滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對卵巢早衰大鼠的影響

張麗梅，蔡 林

(南充市川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對卵巢早衰大鼠的影響

張麗梅，蔡 林

(南充市川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

目的:研究滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對卵巢早衰大鼠的影響，進而探討雌孕激素序貫治療的最適用量。方法:選擇84只Wistar大鼠，12只未作處理列為空白對照組，72只大鼠為模型組，采用自身免疫性卵巢早衰方法造模。模型組根據(jù)處理方法的不同分為模型對照組、純激素治療組、純中藥治療組及中藥聯(lián)合激素(全量、半量及1/4量)治療組，每組各12只。比較分析治療3個療程后各組大鼠性激素、抑制素B及卵巢子宮組織的變化。結(jié)果:中藥聯(lián)合全量激素治療組效果最好，其次為中藥+半量激素組，該組與純激素治療組療效相當，中藥聯(lián)合1/4量激素組及純中藥治療組治療效果相對較差。結(jié)論:滋腎育胎方劑聯(lián)合半量激素組效果較佳，中藥結(jié)合全量或半量激素能夠有效地改善卵巢早衰大鼠卵巢儲備功能，考慮到激素的副作用，半量激素當然更好，可以有效地延緩卵巢衰老進度，減少雌孕激素用量以及激素引起的副作用。

卵巢早衰;滋腎育胎方;中西醫(yī)結(jié)合;抑制素B;大鼠

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是一種原因尚不明確的原發(fā)性卵巢功能不全，主要表現(xiàn)為婦女在40歲以前卵巢功能表現(xiàn)出減退狀態(tài)，出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)等，生化檢測性激素結(jié)果為腺垂體分泌的卵泡刺激素和黃體生成素明顯升高［1］，發(fā)病率在1%～3%［2］。中醫(yī)證型主癥為月經(jīng)推后或月經(jīng)量少、色淡質(zhì)稀，次癥為腰膝酸軟、神疲乏力、頭暈耳鳴、性欲減退、失眠多夢、心悸、少氣懶言等。病因多認為與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)，發(fā)病機制尚不明確。目前臨床針對此類患者多采用激素替代療法進行治療，目的主要是為改善患者因低雌激素造成的陰道不適等各種圍絕經(jīng)期癥狀，以維持月經(jīng)來潮，進而恢復(fù)生育功能。然而采用純激素序貫治療易增加肝腎功能負擔，造成肝腎功能損害，還有促進子宮內(nèi)膜過度生長、抑制卵巢功能、增加乳腺癌的發(fā)生率等副作用。采用中醫(yī)藥治療可以改善患者的臨床癥狀，穩(wěn)定療效，但單純中藥治療又存在療程較長、起效相對較慢、患者依從性較差等不足。

滋腎育胎方劑為我院治療卵巢功能減退或卵巢早衰的臨床經(jīng)驗方，20多年來取得了顯著的臨床療效。本研究采用中藥聯(lián)合雌孕激素序貫療法治療卵巢早衰大鼠，為中西醫(yī)結(jié)合治療卵巢早衰提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇清潔級Wistar大鼠200只，體質(zhì)量約200 g，陰道圖片檢測示動情周期規(guī)律，所有實驗大鼠由川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.2 實驗藥物

滋腎育胎方劑組成:熟地黃20 g，黨參15 g，山藥30 g，山茱萸18 g，菟絲子20 g，川續(xù)斷20 g，炒杜仲20 g，白術(shù)18 g，當歸12 g，甘草6 g，黃芩炭6 g。將上述方劑通過煎汁使藥物濃度保持在3.5 g/ml。戊酸雌二醇又名補佳樂1mg×21#，法國先靈公司生產(chǎn))，醋酸甲羥孕酮片(2mg×100#，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn))。佐劑為美國Sigma公司產(chǎn)品分裝，分為弗氏完全佐劑(complete Freund’sadjuva nt，CFA)、弗氏不完全佐劑 (incomplete Freund’sadjuvant，IFA)。

