海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性氧化損傷的保護(hù)作用

蘇　愛，朱紅燕，徐宏偉，劉　穎，梁　惠

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島　266071；2.山東省青島圣德腦血管病醫(yī)院，山東 青島　266100；3.青島市李滄區(qū)圣德老年護(hù)養(yǎng)院，山東 青島　266100；4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)研究所，山東 青島　266021)

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海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性氧化損傷的保護(hù)作用

蘇愛1，朱紅燕2,3，徐宏偉1，劉穎1，梁惠4

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266071；2.山東省青島圣德腦血管病醫(yī)院，山東 青島266100；3.青島市李滄區(qū)圣德老年護(hù)養(yǎng)院，山東 青島266100；4.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)研究所，山東 青島266021)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R151.41；R282.77；R322.47；R345.99；R575.01；R977.3

摘要：目的探討海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性氧化損傷保護(hù)作用。方法門靜脈膠原酶Ⅳ原位灌注及密度梯度離心獲得大鼠原代肝細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙醇和海兔素最佳作用劑量及肝細(xì)胞活力。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞AST、LDH、SOD、MDA、GSH 水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；單細(xì)胞凝膠電泳觀察細(xì)胞DNA損傷狀況；JC-1熒光探針檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位水平；比色法及Western blot檢測(cè)細(xì)胞CYP2E1活性及蛋白表達(dá)。結(jié)果經(jīng)30 mg·L-1海兔素預(yù)作用2 h，再與300 mmol ·L-1乙醇共作用8 h后，肝細(xì)胞活力較酒精模型組明顯上升，AST和LDH釋放也得到明顯抑制；同時(shí)，肝細(xì)胞SOD和GSH 水平明顯升高，MDA含量則明顯降低，差異均具有顯著性(P<0.05)。海兔素干預(yù)后，肝細(xì)胞凋亡率明顯降低，DNA損傷及線粒體膜電位水平明顯得到改善。 海兔素干預(yù)后，肝細(xì)胞CYP2E1活性及蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制(P<0.05)。結(jié)論海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性氧化損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與海兔素抑制酒精對(duì)CYP2E1的活化，緩解氧化應(yīng)激，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞：海兔素；大鼠；原代肝細(xì)胞；酒精性損傷；抗氧化；凋亡；CYP2E1

長(zhǎng)期過(guò)量酒精攝入可導(dǎo)致酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的發(fā)生。ALD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中以細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1) 活化及其引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷學(xué)說(shuō)備受關(guān)注[1-3]。研究證實(shí)，萜類化合物具有抗炎、抗氧化、保肝等多種生物學(xué)活性[4-5]。本實(shí)驗(yàn)室從三列凹頂藻中成功提取海洋天然活性物質(zhì)溴代倍半萜海兔素，并對(duì)其保肝作用進(jìn)行了研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適宜劑量的海兔素可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力、抑制CYP2E1活性及蛋白表達(dá)等，緩解氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠肝組織損傷發(fā)揮良好保護(hù)作用[6]，但關(guān)于海兔素在肝細(xì)胞內(nèi)抗氧化生物效應(yīng)則少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以海兔素為干預(yù)物，觀察其對(duì)酒精誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，及其在細(xì)胞水平對(duì)CYP2E1活化及氧化應(yīng)激的影響。

1材料與方法

1.1試劑與儀器海兔素由本實(shí)驗(yàn)室從三列凹頂藻中提取純化，并經(jīng)IR、13C- NMR，1H- NMR鑒定為溴代倍半萜海兔素(Aplysin)。無(wú)水乙醇(北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Ⅳ型膠原酶(Sigma)；Percoll(Solarbio)；AST、LDH、MDA、SOD、GSH檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；CYP2E1活性檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；兔抗CYP2E1 多克隆抗體(Abcam)；小鼠抗GAPDH多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；ELx808型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；TRANS-BLOT SD電轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)； UVI凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)UVItec公司)。

