真菌性角膜炎診治方法的研究進(jìn)展

胡嘉純 高娜

真菌性角膜炎是一種好發(fā)于亞洲及非洲,在年輕男性中發(fā)病率較高,由真菌感染所致,可能導(dǎo)致角膜損傷、眼內(nèi)感染甚至失明的十分兇險(xiǎn)的眼部疾病[1]。有研究表明至少30%的真菌性角膜炎患者會(huì)出現(xiàn)角膜穿孔或是藥物治療無(wú)效的情況,因此早期診斷以及合理預(yù)防對(duì)于治療真菌性角膜炎有著重要的作用[2]?，F(xiàn)對(duì)真菌性角膜炎診斷及治療的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 真菌性角膜炎的診斷

1.1 傳統(tǒng)診斷方式

真菌性角膜炎的傳統(tǒng)診斷方式主要有顯微鏡檢查以及微生物培養(yǎng),此二者現(xiàn)階段仍然是實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。然而這兩種診斷方式都具有一定的局限性,首先兩種方式都存在假陰性的可能,并且都以有創(chuàng)性組織取樣為基礎(chǔ)。再者,顯微鏡檢查的檢出結(jié)果會(huì)受到病灶大小以及取材量的影響,微生物培養(yǎng)又往往需要數(shù)日甚至數(shù)周的培養(yǎng)時(shí)間,對(duì)于深層浸潤(rùn)的病灶檢出率較低。

這些局限性都在某種程度上影響了真菌性角膜炎的早期診斷,于是隨著人們研究的深入,能夠縮短診斷時(shí)間或是擁有更高特異性的診斷方式不斷涌現(xiàn)。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)

運(yùn)用PCR檢測(cè)診斷真菌性角膜炎也基于角膜刮片,這是一種將微量基因提取物放大擴(kuò)增后與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)照從而推斷病原體種類的分子生物學(xué)技術(shù),僅需要極少量的樣本便能較快的進(jìn)行診斷。Ferrer等人[4]在10年間使用涂片鏡檢、培養(yǎng)和PCR(其中PCR檢測(cè)和分子鑒定是通過(guò)DNA陽(yáng)離子對(duì)角膜樣本的ITS和5.8S rRNA區(qū)域進(jìn)行測(cè)序)對(duì)20名確診真菌性角膜炎患者的27個(gè)角膜樣本進(jìn)行檢測(cè)。在27例真菌性角膜炎患者樣本中,PCR檢測(cè)陽(yáng)性率高達(dá)92.6%并且這些陽(yáng)性結(jié)果在4～8小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生,而微生物培養(yǎng)中真菌的需要1～35天的時(shí)間;此外,PCR檢測(cè)時(shí)僅無(wú)法識(shí)別一個(gè)角膜樣本的物種,而使用常規(guī)技術(shù)時(shí),僅能識(shí)別8名患者的致病菌。但是PCR只能檢測(cè)已知DNA序列和引物的生物體,無(wú)法評(píng)估臨床治療效果,并且需要更加高昂的成本。

1.3 角膜激光共焦顯微鏡檢查(IVCM)

角膜共焦顯微鏡檢查是一種非侵入性的角膜成像檢查,能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷。Y E Wang等人[5]的研究表明,IVCM能夠迅速準(zhǔn)確的診斷感染性角膜炎,并且對(duì)真菌性角膜炎的診斷具有極高的特異性及敏感性,同時(shí)能夠根據(jù)菌絲數(shù)量等評(píng)估疾病進(jìn)展情況評(píng)價(jià)療效。Hoffman等人[6]的研究也得出了相似的結(jié)論,與PCR以及微生物培養(yǎng)相比,IVCM對(duì)于診斷真菌性角膜炎的敏感性高達(dá)81.8%,遠(yuǎn)高于PCR及微生物培養(yǎng)。