1.3 方法

1.3.1 造模 根據(jù)參考文獻［3］制備卵巢早衰大鼠模型。首先制備卵巢抗原，切取體質(zhì)量大約為200 g Wistar雌性大鼠的卵巢組織進行稱重，生理鹽水漂洗，Tris-HCl緩沖液中將漂洗干凈的卵巢組織剪碎并研磨成勻漿，超聲粉碎機低溫下粉碎約5 min，4000 r/min低溫離心15 min，10000 r/min離心5 min，吸管吸取上清液，將卵巢組織液濃度調(diào)至200 mg/ml。隨機選擇100只Wistar雌性大鼠進行多點多處皮下注射卵巢抗原，注射劑量為每只大鼠70 mg(0.35 ml)，連續(xù)進行3次注射，每2周1次。第1次免疫加入相同劑量的CFA，第2、3次加入相同劑量的IFA;對照組(12只)給予相同劑量的生理鹽水代替卵巢抗原。大鼠動情周期采用陰道涂片的方法進行檢測，若大鼠動情周期延長或出現(xiàn)明顯紊亂說明造模成功。

1.3.2 分組及給藥 空白對照組大鼠12只。選擇造模成功的72只Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型對照組、純激素治療組、純中藥治療組及中藥聯(lián)合全量激素組，中藥聯(lián)合半量激素組，中藥聯(lián)合1/4量激素治療組。模型對照組大鼠給予20 ml/ (kg·d)蒸餾水灌胃;純激素治療組給予補佳樂0.12 mg/(kg·d)，同時給予蒸餾水20 ml/(kg·d)進行灌胃，補佳樂灌胃治療4d后給予醋酸甲羥孕酮0.96 mg/(kg·d)聯(lián)合治療，10 d后停藥，停藥1 d后開始下一周期治療;純中藥治療組給予滋腎育胎方劑20 ml/(kg·d)灌胃;中藥聯(lián)合不同劑量激素組給予相同劑量中藥灌胃，同時給予全量、半量及1/4量醋酸甲羥孕酮，連續(xù)用藥14 d，3個療程后檢測各組性激素、抑制素B蛋白水平。

1.3.3 檢測方法 藥物治療3個療程后，取處于動情間期Wistar大鼠腹主動脈血，離心分離血清冷凍儲存，采用酶聯(lián)免疫法檢測E2、FSH、LH水平;摘除取血后的大鼠雙側(cè)卵巢進行稱重，一側(cè)卵巢做成病理切片并進行HE染色，常規(guī)光鏡下觀察染色后的病理切片，詳細觀察并記錄卵巢組織的形態(tài)學(xué)變化。摘除另一側(cè)卵巢采用免疫組化法測定抑制素B表達量，免疫組化圖像采用Image-Pro Plus軟件處理，根據(jù)圖像的灰階度進行雙閾值分割，以得到半灰度目標圖像，并根據(jù)陽性免疫染色強度及面積進行測定。每只大鼠標本測定5個視野，由計算機計算出所測陽性反應(yīng)物相對含量的積分光密度值;所有大鼠子宮摘除并稱重，經(jīng)HE染色光鏡下觀察子宮組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠性激素水平及卵巢、子宮濕重比較

表1顯示，與空白對照組比較，模型對照組FSH、LH水平明顯升高，E2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。純激素治療組、純中藥治療組、中藥+全量激素、中藥+半量激素、中藥+1/4量激素各組血清FSH、LH水平較模型對照組均降低、而E2水平均升高(P＜0.05)。與純激素治療組比較，中藥+全量激素組血清FSH、LH明顯降低，E2顯著升高(P＜0.05);中藥+半量激素組血清FSH、LH、E2輕度升高(P＞0.05);中藥+1/4量激素組及純中藥治療組FSH、LH明顯升高(P＜0.05)，而與E2水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與空白對照組比較，模型對照組卵巢、子宮濕重均降低(P＜0.05)。中藥+全量激素組卵巢、子宮濕重較模型對照組及純激素治療組均增加(P＜0.05)。中藥+半量激素組及純激素治療組卵巢濕重較模型對照組均增加(P＜0.05)，與子宮濕重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。中藥+1/4量激素組及純中藥治療組卵巢、子宮濕重與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠性激素水平及卵巢、子宮濕重分析(±s)

