肉桂酸和咖啡酸對萵苣生長的化感作用及其機理研究

郭　凱,燕志強,金　輝,李秀壯,何小鳳,楊曉燕,秦　波*

(1 中國科學院大學,北京 100049;2 中國科學院蘭州化學物理研究所 中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室/甘肅天然藥物重點實驗室,蘭州 730000)

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肉桂酸和咖啡酸對萵苣生長的化感作用及其機理研究

郭凱1,2,燕志強2,金輝2,李秀壯2,何小鳳2,楊曉燕2,秦波2*

(1 中國科學院大學,北京 100049;2 中國科學院蘭州化學物理研究所 中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室/甘肅天然藥物重點實驗室,蘭州 730000)

摘要:該研究以萵苣為受體植物,分析了酚酸類化感物質肉桂酸和咖啡酸對萵苣幼苗生長的活性效應及其作用機理,以揭示酚酸類化合物的化感作用機制。結果顯示:(1)不同濃度的肉桂酸均對萵苣幼苗根長、莖長及鮮重產(chǎn)生明顯的抑制作用,當肉桂酸的濃度為1 000 μmol/L時其對萵苣幼苗根長、莖長及鮮重的抑制率分別達到了89%、74%和49%;咖啡酸對萵苣幼苗根長和莖長均表現(xiàn)出低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)促進、高濃度(100和1 000 μmol/L)抑制的活性作用模式,且高濃度下肉桂酸對幼苗生長的抑制作用明顯強于咖啡酸。(2)較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的肉桂酸和咖啡酸對萵苣根尖細胞活力均無明顯影響;高濃度(100和1 000 μmol/L)的肉桂酸和咖啡酸使萵苣根尖細胞的死亡數(shù)明顯增加。(3)低濃度(0.1和1.0 μmol/L)的肉桂酸和較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的咖啡酸對萵苣根部的活性氧積累均無明顯影響;當肉桂酸處理濃度大于10 μmol/L及咖啡酸處理濃度大于100 μmol/L時,隨著濃度的升高萵苣根部活性氧的積累大量增加。研究表明,一定濃度的肉桂酸和咖啡酸均能夠誘導萵苣體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和積累,并降低幼苗根尖細胞的活力,進而影響萵苣幼苗的生長發(fā)育,且肉桂酸的生長抑制作用明顯強于咖啡酸。

關鍵詞:肉桂酸;咖啡酸;萵苣;化感效應;作用機理

Molisch于1937年首次提出了植物化感作用的概念,認為是所有植物(含微生物)之間的相互作用[1]。Rice在1984年將其較完善地定義為環(huán)境中一種植物(含微生物)直接或者間接地通過化學物質的釋放對另一種植物(含微生物)產(chǎn)生有利或者不利影響的現(xiàn)象[2]。化感作用廣泛存在于自然界中,與生態(tài)系統(tǒng)中的生物入侵以及農(nóng)業(yè)中的連作障礙等現(xiàn)象密切相關[3-4]。植物化感物質是植物體內(nèi)次生代謝的產(chǎn)物,自然狀況下主要通過體外釋放揮發(fā)物質、表面淋溶、根部分泌和殘體分解等4種途徑進入環(huán)境[3]?；形镔|能夠對受體植物生長發(fā)育的多個方面產(chǎn)生有利或不利的影響,對化感物質活性作用機理的解釋是植物化感研究中最主要的難點之一[5-6]。

