肌源干細(xì)胞治療周?chē)窠?jīng)損傷的研究進(jìn)展

劉志鑫，張洪雨，劉建宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨外一科,黑龍江 哈爾濱　150081)

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肌源干細(xì)胞治療周?chē)窠?jīng)損傷的研究進(jìn)展

劉志鑫，張洪雨，劉建宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨外一科,黑龍江 哈爾濱150081)

[摘要]周?chē)窠?jīng)損傷是常見(jiàn)的外科疾病之一，為了尋求促進(jìn)周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)的途徑，臨床醫(yī)生和科學(xué)工作者長(zhǎng)期致力于提高外科技術(shù)和改進(jìn)手術(shù)方法，但術(shù)后功能恢復(fù)仍不如意。近年來(lái)飛速發(fā)展的組織工程學(xué)為此提供了一種新的解決途徑，其中雪旺細(xì)胞目前被認(rèn)為是周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)中重要的種子細(xì)胞，但其很多方面的應(yīng)用都受到限制。所以，需尋找雪旺細(xì)胞的替代細(xì)胞。近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)并逐漸成為研究熱點(diǎn)的新型種子細(xì)胞之一便是肌源干細(xì)胞(muscle- derived stem cell，MDSC)。在本文中作者通過(guò)大量閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，并結(jié)合自己的相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)肌源干細(xì)胞誘導(dǎo)分化治療周?chē)窠?jīng)損傷的理論依據(jù)、實(shí)驗(yàn)方法、新突破及面臨的問(wèn)題進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞]肌源干細(xì)胞； 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子； 雪旺細(xì)胞； 周?chē)窠?jīng)損傷

周?chē)窠?jīng)損傷是因某些因素造成神經(jīng)軸索中斷或神經(jīng)斷裂、神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙，致使軀干及四肢感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、交感功能障礙的一類(lèi)臨床病癥。其病理變化為被損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性[1]，近端一個(gè)或多個(gè)郎飛節(jié)也發(fā)生相似的病理變化，然后雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)增殖，其在神經(jīng)膜管內(nèi)排列有序并形成一條實(shí)心的細(xì)胞索Bungner帶[2]，同時(shí)Bungner帶內(nèi)有再生的軸突長(zhǎng)入，緊接著大多數(shù)SCs凋亡，小部分存活的SCs開(kāi)始與軸突1∶1匹配并包繞軸突形成髓鞘，再生的軸突逐漸延伸至效應(yīng)器，從而重新建立新的突觸聯(lián)系[3]。

1對(duì)SCs作用的認(rèn)識(shí)及研究

SCs在周?chē)窠?jīng)損傷后的修復(fù)中具有重要作用，為周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)特有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后，極少自發(fā)地發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的再生，主要由于自身的微環(huán)境不利于再生，如少突細(xì)胞髓鞘套管的存在和膠質(zhì)瘢痕形成等[4]。而PNS被損傷后可再生，其神經(jīng)功能也可部分甚至全部恢復(fù)，這主要依賴于一個(gè)適宜神經(jīng)再生的微環(huán)境，而這個(gè)微環(huán)境正是由SCs 提供的。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)CNS損傷后，將SCs 移植到其損傷部位可以使CNS再生[5]。因此改造CNS的微環(huán)境，使之接近于PNS，目前已成為促進(jìn)CNS再生的重要策略之一。SCs促進(jìn)神經(jīng)再生的機(jī)制主要有以下幾方面：(1) 激活免疫反應(yīng)，具有免疫吞噬作用；(2) 增殖遷移，引導(dǎo)軸突再生；(3) 分泌作用：分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子及細(xì)胞黏附分子等；(4) 趨化作用；(5) 神經(jīng)纖維與 SCs之間形成緊密連接；(6) 形成神經(jīng)髓鞘等。故將SCs移植到周?chē)窠?jīng)內(nèi)，其可存活，并通過(guò)增殖、遷移、分化及分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等促進(jìn)軸突和髓鞘再生及形成，進(jìn)而促進(jìn)修復(fù)損傷的周?chē)窠?jīng)[6- 9]。