表1 各組大鼠性激素水平及卵巢、子宮濕重分析(±s)

注:與空白對照組比較:★P＜0.05;與模型對照組比較:●P＜0.05;與純激素治療組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數(shù) FSH(IU/L) LH(ng/L) E2(ng/L) 卵巢(g) 子宮(g)空 白 對 照 組 12 4.089±0.223 15.395±0.821 55.768±1.941 0. 0.112±0.139 0.426±0.133 137±0.006 0.541±0.109模 型 對 照 組 12 7.489±0.341★ 27.232±1.397★ 37.301±1.425★ 0.113±0.012★ 0.371±0.062★純 激 素 治 療 組 12 5.200±0.225● 18.065±0.623● 43.791±1.411● 0.128±0.015● 0.412±0.111純 中 藥 治 療 組 12 6.871±0.301●▲ 23.411±0.916●▲ 42.503±7.191● 0.116±0.012 0.428±0.107中藥+全量激素組 12 4.481±0.231●▲ 16.125±0.783●▲ 53.872±1.603●▲ 0.133±0.012●▲ 0.551±0.112●▲中藥+半量激素組 12 5.453±0.201● 19.303±0.837● 45.779±1.201● 0.127±0.007● 0.438±0.091中藥+1/4量激素組 12 6.058±0.237●▲ 21.353±0.936●▲ 42.397±1.532●

2.2 各組大鼠卵巢INHB蛋白表達

表2顯示，與空白對照組比較，模型對照組卵巢INHB蛋白表達量明顯降低(P＜0.05)。純激素治療組、中藥+全量激素治療組、中藥+半量激素組卵巢INHB蛋白表達量明顯高于模型對照組(P＜0.05)。

表2 各組卵巢INHB蛋白表達比較

3 討論

腎藏精，主生殖，乃先天之本，腎中充滿精氣，天癸成熟則月經(jīng)來潮，能孕育子女，說明卵巢生殖周期開始;腎精衰竭、天癸耗竭出現(xiàn)經(jīng)閉，則說明女性卵巢生殖功能處于衰竭狀態(tài)，因此女性卵巢功能的狀態(tài)與腎臟息息相關(guān)。脾為后天之本，氣血生化之源，月經(jīng)正常與否與脾腎功能有明顯的相關(guān)性。

目前，臨床對卵巢早衰患者維持正常月經(jīng)一般采用中藥聯(lián)合雌孕激素序貫療法進行治療，這種治療方法對患者的精神狀態(tài)有重要的調(diào)節(jié)作用，還能維持患者正常的夫妻關(guān)系。通過外源性補充雌孕激素治療卵巢早衰患者，能夠通過反饋調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素的分泌，從而達到降低血清中垂體分泌的FSH、LH水平，維持正常月經(jīng)周期，延緩卵巢衰老的目的，也能夠有效改善患者的更年期癥狀及提高生活質(zhì)量。

