RAPD法鑒定紫花苜蓿品種的條件優(yōu)化

?趙菲佚，焦成瑾，李志明，康濤濤，安建平

（天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

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RAPD法鑒定紫花苜蓿品種的條件優(yōu)化

趙菲佚，焦成瑾，李志明，康濤濤，安建平

（天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

摘 要：以阿爾岡金等6個(gè)地方主栽的紫花苜蓿品種為材料，對隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）法鑒定不同紫花苜蓿品種的試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，使用改良的CTAB法提取紫花苜?；蚪MDNA蛋白較少，質(zhì)量較高；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中使用1 U/μL的Taq DNA聚合酶、10 ng/μL的 DNA模板和300 μmol/L的dNTP，擴(kuò)增的條帶較多，且較清晰，適宜于后續(xù)RAPD法鑒定；從100條10個(gè)堿基的隨機(jī)引物中篩選出S37與S140兩條引物，適用于6個(gè)不同苜蓿品種的鑒定。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；DNA提?。浑S機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）；條件優(yōu)化

紫花苜蓿在我國西北地區(qū)廣泛種植，有著悠久的歷史和廣泛的分布[1-2]，其作為豆科牧草，具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)高蛋白等特點(diǎn)，被稱作“牧草之王”。我國苜蓿品種豐富，除了種以外，還有亞種、變種及其近緣種等[3]。長期以來，對紫花苜蓿品種的鑒定主要從其形態(tài)學(xué)[4]和生化水平[5]著手。然而，不同品種紫花苜蓿個(gè)體間的形態(tài)差異并不明顯，僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)特征難以識別。從遺傳學(xué)角度來看，紫花苜蓿屬植物屬于同源4倍體，目前其全基因組仍無法全部破譯。因此，快速簡便的品種鑒定方法對紫花苜蓿的推廣應(yīng)用具有重要意義。近年來，分子水平上的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）為紫花苜蓿品種鑒定提供了新的思路[6-8]。

RAPD是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種可對整個(gè)未知序列基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)方法，具有標(biāo)記數(shù)量多、準(zhǔn)確性和靈敏度較高、 成本較低、通用性良好，且不需要預(yù)先知道基因組序列組成等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源分析、生物種群劃分、遺傳相關(guān)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等領(lǐng)域[9-13]。但該方法存在穩(wěn)定性不高的缺點(diǎn)，而且這個(gè)缺點(diǎn)多數(shù)情況下是由RAPD試驗(yàn)條件不夠優(yōu)化導(dǎo)致的。因此，研究以阿爾岡金等6個(gè)地方主載的紫花苜蓿品種為材料，對RAPD鑒定紫花苜蓿品種的試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為當(dāng)?shù)刈匣ㄜ俎Ｆ贩N的鑒定及選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試紫花苜蓿品種的種子均來自天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，詳細(xì)信息見表1。

表1　供試紫花苜蓿品種及產(chǎn)地

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將各品種紫花苜蓿種子用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，然后用滅菌ddH2O浸泡5 h，置于MS固體培養(yǎng)基中豎直培養(yǎng)。在光照強(qiáng)度7 000 Lux（光周期L︰D=16︰8），溫度24℃的條件下培養(yǎng)2周，即可取材提取DNA。