酚酸通常為芳香環(huán)上帶有活性羧基的有機酸,是引起植物自毒作用的主要原因[7]。酚酸類化感物質普遍存在于高等植物體內(nèi)及其土壤中,主要通過根系的分泌作用釋放到環(huán)境中,進而抑制周圍其他植物的生長[8-10]。肉桂酸和咖啡酸是兩種常見的酚酸類化感物質。肉桂酸是茄子根系分泌物中主要的化感物質之一[11],能夠抑制過氧化物酶的活性并誘導類脂的過氧化[12],對黃瓜[13]、大豆[14]、辣椒[15]等多種植物的種子萌發(fā)及生長也產(chǎn)生影響?？Х人崮軌蛞种屏姿峄?、蛋白酶等多種酶的活性,對多種植物的萌發(fā)和生長產(chǎn)生影響[16-18]。前人對肉桂酸和咖啡酸這兩種酚酸的化感作用機制有報道[13,18],但對于不同結構酚酸類化合物化感作用效果差異的原因缺少相應的研究和佐證。本研究以化感作用較為敏感的萵苣為受體植物,在明確肉桂酸和咖啡酸活性作用效果的基礎上,進一步探討了2種酚酸類化合物對植物細胞活力以及活性氧的影響,并比較和分析了2種酚酸類化合物產(chǎn)生的化感作用效果的差異,為揭示肉桂酸和咖啡酸介導的化感作用及連作障礙機制提供參考。

1材料和方法

1.1實驗材料

萵苣品種為‘四季白尖葉’,種子購于四川種都種業(yè)有限公司。肉桂酸(反式為主)和咖啡酸標準品購于上海邁瑞爾化學技術有限公司,純度95%。

1.2材料培養(yǎng)與處理

肉桂酸和咖啡酸的標準品分別用DMSO溶解配制成100 mmol/L的母液,并用蒸餾水稀釋100倍得到最高試驗濃度為1 000 μmol/L的溶液,然后將此溶液依次稀釋10倍,得到最終處理濃度分別為1 000、100、10、1.0和0.1 μmol/L的5種處理溶液,分別取1 mL各種濃度的處理溶液置于鋪有濾紙的六孔板中。將萵苣種子放在培養(yǎng)皿中的濕潤濾紙上,并置于恒溫恒濕的培養(yǎng)箱(瑞華,HP150HS)中,25 ℃黑暗條件下萌發(fā)24 h后,選取生長一致的萵苣幼苗轉移到上述六孔板的濾紙上,以含有相同DMSO含量的水溶液為對照,每個處理至少6株幼苗,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,進行相關指標的觀察和測定。

1.3測定指標與方法

1.3.1生長指標測量肉桂酸和咖啡酸處理48 h后用毫米刻度尺測量幼苗的根長和莖長,用分析天平(Mettler-Toledo,AL104)測量幼苗鮮重。其中抑制率的計算公式為:

抑制率=(對照組數(shù)據(jù)-處理組數(shù)據(jù))/對照組數(shù)據(jù)×100%

1.3.2細胞活力觀察細胞活力觀察參照Koodkaew等[19]的方法。切取約0.5 cm的萵苣幼苗根尖,放入含有12.5 μg/mL二乙酸熒光素(FDA)和5 μg/mL碘化丙啶(PI)的染液中,避光著色10 min,蒸餾水沖洗干凈后置于載玻片上,在熒光顯微鏡(Leica,DMI4000B)下用450～490 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光下觀察并拍照。

1.3.3活性氧觀察活性氧觀察參考Garnczarska[20]的方法。室溫下萵苣幼苗的根在二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)染色液(含10 mmol/L DHE,0.01%丙酮和100 mmol/L CaCl2,pH=4.75)中避光染色5 min,然后在100 mmol/L CaCl2中震蕩清洗10 min以去除多余的染料,在熒光顯微鏡(Leica,DMI4000B)下用450～490 nm激發(fā)光和520 nm發(fā)射光下觀察并拍照。

1.4數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0進行差異顯著性分析,用Photoshop 7.0進行圖片處理。

