高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定土貝母中土貝母苷甲、乙和丙的含量*

黃 瑾，張 杰，顧正兵

（1．上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 201299； 2．江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 泰州 225300）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定土貝母中土貝母苷甲、乙和丙的含量*

黃 瑾1，張 杰2，顧正兵2

（1．上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 201299； 2．江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 泰州 225300）

目的 建立同時(shí)測(cè)定土貝母中土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙3種皂苷類成分含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法 色譜柱采用Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈－水(31∶69)，流速為1．0 mL／min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。結(jié)果 土貝母苷甲、乙、丙進(jìn)樣量分別在1．28～12．8 μg，0．241～2．41 μg，0．515～5．15 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99．10%，98．95%和98．78%，RSD分別為0．43%，0．62%，0．46%(n＝6)。結(jié)論 該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可為土貝母的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

土貝母；高效液相色譜法；土貝母苷甲；土貝母苷乙；土貝母苷丙

土貝母為葫蘆科植物土貝母 Bolbostemma panicula- tum(Maxim．)Franquet的干燥塊莖，具有解毒、散結(jié)、消腫的功效，主治乳癰、瘰疬、痰核[1]。土貝母中的皂苷類成分具有顯著的抗腫瘤及抗促瘤活性，其皂苷類代表性成分為土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙，且土貝母苷乙和丙抗腫瘤活性強(qiáng)于土貝母苷甲，毒性均低于苷甲[2－10]。2010年版《中國(guó)藥典(一部)》僅以土貝母苷甲為指標(biāo)性成分，不能全面控制此藥材的質(zhì)量。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于土貝母含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且均為單一測(cè)定了土貝母苷甲的含量[11－13]。本試驗(yàn)中建立了同時(shí)測(cè)定土貝母中土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙含量的高效液相色譜(HPLC)法，可為土貝母藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters－1525型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Sartorius CP225D十萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ 2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。對(duì)照品土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙均從土貝母中經(jīng)制備液相分離純化得到，經(jīng)過(guò)MS，1H－NMR，13C－MNR鑒定化合物結(jié)構(gòu)，通過(guò)HPLC測(cè)定，用面積歸一化法計(jì)算純度均大于 98%。乙腈（色譜純，上海藍(lán)世生化技術(shù)有限公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。土貝母藥材來(lái)源于全國(guó)各地，經(jīng)嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院王峻副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液制備

取不同來(lái)源的樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱重，用70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過(guò)，即得供試品溶液。精密稱取對(duì)照品土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙適量，分別用甲醇制成土貝母苷甲、乙、丙質(zhì)量濃度為1．941，0．604 1，0．736 3 g／L的單一對(duì)照品貯備液。精密量取上述3個(gè)對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋，制成每1 mL分別含土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙0．640 2，0．120 8，0．257 6 mg的混合對(duì)照品溶液。

2．2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－水（31∶69）；流速：1．0 mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。在此條件下，對(duì)照品及供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。以峰面積值（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）作線性回歸，得土貝母苷甲的回歸方程為 Y＝118 640X－56 002（R2＝0．999 3），線性范圍為1．28～12．8μg；土貝母苷乙的回歸方程為 Y＝105700X－12 908（R2＝0．999 5），線性范圍為0．241～2．41 μg；土貝母苷丙的回歸方程為 Y＝92 380 X－20 936（R2＝0．998 7），線性范圍為0．515～5．15 μg。

精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙峰面積的RSD分別為0．73%，1．2%，1．0%(n＝6)，表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批土貝母藥材 6份，按 2．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙含量的測(cè)定，結(jié)果的 RSD分別為 1．1%，1．7%，1．4%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)行HPLC測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙峰面積的 RSD分別為1．2%，2．3%，1．6%(n＝5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批已知含量的樣品6份，每份約0．5 g，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入一定量的對(duì)照品貯備液，按2．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種皂苷類成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測(cè)定

取不同來(lái)源的干燥土貝母粉末約1．0 g，精密稱定。按2．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算不同來(lái)源的土貝母藥材中土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同來(lái)源土貝母藥材中各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg／g，n＝3)

3 討論

本試驗(yàn)中比較了甲醇－水、乙腈－水兩個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，由于土貝母苷乙和土貝母苷丙結(jié)構(gòu)相近，極性差異小，甲醇－水系統(tǒng)不能使3個(gè)成分很好地分離，其次甲醇在確定的檢測(cè)波長(zhǎng)（214 nm）下末端吸收較大，從而確定選擇乙腈－水系統(tǒng)。曾比較過(guò)等度洗脫以及梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)以乙腈－水（31∶69）為流動(dòng)相等度洗脫，各成分均能達(dá)到基線分離，且分析時(shí)間較短。此外，利用DAD檢測(cè)器對(duì)200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的色譜峰進(jìn)行對(duì)比，綜合考慮基線、色譜峰峰形及響應(yīng)值、干擾成分，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。

樣品提取時(shí)，以土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了超聲、回流2種提取方式及甲醇、乙醇2種提取溶劑，綜合考慮，確定用乙醇超聲提取。用單因素考察乙醇濃度、提取體積和提取時(shí)間，確定最佳工藝為70%乙醇、25 mL、超聲提取0．5 h。此供試品溶液制備方法，與2010版《中國(guó)藥典》相應(yīng)的方法比較，用70%乙醇經(jīng)超聲提取，過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)環(huán)保且分離效果好。

由表2可知，土貝母藥材中土貝母苷甲含量＞土貝母苷丙含量＞土貝母苷乙含量，4個(gè)不同來(lái)源的土貝母藥材中各成分含量差異較小，其中山西產(chǎn)土貝母含量相對(duì)略高。本試驗(yàn)中首次建立了用HPLC法同時(shí)測(cè)定土貝母藥材中土貝母苷甲、土貝母苷乙和土貝母苷丙含量的方法，操作簡(jiǎn)單可行、結(jié)果準(zhǔn)確，為土貝母的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

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Determination of TubeimosideⅠ,TubeimosideⅡand TubeimosideⅢ in Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet by HPLC

Huang Jin1,Zhang Jie2,Gu Zhengbing2

(1．Department of Pharmacy,Shanghai Pudong New Area People′s Hospital,Shanghai,China 201299; 2．Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Technology CO．,LTD．,Taizhou,Jiangsu,China 225300)

Objective To develop an HPLC method for content determination of tubeimosideⅠ,t－ubeimosideⅡand tubeimosideⅢ in Bolbostemmapaniculatum(Maxim．)Franquet．Methods The determination was carried out on a C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm) eluted with acetonitrile and water．The flow rate was 1．0 mL／min,and the detected wavelength was set 214 nm．Results The peak areas and the sample quantity of the three components had good linear relationship in the range of 1．28～12．8 μg for tubeimosideⅠ, 0．241～2．41 μg for tubeimosideⅡ and 0．515～5．15 μg for tubeimosideⅢ．The average recoveries were 99．10%,98．95% and 98．87%,respectively．Conclusion The method was proved to be simple,accurate and provided reference for comprehensive quality control of Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet．

Bolbostemma paniculatum(Maxim．)Franquet;HPLC;tubeimosideⅠ;tubeimosideⅡ;tubeimosideⅢ

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)01－0058－03

黃瑾，博士研究生，主要從事藥品檢驗(yàn)工作，(電話)021－58921995(電子信箱)john70550＠163．com；顧正兵，博士研究生，主要從事藥品檢驗(yàn)工作，本文通訊作者，(電話)0523－80183620(電子信箱) zbg＠youging．com。

2015－07－28；

2015－09－22)

*上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生局面上項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：PW2013A－12。