1.2.2 DNA提取 紫花苜蓿DNA提取使用2種方法進(jìn)行。常規(guī)CTAB法操作如下：（1）稱0.2 g苜蓿葉片置于研缽中，加少量的石英砂，研磨；（2）先加入1 mL CTAB提取液（1 mol/L Tris-HCl，pH值8.0，0.5 mol/L EDTA，pH值8.0，5 mol/L NaCl，2% CTAB）進(jìn)行研磨，再加入1 mL CTAB提取液繼續(xù)研磨至勻漿樣，將其移至兩個(gè)1.5 mL的離心管內(nèi)，放入65℃水浴處理1 h；（3）取出后11 000 r /min離心10 min，上清液移入另一離心管中后加入等體積的氯仿-異戊醇（V︰V=24︰1），混合均勻，10 000 r /min離心10 min，取上層水相，加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4℃下10 000 r /min再次離心10 min，棄上清；（4）用75%的乙醇洗滌沉淀兩次，室溫干燥；（5）加入50 μL的TE（pH值8.0）充分溶解，-20℃下保存待用。改良法CTAB法在氯仿-異戊醇操作（第3步）中進(jìn)行2次抽提，使用異丙醇進(jìn)行DNA沉淀，其余步聚與常規(guī)CTAB法相同。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測 將已提取的DNA樣品使用TE稀釋一定倍數(shù)后用UV-9200型號紫外分光光度計(jì)在260 nm、280 nm處進(jìn)行吸光值測定，根據(jù)OD260/ OD280的比值來判斷DNA的純度，根據(jù)OD260計(jì)算DNA的含量。此外，將DNA樣品在0.8%瓊脂糖凝膠，5 V/cm 電場中電泳，用溴化乙錠染色檢測DNA的完整性。

1.2.4 RAPD隨機(jī)引物合成 設(shè)計(jì)了100條10個(gè)堿基的隨機(jī)引物（上海生物工程公司），其中主要引物的編號及序列如表2所示。

表2　RAPD分析篩選引物序列

1.2.5 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 擴(kuò)增反應(yīng)使用20 μL反應(yīng)體系，組成如下：ddH2O 14 μL，10×PCR buffer 2 μL，MgCl21.6 μL，dNTP 0.6 μL，DNA模板1 μL，引物0.3 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL。設(shè)計(jì)不同濃度的dNTP、DNA模板和Taq DNA 聚合酶對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。（1）Taq DNA 聚合酶濃度：為獲得RAPD法PCR擴(kuò)增時(shí)最優(yōu)Taq DNA聚合酶濃度，以苜蓿品種三得利的DNA為模板，以S26、S37、S58、S87、S96、S122為引物，分別用0.1、0.5和l .0 U/μL的Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)。（2）模板濃度：為了確定苜蓿RAPD時(shí)DNA模板的最適濃度，以阿爾岡金（引物為S37）和得福（引物為S58）的DNA為模版，分別使用20、10和5 ng/μL的濃度進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)。（3）dNTP濃度：為篩選到RAPD法PCR擴(kuò)增時(shí)dNTP的最佳濃度，以阿爾岡金（引物為S37）和得福（引物為S58）的DNA為模版，分別使用250、300和350 μmol/L的dNTP進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.2.6 PCR擴(kuò)增程序 94℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 1 min，38℃ 1 min，72℃ 1 min，42個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min延伸，4℃結(jié)束擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠和1×TBE緩沖液中電泳，0.5 μg/mL的EB染色，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.2.7 RAPD擴(kuò)增 利用已優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，從100條隨機(jī)引物中對阿爾岡金、得福、三得利、新疆大葉、三得利、隴東苜蓿6個(gè)品種進(jìn)行RAPD分析，選擇可用于鑒定這6個(gè)不同苜蓿品種的引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對基因組DNA提取質(zhì)量的影響

從表3中可以看出，常規(guī)法提取的DNA含量平均為236.3 ng/μL，OD260/OD280比值小于1.8，說明DNA的純度較低，可能存在著蛋白污染。而改進(jìn)的CTAB法提取的DNA含量平均為442.5 ng/μL，OD260/ OD280比值在1.8左右，說明改進(jìn)的CTAB法提取的DNA含量高，DNA純度較好，能夠滿足后續(xù)的RAPD鑒定要求。從圖1中也可以看出，常規(guī)法提取的DNA條帶不清晰，而改進(jìn)法提取的DNA條帶明顯，且整齊無彌漫，但有少量拖尾現(xiàn)象，基本沒有降解和RNA污染增。因此，后續(xù)試驗(yàn)均以改良的CTAB法提取苜蓿DNA。