1.2大鼠原代肝細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)♂ Wistar大鼠(180~200 g) ，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK魯20130001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用門靜脈膠原酶Ⅳ原位灌注術(shù)及Percoll密度梯度離心技術(shù)分離純化大鼠原代肝細(xì)胞，具體步驟如下。大鼠麻醉后打開腹腔，游離肝臟并行門靜脈留置針穿刺，用37 ℃預(yù)溫的Hanks’平衡鹽溶液350 mL，以34 mL·min-1流速灌注肝臟，直至肝臟變成土黃色。再以0.5 g·L-1膠原酶Ⅳ以同樣流速繼續(xù)灌注20 min。摘取肝臟，去除包膜，將細(xì)胞團(tuán)塊輕柔地散落于4 ℃ Hanks’平衡鹽溶液中，200 μm 尼龍網(wǎng)過(guò)濾，4 ℃，150×g離心3 min，棄上清。將細(xì)胞沉淀加入DMEM/F12全培養(yǎng)液中(含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清)，沿管壁小心將肝細(xì)胞懸液加入含體積分?jǐn)?shù)為0.6的Percoll液表面， 4 ℃，600×g離心15 min。吸棄上層死細(xì)胞及其它雜質(zhì)，保留下層純化的肝細(xì)胞，加入DMEM/F12全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，即得到主要為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。行臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，存活肝細(xì)胞占0.90 以上時(shí)可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將新鮮獲取的肝細(xì)胞接種于涂有鼠尾膠原的96 孔培養(yǎng)板(1×104/孔)或6孔培養(yǎng)板(1×106/孔)，在37 ℃、5% CO2，高糖DMEM/F12全培養(yǎng)液(含青、鏈霉素，0.1 μmol·L-1氫化可的松，32 IE·L-1胰島素，體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清，15 mol·L-1HEPES液)中培養(yǎng)。4 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3乙醇及海兔素劑量的篩選

1.3.1乙醇劑量的篩選于96 孔板貼壁培養(yǎng)20 h 的肝細(xì)胞中，分別加入終濃度為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 mmol·L-1的無(wú)水乙醇，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)平行復(fù)孔。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，共持續(xù)8 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄上清液，每孔加入150 μL 二甲亞砜，室溫避光靜置10 min。于酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定各孔吸光度值(A)。細(xì)胞活力與吸光度值呈正比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2海兔素劑量的篩選于96 孔板貼壁培養(yǎng)20 h 的肝細(xì)胞中，分別加入終濃度為0、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg·L-1的海兔素，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)平行復(fù)孔。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，通過(guò)以上MTT 實(shí)驗(yàn)篩選出海兔素最佳作用劑量。實(shí)驗(yàn)持續(xù)8 h，重復(fù)3 次。

1.4大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷模型的建立與海兔素干預(yù)實(shí)驗(yàn)于6 孔或96 孔板中貼壁培養(yǎng)20 h 的肝細(xì)胞中，加入終濃度為30 mg·L-1的海兔素。于37 ℃、5% CO2孵育2 h后，加入終濃度為300 mmol·L-1的無(wú)水乙醇，與海兔素繼續(xù)共同作用8 h，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和酒精損傷組。作用完成后，對(duì)細(xì)胞及上清液進(jìn)行相應(yīng)處理，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。6 孔板每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔，96 孔板每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷細(xì)胞活力及受損程度影響采用MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肝細(xì)胞活力。采用酶法檢測(cè)上清液中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)水平，具體步驟按試劑盒說(shuō)明操作。

1.6海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性氧化損傷的影響采用體積分?jǐn)?shù)為0.01的Triton-X 100 裂解肝細(xì)胞，通過(guò)黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活力；硫代巴比妥酸比色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量；DNTB比色法測(cè)定谷胱甘肽(GSH)水平；考馬斯亮蘭法進(jìn)行蛋白定量。具體步驟按試劑盒說(shuō)明操作。