除此之外,一系列研究表明在IVCM圖像中曲霉菌的菌絲直徑為3～10微米,平均長(zhǎng)度為200～400微米,菌絲分支角度為45度,而鐮刀菌的菌絲直徑為3～5微米,平均長(zhǎng)度為200～300微米,菌絲分支角度為90度[7]。這提示我們,IVCM不僅能夠區(qū)別不同種類的微生物,甚至能夠區(qū)分真菌菌屬的種類。但在Tabatabaei等人[8]的一項(xiàng)研究中通過(guò)IVCM沒(méi)有觀測(cè)到曲霉菌與鐮刀菌菌絲分支角度的明顯差異,對(duì)于IVCM是否能夠準(zhǔn)確辨別真菌菌屬仍需要進(jìn)一步的臨床研究來(lái)確認(rèn)。

1.4 其他分子診斷方式

近年來(lái),在感染性角膜炎的診斷中,分子診斷逐漸嶄露頭角。除了前文中所提到的PCR以外,還出現(xiàn)了許多基于PCR方法的分子診斷方法。比如宏基因組深度測(cè)序(MDS)是通過(guò)提取樣本中全部RNA,通過(guò)16個(gè)PCR周期擴(kuò)增放大之后進(jìn)行測(cè)序,耗時(shí)約5～7天,能夠提高真菌性角膜炎診斷的敏感性與準(zhǔn)確度。Lalitha等人[9]通過(guò)潛在類別分析(LCA),評(píng)估了常規(guī)診斷、DNA測(cè)序和RNA測(cè)序的敏感性和特異性,RNA測(cè)序?qū)?duì)真菌病例具有100%的敏感性和97%的特異性遠(yuǎn)高于KOH/革蘭氏染色(70%)、微生物培養(yǎng)(52%)以及MDS(74%)。

還有一種早期僅被用于細(xì)菌診斷的分子診斷方法,即MALDI-ToF Mass Spectrometry,通過(guò)質(zhì)量普的不同鑒別微生物,現(xiàn)已被用來(lái)鑒別真菌菌種,尤其被廣泛運(yùn)用于酵母菌、絲狀真菌屬、曲霉菌、青霉菌、鐮刀菌以及粘液菌的鑒定[10]。同樣存在僅能鑒別已有質(zhì)量譜數(shù)據(jù)的真菌菌種的局限性。另外通過(guò)淚液蛋白組學(xué)方法,即通過(guò)對(duì)不同治療階段患者淚液樣本進(jìn)行分析,能夠獲取真菌性角膜炎患者眼表防御及損傷的全面信息,這對(duì)于確定真菌性角膜炎的臨床進(jìn)程及療效情況有著一定指導(dǎo)性意義[11]。

分子診斷方式不斷開(kāi)拓我們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)與診斷,但它們往往具有相類的局限性,具體表現(xiàn)為價(jià)格高昂、可供查閱的對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容有限等,仍需要不斷探索,以期實(shí)現(xiàn)真菌性角膜炎便捷而又準(zhǔn)確的診斷。

2 真菌性角膜炎的治療方式

2.1 局部藥物治療

用于治療真菌性角膜炎的外用藥物主要包括5%那他霉素、0.15%～0.3%兩性霉素B、1%伏立康唑、1%益康唑、1%伊曲康唑以及1%咪康唑[12]。那他霉素是唯一一種被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于眼部的局部抗真菌藥物,其對(duì)于鐮刀菌屬、曲霉菌等多種真菌所致的真菌性角膜炎療效顯著。兩性霉素B是一種多烯類抗真菌藥物,雖然具有潛在毒性,但其廣譜活性、低耐藥性以及良好的臨床療效,被用于治療侵襲性真菌感染已超過(guò)50年,是酵母菌感染所致真菌性角膜炎的首選治療藥物[12]。伏立康唑被認(rèn)為是一種優(yōu)秀的那他霉素替代品,有良好的眼部滲透性,具有較高的生物利用度,對(duì)全身及局部均有效,但存在導(dǎo)致視覺(jué)障礙、色覺(jué)障礙或?qū)饷舾行栽黾拥雀弊饔肹13]。