2對(duì)肌源干細(xì)胞(MDSC)的認(rèn)識(shí)及研究

MDSC是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，以往很多文獻(xiàn)均是報(bào)道有關(guān)于肌衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞的。Asakura等[10]研究發(fā)現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞具有自我更新和成肌、成脂肪、成骨等多向分化的能力，故有“肌肉干細(xì)胞”之稱(chēng)，但其是一種向成肌系細(xì)胞定向分化的前體細(xì)胞。有文獻(xiàn)[11]報(bào)道MDSC是與肌衛(wèi)星細(xì)胞完全不同的一群細(xì)胞群,可能是一群原始的干細(xì)胞，且未向任何方向分化。研究證實(shí)，MDSCs可大量擴(kuò)增復(fù)制，其在體外傳30代后仍可保持其原有的表型特征；在體外進(jìn)行300次擴(kuò)增后仍未出現(xiàn)自我復(fù)制衰老的征象，依然可以維持較高水平的Sca- 1和CD34表達(dá)，但MDSCs的擴(kuò)增潛能并非是無(wú)限的[12]。另外，MDSCs在一般情況下，無(wú)誘導(dǎo)因素的作用時(shí)，其可定向分化為肌細(xì)胞；在特殊的誘導(dǎo)因素刺激下，MDSCs可以分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[13]。Bedair等[14]以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)小鼠骨骼肌損傷模型研究證實(shí)，MDSCs同時(shí)促進(jìn)受損肌肉及其周?chē)堋⑸窠?jīng)的再生，他們也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在再生肌組織和體內(nèi)CD133+/CD34+MDSCs的遷移能力要比SCs更為突出。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)MDSC缺乏Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體(MHC- Ⅰ)，由于MHC- Ⅰ是導(dǎo)致移植組織的排斥反應(yīng)的重要因素之一，故MDSC具有免疫赦免特性、抗原性極低等特點(diǎn)。正是由于MDSC的這一特性使其異體甚至異種移植成為可能。而作為理想的組織工程種子細(xì)胞需要具備的條件有：(1) 可以通過(guò)培養(yǎng)擴(kuò)增等方式大量復(fù)制增殖；(2) 具有多向分化的能力，可分化為所需細(xì)胞；(3) 具有免疫赦免特性，抗原性低等。由此可見(jiàn)，MDSC完全具備作為理想種子細(xì)胞的條件[15- 16]。因此，目前MDSC已被廣泛研究應(yīng)用于治療壓力性尿失禁、心臟疾病、肌肉障礙疾病、神經(jīng)損傷等疾病[17- 20]。

3MDSC治療周?chē)窠?jīng)損傷的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法

3.1MDSC的分離純化、培養(yǎng)及鑒定

取新生小鼠獲取其純凈的骨骼肌組織，剪碎，應(yīng)用酶消化法對(duì)肌組織進(jìn)行消化并離心、過(guò)濾提取細(xì)胞液，然后經(jīng)改良pre- plating差速貼壁法等方法分離、純化，最后獲得小鼠的原代MDSC，并用臺(tái)盼藍(lán)染色等方法檢測(cè)所提取純化的MDSC的活性，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變和生長(zhǎng)狀態(tài)，定時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液[21- 22]；MDSC的鑒定常采用檢測(cè)其表面標(biāo)志物的方法。而MDSC幾乎沒(méi)有特異性表面標(biāo)志物，國(guó)內(nèi)外大部分實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合檢測(cè)Desmin(肌源性標(biāo)志物)及 Sca- 1(干細(xì)胞標(biāo)志物)對(duì)其進(jìn)行鑒定。Sca- 1是迄今為止研究者們公認(rèn)的MDSC的表面標(biāo)志物[23]。Qu- Petersen等[11]研究發(fā)現(xiàn)90%的MDSCs表達(dá)Sca- 1。另?yè)?jù)報(bào)道，在MDSCs中Desmin陽(yáng)性率達(dá)90%；而在平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中Desmin的陽(yáng)性率僅15%[24]。有文獻(xiàn)[24]稱(chēng)，MDSC表面還表達(dá)CD13、CD10、CD56等，但其不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45。

3.2MDSC向SCs誘導(dǎo)及鑒定

取原代提取的MDSC進(jìn)行鋪板，待其貼壁后更換混有誘導(dǎo)液的培養(yǎng)液，并定期換液，嚴(yán)密觀察。細(xì)胞有形態(tài)學(xué)上的變化時(shí)，則立即通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)鑒定技術(shù)，如免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等對(duì)其進(jìn)行鑒定。目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)檢測(cè)SCs特異性標(biāo)志物S- 100、GFAP和p75以確定SCs的表型[25- 27]。其中，S100蛋白僅在神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞高度特異性地表達(dá)，主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞(CNS內(nèi))和SCs(PNS內(nèi))[28]。GFAP是一種分子量為50~52KDa的酸性膠質(zhì)蛋白，是膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞受到各種代謝、物理刺激時(shí)其表達(dá)增強(qiáng)[29]。p75是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的低親和力受體，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)及腫瘤細(xì)胞中[30]。

3.3制造鼠周?chē)窠?jīng)損傷模型并移植類(lèi)SCs

選取數(shù)只成年健康裸鼠麻醉后暴露一側(cè)坐骨神經(jīng)，做軸突切斷術(shù)，切除一定距離的軸突造成神經(jīng)缺損，并向缺損處注入類(lèi)SCs，再應(yīng)用顯微外科縫合線縫合神經(jīng)外膜。動(dòng)物清醒后放回動(dòng)物室單獨(dú)飼養(yǎng)。