2結果與分析

2.1肉桂酸和咖啡酸對萵苣幼苗生長的影響

不同濃度肉桂酸對受體植物萵苣幼苗的根、莖的伸長和鮮重均表現(xiàn)出抑制作用,且抑制作用隨處理濃度的升高而增強(表1)。其中,萵苣幼苗根長在較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的處理下比對照顯著減少了10%～14%,而在100和1 000 μmol/L濃度下的抑制率分別達到了24%和89%,在1 000 μmol/L下幼苗主根的生長幾乎完全受到抑制;萵苣幼苗莖的生長在肉桂酸處理濃度達到1.0 μmol/L時開始受到顯著性抑制,且抑制作用隨處理濃度的升高而增強,當濃度升高到1 000 μmol/L時已受到強烈的抑制(抑制率為74%);鮮重指標反映了幼苗整體生長水平,萵苣幼苗鮮重在 0.1 μmol/L的肉桂酸處理下已受到顯著性抑制,且隨著處理濃度的升高抑制效果更加顯著,鮮重的抑制率在濃度為1 000 μmol/L時已達到48%;隨著肉桂酸處理濃度(0.1、1、10和100 μmol/L)的升高,根長/莖長的數(shù)值隨之增大,表明相對于根長肉桂酸對萵苣幼苗莖長的抑制作用逐漸增強,當濃度升高到1 000 μmol/L時肉桂酸對根長的抑制作用顯著強于莖長。以上結果表明,肉桂酸通過對幼苗根、莖的伸長以及鮮重的抑制來影響萵苣幼苗的整體生長狀況,且在低濃度下就產(chǎn)生顯著的抑制作用,并存在劑量效應。

同時,咖啡酸對受體植物萵苣幼苗的根、莖的伸長均表現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的作用模式(表2)。其中,萵苣幼苗的主根長在咖啡酸的濃度為0.1和1.0 μmol/L時比對照(0 μmol/L)有一定的增加,并在10 μmol/L時達到顯著水平;而在高濃度(100和1 000 μmol/L)咖啡酸處理下主根長受到顯著抑制,抑制率分別為12%和25%。與主根生長的作用效果不同,萵苣莖的生長在 0.1 μmol/L的咖啡酸處理下就受到顯著促進,當濃度為1.0和10 μmol/L時雖仍受到一定促進,但未達到顯著性水平;在高濃度(100和1 000 μmol/L)咖啡酸處理下,莖長受到顯著抑制,抑制率分別為30%和41%。萵苣幼苗的鮮重在0.1、1.0和10 μmol/L的咖啡酸處理下與對照并無顯著性差異,僅在高濃度(100和1 000 μmol/L)時受到顯著性抑制,抑制率分別為15%和29%(表2);根長/莖長的數(shù)據(jù)表明較低處理濃度(0.1、1和10 μmol/L)下的咖啡酸對萵苣幼苗根長和莖長的促進作用效果相比對照無顯著差異,高濃度(100和1 000 μmol/L)下咖啡酸對莖長的抑制作用顯著強于根長。可見,咖啡酸主要是通過促進或抑制萵苣幼苗根、莖的伸長來影響其整體生長情況,且高濃度咖啡酸對幼苗莖長的抑制要明顯強于對根長的抑制。

表1　肉桂酸對萵苣幼苗根長、莖長和鮮重的化感作用

注:表中所列數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差;同指標內(nèi)不同字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異;下同。

Note:The data listed in the table as mean±SD;Different normal letters in the same characters indicated significant differences among treatments at 0.05 level;The same as below.

表2　咖啡酸對萵苣幼苗根長、莖長和鮮重的化感作用

通過比較可以發(fā)現(xiàn),肉桂酸在各種濃度下均對萵苣幼苗根、莖的伸長以及鮮重產(chǎn)生抑制作用,咖啡酸對幼苗根、莖的伸長則表現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的效果;高濃度(100和1 000 μmol/L)處理下,肉桂酸對萵苣幼苗根、莖的伸長以及鮮重的抑制作用明顯強于咖啡酸。