除了常規(guī)的抗真菌藥物,一些防腐劑或消毒劑,具有廣譜抗菌活性,可以對(duì)抗細(xì)菌、酵母菌、霉菌和某些病毒,Pinna等人[13]的體外研究評(píng)估了0.05%己脒定二羥乙基硫酸鹽溶液以及0.6%聚維酮碘的抗菌活性,發(fā)現(xiàn)它們都對(duì)念珠菌屬有較強(qiáng)的抗菌活性。在尼泊爾的一項(xiàng)試驗(yàn)比較了0.2%洗必泰與5%那他霉素對(duì)于真菌性角膜炎的治療效果,雖然0.2%的洗必泰無(wú)法取代5%那他霉素成為治療真菌性角膜炎的一線藥物,但是其對(duì)真菌性角膜炎也存在切實(shí)的療效[14],基于其價(jià)格低廉較易獲取的特點(diǎn),對(duì)于經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)也不失為一種治療手段。

為了提高治療效果,這些局部滴眼液在真菌性角膜炎的治療中常常并非單獨(dú)使用,聯(lián)合使用能夠增加療效,比如那他霉素和伏立康唑聯(lián)合使用表現(xiàn)出更高的抗真菌活性。

2.2 基質(zhì)內(nèi)注藥

除了藥物聯(lián)合使用外,不同給藥途徑也能增加藥物作用時(shí)間及濃度從而提高療效,減輕并發(fā)癥反應(yīng)。

Narayana等人[15]的隨機(jī)對(duì)照研究評(píng)估了基質(zhì)內(nèi)注射1%伏立康唑?qū)χ兄囟冉z狀真菌性角膜炎的療效,比較第三天和第七天培養(yǎng)陽(yáng)性率以及最終疤痕大小,與僅使用5%那他霉素滴眼液治療相比,聯(lián)合基質(zhì)內(nèi)注射伏立康唑的受試者角膜穿孔率降低。另一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)比較了基質(zhì)內(nèi)注射那他霉素、伏立康唑以及兩性霉素B的療效,其中基質(zhì)內(nèi)注射那他霉素的治療組恢復(fù)時(shí)間更快[16]。

2.3 其他輔助治療手段

另外還有一些輔助手段能夠提高藥物作用效果。Roy等人[17]研究表明兩性霉素B的微針眼貼片在離體和活體真菌性角膜炎兔子模型中均有良好的表現(xiàn),提高了兩性霉素B的眼部滲透性。有研究和病例報(bào)告表明常用于圓錐角膜、透明邊緣性角膜變性以及大皰性角膜病變等角膜擴(kuò)張性疾病的治療方法角膜膠原膠聯(lián)能夠增強(qiáng)抗真菌藥物的眼部滲透性,是治療真菌性角膜炎的有效輔助療法[18]。一項(xiàng)對(duì)41名真菌性角膜炎患者的隨機(jī)研究中,角膜膠原膠聯(lián)作為局部藥物治療的輔助治療,加快了浸潤(rùn)灶的愈合速度,縮短了用藥時(shí)間及用藥強(qiáng)度[19]。近期Jian He等人[20]一項(xiàng)研究表明使用可視化鎵/溶壁酶整合抗菌劑在小鼠真菌性角膜炎模型中取得了比兩性霉素b更好的療效,該方式通過(guò)降解真菌的細(xì)胞壁和生物膜基質(zhì)中的β-葡聚糖等胞外多糖從而有效殺滅真菌。