3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)

通過(guò)多種直接或間接的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)對(duì)術(shù)后鼠周?chē)窠?jīng)損傷恢復(fù)情況進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。目前主要的檢測(cè)技術(shù)有：(1) 步態(tài)分析：從行為學(xué)角度觀察大鼠觸地/抬起、步長(zhǎng)、步頻、速度等，鑒定神經(jīng)對(duì)靶器官的控制能力。(2) 電生理：通過(guò)肌電圖、神經(jīng)電圖、誘發(fā)電位觀察周?chē)窠?jīng)電恢復(fù)情況。(3) 熒光顯微鏡下觀察：Dil標(biāo)記的MDSCs分布、生長(zhǎng)情況。(4) 免疫組織化學(xué)：檢測(cè)神經(jīng)特異性蛋白，如S100、膠原纖維酸性蛋白(GFAP)、M2/M6的表達(dá)。(5) 大體及組織學(xué)檢測(cè)：通過(guò)HE染色觀察再生神經(jīng)組織細(xì)胞形態(tài)。(6) 熒光鏡逆行示蹤：觀察新生神經(jīng)軸漿流運(yùn)輸能力等[31]。

4MDSC治療周?chē)窠?jīng)損傷的新研究突破

目前國(guó)外內(nèi)對(duì)MDSC誘導(dǎo)分化治療周?chē)窠?jīng)損傷尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)研究階段。最近，國(guó)內(nèi)研究者唐乙等[32]用ELISA等化學(xué)方法對(duì)小鼠SCs條件培養(yǎng)液進(jìn)行成分檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)小鼠SCs條件培養(yǎng)液中除成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)基本檢測(cè)不到外，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素- 3(NT- 3)、血小板源性生長(zhǎng)因(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子- 2(IGF- 2)均有不同量的表達(dá)。于是他們用以上5種因子單一、兩兩組合、三三組合分別對(duì)小鼠的MDSC進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果NT- 3、PDGF、IGF- 2組成功誘導(dǎo)其分化為類(lèi)SCs，并表達(dá)了SCs的特征性標(biāo)志物Sl00、GFAP和p75。在國(guó)外，研究者將由人類(lèi)的骨骼肌提取的MDSC移植到成年裸鼠的坐骨神經(jīng)缺損處，數(shù)周后裸鼠原本喪失運(yùn)動(dòng)功能的后肢明顯得到恢復(fù)，他們手術(shù)暴露原來(lái)植入人MDSC的坐骨神經(jīng)缺損處，發(fā)現(xiàn)原來(lái)缺損處有了明顯的組織學(xué)恢復(fù)，而且缺損處再生的神經(jīng)經(jīng)鑒定有明顯的朗飛結(jié)等結(jié)構(gòu)再生，而且其包含的神經(jīng)纖維數(shù)量與正常的神經(jīng)基本一致，并且該裸鼠患肢受坐骨神經(jīng)支配的腓腸肌也沒(méi)有出現(xiàn)萎縮[31]。

5結(jié)語(yǔ)

盡管目前已有方法成功將MDSC定向誘導(dǎo)分化為類(lèi)SCs，并且運(yùn)用人MDSC修復(fù)裸鼠的坐骨神經(jīng)缺損也大獲成功。但如何科學(xué)地將類(lèi)SCs移入具有正常免疫功能的動(dòng)物活體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)缺損修復(fù)，以及如何將來(lái)自動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果應(yīng)用到臨床等等還有一系列難題均是國(guó)內(nèi)外研究者還未曾涉獵的，可謂目前的MDSC治療周?chē)窠?jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究突破僅僅為萬(wàn)里長(zhǎng)征剛走完一步，此后還有大量的難題等待著我們科研工作者去竭力探索。但MDSC仍是目前治療周?chē)窠?jīng)損傷最有前景的組織工程學(xué)材料。相信隨著干細(xì)胞生物工程的飛速發(fā)展，MDSC應(yīng)用于臨床治療周?chē)窠?jīng)損傷的日子必然為期不遠(yuǎn)。

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doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．033

[中圖分類(lèi)號(hào)]R745

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)01- 0143- 04

[通信作者]劉建宇E- mail:liujianyu6@hotmail.com

[作者簡(jiǎn)介]劉志鑫(1988-)，男，陜西安康人，在讀碩士研究生。E- mail:1025262831@qq.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272015)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 09- 18

[引文格式] 劉志鑫，張洪雨，劉建宇.肌源干細(xì)胞治療周?chē)窠?jīng)損傷的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(1)：143- 146.

·綜述·