2.2肉桂酸和咖啡酸對萵苣根尖細胞活力的影響

逆境條件會導致植物體內(nèi)相關的酶失活或變性,嚴重時會造成細胞和組織的死亡。因此植物細胞活力的檢測是判定植物受傷害程度的直接和有效的方法[21]。本實驗采用熒光染料染色的方法分別檢測了不同濃度肉桂酸和咖啡酸處理下萵苣根尖細胞活力的變化情況。利用PI能使死細胞著色及FDA能使活細胞著色的特性,可以用熒光顯微鏡觀察FDA/PI雙染色后植物根尖的細胞活力[19]。結果(圖版Ⅰ,1～12)顯示,處理2 d后,較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的肉桂酸(圖版Ⅰ,1～4)和咖啡酸(圖版Ⅰ,7～10)對萵苣根尖細胞活力無明顯影響,染色結果與對照基本一致;當濃度達到100 μmol/L時,受體根尖細胞的死亡數(shù)均明顯增加(圖版Ⅰ,5、11);而在最高試驗濃度1 000 μmol/L下,肉桂酸和咖啡酸均使大部分的根尖細胞失去活力,同時可以看出肉桂酸使幼苗根部膨大變形(圖版Ⅰ,6、12)。以上結果說明一定濃度的肉桂酸和咖啡酸均能夠使萵苣根尖細胞的死亡數(shù)增加,顯著降低萵苣根尖細胞活力。

2.3肉桂酸和咖啡酸對萵苣根部活性氧的影響

3討論

隨著現(xiàn)代生物學理論技術和分離分析技術的快速發(fā)展,化感作用已成為解決農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及生態(tài)平衡等方面的研究熱點[25]。酚酸類化合物是一類重要的化感物質,廣泛地存在于植物體內(nèi)和耕種土壤中。酚酸類物質在土壤中積累是引起作物連作障礙的主要原因,對次年作物生長和土壤活性具有破壞性的影響,具有重要的研究意義[26-27]。

本試驗以兩種酚酸類化感物質肉桂酸和咖啡酸為研究對象,以蔬菜類植物萵苣為受體,采用植物生理學的方法,系統(tǒng)研究了肉桂酸和咖啡酸對萵苣幼苗生長指標以及對萵苣根部細胞活力和活性氧方面的影響,并比較和分析了2種酚酸類化合物作用效果的差異。結果顯示,不同濃度下的肉桂酸均對萵苣幼苗根長、莖長及鮮重等生長指標產(chǎn)生明顯的抑制作用;咖啡酸對萵苣幼苗根長和莖長均表現(xiàn)出低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)促進、高濃度(100和1 000 μmol/L)抑制的活性作用模式,且高濃度下肉桂酸對幼苗生長的抑制作用明顯強于咖啡酸。

本研究有關細胞活性和活性氧累積的觀察結果表明,在較高濃度(100和1 000 μmol/L)的肉桂酸和咖啡酸作用下,萵苣根尖端大部分細胞失去活力。低濃度(0.1和1.0 μmol/L)的肉桂酸和較低濃度(0.1、1.0和10 μmol/L)的咖啡酸對萵苣根部的活性氧積累均無明顯影響;當肉桂酸處理濃度大于10 μmol/L及咖啡酸處理濃度大于100 μmol/L時,隨著濃度的增大萵苣根部活性氧的積累大量增多。據(jù)此可以初步推測萵苣幼苗在兩種酚酸類化感物質的脅迫作用下會誘導活性氧的產(chǎn)生和積累,而活性氧的積累會進一步導致細胞膜結構和功能的破壞以及細胞活力的下降,最終影響受體植株的生長發(fā)育。

本研究通過對肉桂酸和咖啡酸化感作用機理的探索,初步闡釋了酚酸類物質對受體植物化感作用的植物生理學機理,并分析了不同結構酚酸類物質作用效果差異的原因,可為進一步揭示酚酸類物質化感作用以及作物連作障礙機理提供方法和依據(jù)。

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圖版 ⅠFDA和PI雙染色后肉桂酸和咖啡酸處理萵苣根尖細胞活力觀察

根尖的灰色部位代表失去活力的細胞;1～6.肉桂酸濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L;7～12.咖啡酸處理濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L。

Plate ⅠCell viability of lettuce root tips treated by cinnamic acid and caffeic acid after dyeing with FDA and PI

The gray zone of root tips represented cells without viability;Fig.1-6.The concentrations of cinnamic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively.Fig.7-12.The concentrations of caffeic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively.