1.7海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況。收集肝細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1，吸取100 μL細(xì)胞懸液于分析試管中，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI 溶液，室溫避光孵育15 min。加入400 μL 緩沖液，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。數(shù)據(jù)經(jīng)WinMDI2.9軟件分析，對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.8海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精誘導(dǎo)DNA損傷的影響采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞DNA損傷。收集肝細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1，吸取100 μL細(xì)胞懸液，4 ℃、800×g離心5 min，將肝細(xì)胞沉淀重懸于1 mL 質(zhì)量濃度為10 g·L-1低熔點(diǎn)瓊脂糖中，取75 μL滴加于預(yù)先鋪設(shè)質(zhì)量濃度為10 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)熔點(diǎn)瓊脂糖的毛玻璃片上，蓋上蓋玻片，置于4 ℃濕盒5 min。移去蓋玻片，將載玻片浸于預(yù)冷細(xì)胞裂解液(pH=10)中，4 ℃裂解1 h。將載玻片緩慢浸入電泳緩沖液(pH=13)中，4 ℃ 解旋40 min后，4 ℃，18 V電泳20 min。將載玻片浸入中和緩沖液中，4 ℃放置15 min。取出載玻片，滴加1 mg·L-1DAPI，4 ℃濕盒避光放置20 min，于熒光顯微鏡下觀察肝細(xì)胞DNA損傷狀況，并采用CASP軟件進(jìn)行分析。根據(jù)肝細(xì)胞彗星尾DNA所占細(xì)胞總DNA百分比，將DNA損傷分為0 ~ Ⅳ級(jí)：<0.05為0級(jí)，0.05~0.2為Ⅰ級(jí)，0.21~0.4為Ⅱ級(jí)，0.41~0.95為Ⅲ級(jí)，>0.95為Ⅳ級(jí)。

1.9海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷線粒體膜電位的影響將預(yù)置蓋玻片6 孔板中貼壁生長(zhǎng)的肝細(xì)胞，加入1 mL培養(yǎng)液和1 mL JC - 1染色工作液，37 ℃、5% CO2孵育20 min，吸除上清，加入2 mL培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡下觀察肝細(xì)胞線粒體膜電位變化。

1.10海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷CYP2E1活性的影響收集肝細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1，采用比色法檢測(cè)肝細(xì)胞CYP2E1活性，測(cè)定步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.11海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷CYP2E1蛋白表達(dá)水平的影響收集肝細(xì)胞，加入150 μL細(xì)胞裂解液提取總蛋白， BCA法測(cè)定樣品中蛋白濃度。蛋白樣品每孔上樣15 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。以質(zhì)量濃度為50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(CYP2E1，1 ∶1 000；GAPDH，1 ∶8 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入二抗溶液(1 ∶8 000)，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Quantity One version 4.4軟件進(jìn)行圖像分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1大鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)大鼠肝組織經(jīng)門靜脈原位灌注后由暗紅色變?yōu)橥咙S色，肝被膜下可見明顯龜背狀裂隙(Fig 1)。此外，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，活細(xì)胞產(chǎn)量為(2.0±0.7)×107/肝，存活肝細(xì)胞均占0.90以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1　Orthotopic rat liver perfusion

A: Liver before collagenase perfusion;B: Liver after collagenase perfusion

2.2乙醇及海兔素劑量篩選MTT結(jié)果顯示，100、200 mmol·L-1酒精模型組肝細(xì)胞活力分別較正常對(duì)照組(A=0.561±0.029)降低了1.07%和2.49%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；300～900 mmol·L-1酒精模型組細(xì)胞活力分別較正常對(duì)照組下降了8.73%～76.47%，差異均具有顯著性(P<0.05)。因此，選擇300 mmol·L-1乙醇劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，在肝細(xì)胞中加入海兔素后，10～30 mg·L-1海兔素組細(xì)胞活力與正常對(duì)照組(A=0.534±0.028)比較，差異均無(wú)顯著性(P>0.05)；35～50 mg·L-1海兔素組細(xì)胞活力則較正常對(duì)照組下降了7.31%～63.86%，差異具有顯著性(P<0.05)。因此，選擇30 mg·L-1海兔素劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見Fig 2。

2.3 海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷細(xì)胞活力的影響MTT 結(jié)果顯示，酒精模型組細(xì)胞活力較正常對(duì)照組(A=0.566±0.018)下降了8.83%，海兔素干預(yù)組則較酒精模型組(A=0.516±0.021)上升了7.56%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Fig 3。