滋腎育胎方劑全方由熟地黃、黨參、山藥、山茱萸、菟絲子、川續(xù)斷、炒杜仲、白術(shù)、當歸、甘草、黃芩炭組成，該方劑具有健脾補腎、益培元氣及養(yǎng)血穩(wěn)胎的作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，滋腎育胎方劑能夠使實驗兔性腺和性器官的血液供應(yīng)增加并促進卵泡和黃體發(fā)育［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用滋腎育胎方劑后患者孕酮分泌增加，IVF-ET胚胎種植率提高［5］，均表明滋腎育胎方劑對卵巢功能有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究探討滋腎育胎方劑聯(lián)合雌孕激素序貫療法對卵巢早衰大鼠卵巢功能的影響，結(jié)果顯示中藥聯(lián)合全量激素治療組效果最好，其次為中藥+半量激素組，該組與純激素治療組療效相當。純中藥治療效果欠佳可能與本次實驗療程較短有關(guān)。本研究從激素結(jié)果顯示，滋腎育胎方劑聯(lián)合不同劑量雌孕激素序貫療法能有效抑制卵巢功能衰竭進程，滋腎育胎方劑在提高療效的同時，可以有效減少激素用量，降低副作用。另外，子宮、卵巢質(zhì)量在中藥聯(lián)合半量、中藥聯(lián)合1/4量激素時與空白對照組比較基本無變化，提示在使用中藥的同時減少雌激素用量能夠達到同樣的調(diào)節(jié)效果。

INHB是性腺分泌的重要激素，是轉(zhuǎn)化生長因子β中的一員，INHB主要在育齡期婦女卵巢組織中的顆粒細胞內(nèi)表達［6］。INHB主要作用于腺垂體，通過反饋性作用抑制FSH、LH分泌。有學(xué)者研究認為，INHB評估卵巢儲備功能較FSH等其他指標敏感性較強，是評估卵巢儲備功能的重要指標［7-8］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢INHB蛋白表達量明顯降低，中藥聯(lián)合不同劑量雌孕激素能在不同程度上促進卵巢INHB蛋白水平的表達，其中中藥+全量激素與中藥+半量激素療效相當，說明運用滋腎育胎方劑有助于在減少激素用量的同時提高卵巢早衰大鼠的卵巢儲備功能。

綜上所述，根據(jù)本研究結(jié)果顯示滋腎育胎方劑聯(lián)合半量激素組效果較佳，中藥結(jié)合全量或半量激素能夠有效地改善卵巢早衰大鼠卵巢儲備功能，考慮到激素的副作用，半量激素當然是更好的，這樣可以有效地延緩卵巢衰老進度，減少雌孕激素用量以及激素引起的副作用。

［1］楊麗，趙蘇萍，羅海燕，等.補腎益氣膠囊對卵巢早衰大鼠卵泡發(fā)育及性激素水平的影響［J］.基層醫(yī)學(xué)論壇，2012，16 (16):2141-2142.

［2］Kalu E，Panay N.Spontaneous premature ovarian failure: Management challenges［J］.Gynecol Endocrinol，2008，24(5): 273-279.

［3］林建華，嚴雋鴻，林其德，等.自身免疫性卵巢衰退小鼠動物模型的建立［J］.上海醫(yī)學(xué)，1999，22(12):747-748.

［4］鄒琦，王如萍.滋腎育胎丸［J］.廣東藥學(xué)，2002，12(2):56-57.

［5］朱文杰，李雪梅，陳秀敏，等.滋腎育胎丸對體外受精-胚胎移植患者胚胎種植率的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，22(10):729-737.

［6］程萍，楊飚，張麗萍.抑制素B對卵巢儲備功能的預(yù)測作用［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9(26):43-45.

［7］Seifer D B，Scott R T，Bergh P A，et al.Women with declining ovarian reserve may demonstrate a decrease in day 3 serum inhibin B before a rise in day 3 follicle stimulating hormone［J］.Fertility And Sterility，1999，72(1):63-65.

［8］Vladimirov I K，Tacheva D M，Kalinov K B，et al.Prognostic value of some ovarian reserve tests in poor responders［J］.Arch Gynecol Obstet，2005，272(1):74-79.

R285.5

A

1006-3250(2016)06-0785-03

2015-09-26

張麗梅(1976-)，女，四川眉山人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)婦科的臨床與研究。