圖版 ⅡDHE染色后肉桂酸和咖啡酸處理萵苣根部活性氧積累觀察

根部的橘紅色部位代表積累活性氧的細胞;1～6.肉桂酸濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L;7～12.咖啡酸濃度分別為0、0.1、1.0、10、100和1 000 μmol/L。

Plate ⅡEffects of cinnamic acid and caffeic acid on ROS production in lettuce roots dyeing with DHE

The orange red zone of roots represented cells that accumulating ROS;Fig.1-6.The concentrations of cinnamic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively;Fig.7-12.The concentrations of caffeic acid were 0,0.1,1.0,10,100 and 1 000 μmol/L,respectively.

(編輯:裴阿衛(wèi))

Allelopathic Effect and Mechanism of Cinnamic Acid and Caffeic Acid on the Growth of Lettuce

GUO Kai1,2,YAN Zhiqiang2,JIN Hui2,LI Xiuzhuang2,

HE Xiaofeng2,YANG Xiaoyan2,QIN Bo2*

(1 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;2 Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Abstract:In this paper,we investigated the allelopathic effects of cinnamic acid and caffeic acid and their phytotoxic mechanism on lettuce seedlings,in order to reveal the mechanism of allelopathy by phenolic acids.The results showed that:(1)root length,shoot length and fresh weight of lettuce seedlings were all obviously inhibited by cinnamic acid at different concentrations,and the inhibition rate of root length,shoot length and fresh weight at concentration of 1 000 μmol/L was 89%,74% and 49%,respectively.Root length and shoot length of lettuce seedlings both were promoted at low concentration (0.1,1.0 and 10 μmol/L) and inhibited at high concentration (100 and 1 000 μmol/L) by caffeic acid.Besides,the growth inhibition of cinnamic acid on lettuce seedlings was obviously stronger than that of caffeic acid at high concentration.(2)Cinnamic acid and caffeic acid both had no significant effect on cell viability in lettuce root tips at low concentration (0.1,1.0 and 10 μmol/L).High concentration (100 and 1 000 μmol/L) of cinnamic acid and caffeic acid both significantly increased the number of dead cells.(3)Low concentration of cinnamic acid (0.1 and 1.0 μmol/L) and caffeic acid (0.1,1.0 and 10 μmol/L) both had no significant effect on the accumulation of reactive oxygen species (ROS).When the concentration of cinnamic acid was over 10 μmol/L and the concentration of caffeic acid was over 100 μmol/L,the accumulation of ROS increased rapidly with the increasing of concentration.ROS was induced and accumulated in lettuce seedlings under the stress of cinnamic acid and caffeic acid,which leaded to the reduction of cell viability and finally affected the growth and development of lettuce seedlings.Furthermore,the inhibition effect of cinnamic acid was significantly stronger than that of caffeic acid.

Key words:cinnamic acid;caffeic acid;lettuce;allelopathic effect;mode of action

中圖分類號:Q942.5;Q945.7

文獻標志碼:A

作者簡介:郭凱(1990-),男,碩士研究生,主要從事植物活性物質的分離分析及作用機理研究。E-mail:guokaidts@163.com*通信作者:秦波,研究員,主要從事植物化學生態(tài)學基礎與應用研究。E-mail:bqin@licp.cas.cn

基金項目:國家自然科學基金(31070386,21302195,31300290);中國科學院蘭州分院甘肅省院地合作項目;甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目(GNSW-2015-25)

收稿日期:2015-08-11;修改稿收到日期:2015-10-07

文章編號:1000-4025(2016)01-0093-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0093