GroupAST/U·L-1LDH/U·L-1SOD/kU·g-1ProGSH/mg·g-1ProMDA/μmol·g-1ProControl1.56±0.184.37±0.265.36±0.38124.18±5.151.24±0.15Ethanol3.81±0.3212.08±0.73*1.86±0.13*78.96±5.37*3.57±0.38*Aplysin2.93±0.25*#6.28±0.89*#4.37±0.29*#118.04±8.87#2.98±0.20*#

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

Tab 2　Effect of Aplysin on DNA oxidative damage in rat primary ±s,n=3)

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

Fig 2　Effect of ethanol and Aplysin

A: Effect of ethanol on primary hepatocyte vitality;B: Effect of Aplysin on primary hepatocyte vitality.*P<0.05vscontrol group

2.4海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷AST及LDH漏出的影響結(jié)果顯示， 酒精模型組AST和LDH漏出分別為正常對(duì)照組的2.44倍和2.76倍，海兔素干預(yù)組AST和LDH的釋放較酒精模型組降低了23.10%和48.01%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有顯著性(P<0.05)。 見Tab 1。

Fig 3　Effects of Aplysin on vitality

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

2.5海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精性損傷的抗氧化作用結(jié)果顯示，酒精模型組SOD和GSH水平分別較正常對(duì)照組降低了65.30%和36.41%，MDA水平則達(dá)到正常對(duì)照組的2.88倍。與酒精模型組比較，海兔素干預(yù)組SOD和GSH 水平升高了13.49%和49.49%，MDA含量則降低了16.53%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Tab 1。

2.6海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果顯示，酒精模型組肝細(xì)胞凋亡率為(18.5±1.2)%，明顯高于正常對(duì)照組凋亡率(0±1.0)%，海兔素干預(yù)組肝細(xì)胞凋亡率明顯降低，達(dá)到(7.46±1.0)%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Fig 4。

2.7海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精誘導(dǎo)DNA損傷的影響結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝細(xì)胞0~Ⅰ級(jí)DNA損傷率達(dá)到98%，Ⅱ~Ⅲ級(jí)僅為2%，無(wú)Ⅳ級(jí)損傷。酒精模型組肝細(xì)胞0~Ⅰ級(jí)DNA損傷率明顯降低，較正常對(duì)照組下降了37.2%，而Ⅱ~Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)損傷則明顯增多，分別較正常對(duì)照組升高了14.3和7.9倍。海兔素干預(yù)組肝細(xì)胞0~Ⅰ級(jí)DNA損傷率較酒精模型組升高了19.5%， Ⅱ~Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)DNA損傷率則較酒精模型組分別下降了25.5%和53.2%(P<0.05)。見Fig 5、Tab 2。

Fig 4Effects of Aplysin on apoptotic rate in alcohol primary hepatocyte injury in rats

A: Control; B: Ethanol; C: Aplysin

Fig 5 Effect of Aplysin on DNA oxidative damage in rat primary hepatocytes(×200)

A:Control; B:Ethanol; C:Aplysin

2.8海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷線粒體膜電位的影響結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝細(xì)胞出現(xiàn)橙紅色熒光，而酒精模型組橙紅色熒光較正常對(duì)照組明顯減少，綠色熒光明顯增多，海兔素干預(yù)組橙紅色熒光則較酒精模型組增多，綠色熒光明顯減少。見Fig 6。

2.9海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷CYP2E1活性的影響結(jié)果顯示，正常對(duì)照組CYP2E1活性為(38.67±4.53) μmol·g-1Pro·min-1，酒精誘導(dǎo)后，肝細(xì)胞CYP2E1活性達(dá)到正常對(duì)照組的2.69倍，而海兔素干預(yù)組肝細(xì)胞CYP2E1活性較酒精模型組明顯降低了23.44%，差異均具有顯著性(P<0.05)。見Fig 7。

Fig 6Effect of Aplysin on mitochondrial membrane potentialin rat primary hepatocytes(×200)