表3　不同方法提取的苜蓿DNA質(zhì)量的比較

2.2 不同反應(yīng)條件對PCR擴(kuò)增效果的影響

2.2.1 Taq DNA 聚合酶濃度 如圖2A顯示，當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度為0.1 U/μL時(shí)，S26、S87、S96、S122沒有出現(xiàn)條帶，S37只出現(xiàn)了一條帶，S58出現(xiàn)的條帶不明顯。由圖2B可知，當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度為0.5 U/μL時(shí)，S58、S87未出現(xiàn)條帶，S26、S37僅出現(xiàn)了1～2條帶，S96和S122出現(xiàn)的條帶不明顯。從圖2C中可以看出，當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度為1.0 U/μL時(shí)，6個(gè)引物均能擴(kuò)增出條帶，而且條帶數(shù)目較多且明顯。此結(jié)果表明，在紫花苜蓿RAPD法中建議使用1.0 U/μL的Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖1　 不同方法對DNA提取效果的影響

2.2.2 模板DNA濃度 從圖3中可看出，對阿爾岡金和得幅兩個(gè)品種，當(dāng)DNA模版濃度為20和10 ng/ μL時(shí)，均可以擴(kuò)增出條帶，且條帶較多，擴(kuò)增片段大小相差較?。欢?dāng)模板DNA濃度為5 ng/μL時(shí)，幾乎無法觀察到條帶。因此，在紫花苜蓿RAPD法中建議使用10 ng/μL的模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

圖3　 不同濃度的模板DNA對RAPD擴(kuò)增的影響

2.2.3 dNTP濃度 如圖4所示，當(dāng)dNTP濃度為350 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較少，且條帶不明顯；當(dāng)dNTP濃度為250 μmol/L時(shí)，阿爾岡金可擴(kuò)增出較為理想的條帶，但得福的擴(kuò)增效果較差，所獲條帶較少，且缺乏主帶；當(dāng)dNTP濃度為300 μmol/L時(shí)，兩個(gè)品種擴(kuò)增的條帶數(shù)目均較多，存在較為明顯的主帶，且條帶分布均勻。因此，在紫花苜蓿RAPD法中建議使用300 μmol/L的dNTP進(jìn)行擴(kuò)增。

圖4　 不同濃度dNTP對RAPD擴(kuò)增的影響

2.3 紫花苜蓿不同品種的RAPD分析

在100條隨機(jī)引物中，篩選到S37及S140引物在PCR擴(kuò)增后可分別產(chǎn)生6種不同的帶型，如圖5所示，引物S37和S140均可產(chǎn)生可區(qū)別的6種不同PCR擴(kuò)增帶型，其中S37擴(kuò)增6個(gè)等位位點(diǎn)，24個(gè)總條帶，等位基因多態(tài)性率50%；S140擴(kuò)增7個(gè)等位位點(diǎn)，19個(gè)總條帶，等位基因多態(tài)率為50%；與S37相比較，S140的擴(kuò)增總條帶較少，但其多態(tài)性率水平一致。這說明這兩條引物盡管RAPD擴(kuò)增的等位基因不同，但具有較高的多態(tài)率，均可用于對苜蓿品種的鑒定。

通過對RAPD試驗(yàn)條件的優(yōu)化，獲得了穩(wěn)定的RAPD擴(kuò)增條帶，從而在實(shí)踐中可應(yīng)用此方法對苜蓿品種進(jìn)行鑒定。

圖5　 最優(yōu)條件下不同苜蓿品種的RAPD擴(kuò)增帶型

3 討 論

苜蓿葉片中含有較多的蛋白質(zhì)，蛋白含量高將影響后續(xù)的PCR反應(yīng)，因此在基因組DNA的提取中應(yīng)盡量降低蛋白的含量。改良的CTAB法通過2次氯仿-異戊醇抽提降低了基因組DNA中的蛋白含量，提高了基因組DNA的質(zhì)量。

