43-45.

［5］鄧家剛，郝二偉，杜正彩，等.中醫(yī)瘀熱互結(jié)證大鼠模型的建立及評價［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32(3):402-405.

［6］謝波，鄧海山，喻斌，等.寒凝血瘀證大鼠模型的優(yōu)化篩選研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，29(3):262-265.

Establishment and Optimization of Animal Model of Cold Coagulation and Blood Stasis Syndrome

ZHAO Shan-shan1，HAO Yan-ling2，YUAN Feng-gang2，MAO Cheng-fei1，ZHOU Qin-rong1，ZHU Hong-mei1△
(1.The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College Jiangsu Xuzhou 221006，China; 2.Xuzhou Medical College，Jiangsu Xuzhou 221000，China)

Objective:Show the effects of different freezing time and provide a new improving method for Blood Stasis due to Cold Syndrome(BSCS).Method:The forty-eight rats were divided randomly into 6 groups:normal control group，BSCS group for 3 d，7 d，14 d，20 d，Blood Stasis and Heat Accumulation Syndrome(BSHAS)group，8 in each.The rats of BSCS group were kept in－20℃ice 1h a day for 3，7，14，20 d.BSHAS group was made by using carrageen and dry yeast suspension.Results:Compared with the normal group，in 3 d of BSCS group，TSH，ADR improved significantly.In 7 d of BSCS group，part of hemorheology indexes and ET improved significantly;NO reduced obviously.In 14 d of BSCS group，hemorheology indexes and ET improved significantly;NO，TSH，ADR reduced obviously.In 20 d of BSCS group，TSH，ADR reduced obviously while hemorheology indexes，ET，NO became normal.Conclusion:The best freezing time for BSCS group is 14d，which can not only ensure the success of the model of blood stasis syndrome，but also has the characteristics of the functional activity attenuation.

Blood Stasis due to Cold Syndrome;Blood Stasis and Heat Accumulation Syndrome;Animal model

R-332

:B

:1006-3250(2016)08-1048-02

2016-02-11

徐州市科技局基金資助項目(KC14SH109)-血塞通、紅花黃色素等4種活血化瘀類中藥注射液寒熱藥性的對比性研究

趙珊珊(1981-)，女，江蘇徐州人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)內(nèi)科疾病的臨床與研究。

△通訊作者:朱紅梅(1969-)，女，江蘇徐州人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事中醫(yī)內(nèi)科的臨床與研究，Tel:18052268225。