A: Control; B: Ethanol; C: Aplysin

Fig 7　Effect of Aplysin on CYP2E1

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

2.10海兔素對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞酒精損傷CYP2E1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，酒精模型組CYP2E1蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而海兔素干預(yù)組CYP2E1蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制，與酒精模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05)。見Fig 8。

3討論

酒精被攝入機(jī)體后，約90%在肝臟代謝。作為一種強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激源，酒精在被代謝的同時(shí)也誘生出大量活性氧(ROS)，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致肝臟炎癥、壞死甚至肝硬化，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重不利影響[1,7]。大量研究表明，萜類化合物具有高度抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，凹頂藻萜類化合物及其提取物溴代倍半萜海兔素對(duì)酒精引起的肝組織氧化損傷具有一定保護(hù)效應(yīng)[5-6]。為了進(jìn)一步探討海兔素在細(xì)胞水平所發(fā)揮的抗氧化生物效應(yīng)，本研究以海兔素為干預(yù)物，觀察其對(duì)原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞酒精性氧化損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

Fig 8　Effect of Aplysin on CYP2E1 protein

1: Control; 2: Ethanol; 3: Aplysin.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group

LDH和AST釋放增加是肝細(xì)胞膜及線粒體損傷敏感評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，300 mmol·L-1乙醇作用于大鼠原代肝細(xì)胞8 h，其上清液中LDH和AST釋放水平明顯升高，而30 mg·L-1海兔素的干預(yù)減少了LDH和AST的釋放，表明適宜劑量的海兔素對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用。

通常，機(jī)體由多種抗氧化酶和抗氧化劑組成一套完整的抗氧化系統(tǒng)，來(lái)清除體內(nèi)多余的ROS和自由基或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為無(wú)毒的代謝產(chǎn)物，使機(jī)體免遭氧化應(yīng)激損傷。其中， GSH是細(xì)胞內(nèi)最豐富的抗氧化劑及自由基清除劑[8]，而SOD則被認(rèn)為是維持機(jī)體氧化平衡，清除ROS的第一道防線。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物，也是活性氧對(duì)細(xì)胞膜損傷敏感評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，在乙醇作用下，大鼠原代肝細(xì)胞GSH被大量消耗，同時(shí)SOD活力亦明顯下降， MDA含量則明顯升高；而經(jīng)海兔素預(yù)處理的原代肝細(xì)胞與乙醇共孵育8 h后，其抗氧化物質(zhì)明顯增多，MDA含量明顯減少，表明海兔素干預(yù)可有效改善乙醇誘導(dǎo)所致的大鼠原代肝細(xì)胞氧化-抗氧化失衡狀況，緩解肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

研究表明，酒精不但可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，還可引發(fā)嚴(yán)重的凋亡損傷[9]，這主要是由于酒精代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量ROS使線粒體膜電位降低，細(xì)胞色素C(cytochrome C)被更多地釋放入胞質(zhì)，引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)及JC-1熒光染料對(duì)酒精誘導(dǎo)的大鼠原代肝細(xì)胞凋亡率、DNA[10]及線粒體損傷等細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，海兔素有效改善了原代肝細(xì)胞DNA及線粒體損傷狀況，對(duì)酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡具有一定的緩解和修復(fù)作用，這可能與海兔素提高機(jī)體抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

長(zhǎng)期過(guò)量飲酒時(shí)，肝組織微粒體乙醇氧化酶系(MEOS)成為乙醇代謝的主要途徑，其中，CYP2E1由于對(duì)乙醇代謝Km值較低，且能被乙醇誘導(dǎo)，故成為MEOS乙醇代謝酶系的關(guān)鍵酶。大量研究證實(shí)，由乙醇誘導(dǎo)的CYP2E1異?；罨瓦^(guò)表達(dá)與肝組織氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[3,11]。研究表明，將乙醇作用于HepG2細(xì)胞株，可導(dǎo)致CYP2E1酶活性和蛋白表達(dá)明顯升高；采用CYP2E1抑制劑處理大鼠肝細(xì)胞可預(yù)防乙醇毒性，且活性氧也明顯減少[12]；酒精對(duì)CYP2E1基因敲除小鼠幾乎不引起氧化損傷作用[13]，而肝特異性CYP2E1高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠則表現(xiàn)出更多氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。 本研究結(jié)果表明，在乙醇作用下，大鼠原代肝細(xì)胞CYP2E1活性明顯增強(qiáng)，其蛋白表達(dá)水平亦明顯升高，海兔素對(duì)乙醇誘導(dǎo)的CYP2E1活性增強(qiáng)及蛋白過(guò)表達(dá)具有一定抑制作用，這可能是海兔素改善大鼠原代肝細(xì)胞氧化損傷及凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，海兔素對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與海兔素抑制酒精對(duì)CYP2E1的活化，緩解氧化應(yīng)激，提高機(jī)體抗氧化系統(tǒng)活力有關(guān)。海兔素作為一種海洋天然活性物質(zhì)，值得進(jìn)一步研究開發(fā)和應(yīng)用。