RAPD對DNA模板的含量要求不嚴(yán)格，在一定范圍內(nèi)均可得到擴(kuò)增條帶，但當(dāng)模板DNA的濃度小于5 ng時(shí)，RAPD譜帶明顯減少，因此模板DNA含量過低會使引物無法識別序列，從而導(dǎo)致引物與模板序列無法匹配，進(jìn)而影響PCR的結(jié)果。但如果DNA模板含量過高，也可能會干擾引物與模板的結(jié)合，從而在總體上降低擴(kuò)增效率。試驗(yàn)結(jié)果表明，在苜蓿RAPD法PCR擴(kuò)增中，模板DNA含量為10～20 ng時(shí)所得到的條帶數(shù)目差異不大，但小于5 ng時(shí)將無法進(jìn)行RAPD分析。

Taq DNA聚合酶濃度對RAPD擴(kuò)增也有較大影響。試驗(yàn)中使用1.0 U/μL的Taq DNA聚合酶，其擴(kuò)增條帶要比0.1和0.5 U/μL的清晰，且條帶明顯增多，這說明Taq DNA聚合酶需達(dá)1.0 U/μL時(shí)才適合于DNA擴(kuò)增。該研究中，使用250 μmol/L或350 μmol/L的dNTP擴(kuò)增的條帶較模糊，且條帶較少，而使用300 μmol/L的dNTP擴(kuò)增的條帶較多，且較清晰。已有研究表明，dNTP與Mg2+濃度在PCR 擴(kuò)增過程中緊密相關(guān)[14-15]。試驗(yàn)結(jié)果表明：在單一Mg2+濃度下，提高dNTP的濃度有增強(qiáng)條帶亮度的作用，但當(dāng)dNTP的濃度從300 μmol/L提升到350 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增的條帶變得不明顯，并且條帶變少，這可能是因?yàn)椋涸赑CR過程中需要游離的Mg2+增強(qiáng)DNA聚合酶的活性，而游離的Mg2+在反應(yīng)中可以和dNTP中的磷酸集團(tuán)進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)dNTP濃度過大時(shí)與磷酸集團(tuán)結(jié)合的Mg2+增多，用于增強(qiáng)DNA聚合酶的Mg2+減少，所以PCR反應(yīng)受到影響，甚至擴(kuò)增受到抑制。因此，在苜蓿RAPD分析中，dNTP濃度以300 μmol/L最為適宜。

在前述PCR最優(yōu)反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，使用100 條10個(gè)堿基的隨機(jī)引物對阿爾岡金、得福、三得利、新疆大葉、三得利、隴東苜蓿6個(gè)紫花苜蓿品種進(jìn)行RAPD鑒定，結(jié)果表明：引物S37和S140在6個(gè)不同紫花苜蓿品種的RAPD分析中，均可產(chǎn)生較為明顯的帶型，條帶數(shù)目多且清晰，穩(wěn)定性高，等位基因多態(tài)性率達(dá)50%。這表明RAPD法可應(yīng)用于不同苜蓿品種的鑒定。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Optimization ?of ?RAPD? Parameters? for ?Identifying? Various? Alfalfa? Varieties

ZHAO Fei-yi，JIAO Cheng-jin，LI Zhi-ming，KANG Tao-tao，AN Jian-ping（School of Bioengineering and Biotechnology, Tianshui Normal University, Tianshui 741001, PRC）

Abstract：In this study, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) optimal parameters for identifying various alfalfa varieties including the extract of genomic DNA, concentration of Taq DNA polymerase, DNA template and dNTP for PCR amplification were screened. The results showed that the improved CTAB approach, 1 U/μL Taq DNA polymerase, 10 ng/μL DNA template and 300 μmol/L dNTP were pinpointed as a combination of optimal parameters for the RAPD identification of various alfalfa varieties. Subsequently, One hundred 10-mer random primers were used for this screening to distinguish various alfalfa varieties based on the optimal parameters, and the two primers, S37 and S140, were obtained to achieve the goal. The study suggested that this method would provide a new alternative strategy for identifying and breeding alfalfa varieties.

Key?words：alfalfa; DNA extraction; random amplified polymorphic DNA(RAPD); parameter optimization

通訊作者：安建平

作者簡介：趙菲佚（1972-），男，甘肅天水市人，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31260568，31160060）；天水市科技局2010年科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目

收稿日期：2015-10-16

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.01.001

中圖分類號：Q94-336

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-060X（2016）01-0001-05