2.4 全身藥物

全身抗真菌藥物主要作為外用藥物的輔助治療,適用于大小>5 mm、基質(zhì)深度>50%的潰瘍或是頑固性感染、雙眼感染、鞏膜炎、角膜緣受累、眼內(nèi)炎、兒童、角膜移植術(shù)后以及即將發(fā)生角膜穿孔的病例[21]。全身抗真菌藥物雖然常常是輔助治療,但單獨(dú)使用也有較好的療效。一組病例表明,僅口服伏立康唑(200 mg bid)治療真菌性角膜炎,能夠減輕癥狀、清除微生物,對(duì)真菌性角膜炎有顯著療效[22]。一份來(lái)自伊朗的關(guān)于眼部真菌對(duì)唑類藥物敏感性的報(bào)告顯示,伏立康唑及伊曲康唑的衍生物泊沙康唑?qū)Υ蠖鄶?shù)鐮刀菌屬、曲霉菌屬以及酵母菌屬都具有優(yōu)異的抗真菌活性,不過(guò)對(duì)曲霉菌屬及彎孢霉屬的最低抑菌濃度較高[23]。Ferguson等人[24]的一組病例報(bào)告表明,大劑量口服泊沙康唑(500～600 mg qd)對(duì)常規(guī)藥物治療無(wú)效的真菌性角膜炎(兩例鐮刀菌屬和一例青霉菌屬)能迅速起作用,并且在這組病例中大劑量泊沙康唑治療未發(fā)現(xiàn)明顯的全身副作用。大劑量使用的全身抗真菌藥物或?qū)⒊蔀槌Ｒ?guī)治療無(wú)效的真菌性角膜炎的突破口。

2.5 手術(shù)治療

真菌性角膜炎患者行治療性穿透性角膜移植(TPK)手術(shù)治療的常見(jiàn)適應(yīng)癥包括角膜穿孔、即將穿孔以及保守治療無(wú)效的頑固性角膜炎,然而角膜移植術(shù)后的再次感染是真菌性角膜炎的發(fā)生率在6%到16%之間,由于擔(dān)心再次感染往往會(huì)在角膜移植術(shù)后延遲使用類固醇滴眼劑的時(shí)間,這又可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)重,移植物失代償以及新生血管生成。在最近的一項(xiàng)臨床研究中,Chatterjee等人[25]在真菌性角膜炎TPK術(shù)后早期利用0.1%環(huán)孢素A滴眼劑替代類固醇滴眼劑,研究結(jié)果表明這樣既可以提高植片存活率及術(shù)后視力也能夠降低再次感染的風(fēng)險(xiǎn),這或許將會(huì)提升真菌性角膜炎手術(shù)治療成功率。

2.6 綜合治療

真菌性角膜炎的治療是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,在臨床往往需要局部、全身以及手術(shù)治療適當(dāng)結(jié)合。Sharma等人[21]便用“局部、全身和靶向治療方案”治療了223例真菌性角膜炎,首先所有病例在最初局部使用5%那他霉素每小時(shí)一次,48小時(shí)后減少為每?jī)尚r(shí)一次直到潰瘍?cè)钔耆匦律掀せ贉p為每四小時(shí)一次,持續(xù)三周。若是在治療的第7～10天效果不佳則局部增加1%伏立康唑與那他霉素同頻率使用,若再過(guò)七到十天仍療效不佳則每隔72小時(shí)在基質(zhì)內(nèi)注射伏立康唑(最多4次)。除此之外,對(duì)于潰瘍?cè)畲笮?5 mm、深度>50%或即將穿孔的病例,則額外口服200 mg伏立康唑或酮康唑每天兩次。對(duì)于治療無(wú)效或是角膜穿孔的病例則進(jìn)行TPK,此方案的成功率為79.8%。這項(xiàng)研究提供了一個(gè)可供參照的循序漸進(jìn)的治療方案。

3 結(jié)語(yǔ)

真菌性角膜炎的診斷和治療仍面臨著一些困難與挑戰(zhàn),縱觀數(shù)十年來(lái)對(duì)于真菌性角膜炎研究的發(fā)展軌跡,能夠達(dá)成共識(shí)的高效診療方式較少。現(xiàn)階段一些分子診斷方法以及一些輔助治療手段不斷涌現(xiàn),真菌性角膜炎的診斷已經(jīng)入分子時(shí)代,,但是迄今為止仍然缺少對(duì)真菌性角膜炎治療的明確指導(dǎo)。對(duì)于真菌性角膜炎的早期診治方式仍需我們繼續(xù)探索,提升早期診斷率以及治療的成功率,降低角膜穿孔及失明等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生機(jī)率。