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Effects of Aplysin on ethanol-induced oxidative damage in rat primary hepatocytes

SU Ai1, ZHU Hong-yan2，3, XU Hong-wei1, LIU Ying1, LIANG Hui4

(1.LaboratoryofCellularandMolecularBiology,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266071,China;2.ShengdeCerebrovascularDiseaseHospital,QingdaoShandong266100,China;3.ShengdeGeriatricNursingHomes,QingdaoShandong266100,China;4.TheInstituteofHumanNutrition,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266021,China)

Abstract：AimTo investigate the protective effects of Aplysin on ethanol-induced oxidative damage in rat primary hepatocytes.MethodsRat primary hepatocytes were obtained via the portal vein collagenase Ⅳ in situ perfusion technique followed by a Percoll density gradient centrifuge. MTT test was used to determine the optimum dose of Aplysin and ethanol, and detect the cell vitality in primary hepatocytes. Supernatants of primary hepatocytes were harvested to measure AST and LDH level, and the SOD, GSH-PX activities and MDA content in primary hepatocytes were observed. Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate. DNA damage in primary hepatocytes was detected by single-cell gel electrophoresis assay. The level of mitochondrial membrane potential in primary hepatocytes was tested by fluorogenic probe JC-1. The CYP2E1 activity in primary hepatocytes was detected by colorimetry. The proteins of CYP2E1 were detected by Western blot.Results300 mmol·L-1dose of ethanol and 30 mg·L-1dose of Aplysin were the optimal dosages and were used in the subsequent experiments. Hepatocyte vitality was significantly increased in Aplysin group compared to that in ethanol group, and Aplysin inhibited the release of AST and LDH(P<0.05). For Aplysin treatment group, the activities of hepatocyte SOD and GSH were significantly increased, and MDA was markedly lowered as compared with those in ethanol group(P<0.05). Aplysin could alleviate hepatocyte apoptosis significantly, and hepatocyte DNA damage rates of Ⅱ~Ⅲ level and Ⅳ level were significantly lowered in Aplysin treatment group as compared with those in ethanol group, and Aplysin had evident improvement in alcohol induced mitochondria damage of hepatocyte. Primary hepatocyte activities and protein expression of CYP2E1 were markedly lowered in Aplysin treatment group as compared with those in ethanol group(P<0.05).ConclusionAplysin has protective effects on liver oxidative damage induced by alcohol of primary cultured rat hepatocytes by blocking CYP2E1 activation, relieving oxidative stress, and sharpening the oxidation resistance ability.

Key words：Aplysin; rat; primary hepatocytes; alcoholic damage; antioxidation; apoptosis; CYP2E1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0251-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.020

作者簡(jiǎn)介：蘇愛(1962-)，男，實(shí)驗(yàn)師,研究方向：營(yíng)養(yǎng)生化,E-mail:shenghua005@163.com;梁惠(1964-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)學(xué)，通訊作者，E-mail:qdlianghui@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31171671, 81573137); 達(dá)能營(yíng)養(yǎng)中心膳食營(yíng)養(yǎng)研究與宣教基金(No DIC2014-03); 青島大學(xué)創(chuàng)新型教學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究項(xiàng)目

收稿日期:2015-11-09，修回日期：2015-12-02

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.040.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57