平行啟動的微生物燃料電池陽極微生物群落差異性解析

高崇洋，吳唯民，王愛杰，任南琪，趙陽國，趙艷輝，王　敏

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，150090 哈爾濱; 2.斯坦福大學(xué) 市政環(huán)境工程系，Stanford，CA 94305-4020，USA; 3.中國海洋大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，266100 山東 青島)

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平行啟動的微生物燃料電池陽極微生物群落差異性解析

高崇洋1，吳唯民2，王愛杰1，任南琪1，趙陽國3，趙艷輝3，王敏3

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，150090 哈爾濱; 2.斯坦福大學(xué) 市政環(huán)境工程系，Stanford，CA 94305-4020，USA; 3.中國海洋大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，266100 山東 青島)

摘要:為揭示平行操作的微生物燃料電池(MFC)產(chǎn)電效能出現(xiàn)差異的原因，應(yīng)用高通量測序技術(shù)對3個平行啟動和運行的MFC陽極微生物群落的組成、豐度及多樣性進(jìn)行分析，探討其差異性與反應(yīng)器效能的關(guān)系.結(jié)果表明：表面上控制條件完全一致的平行MFC，其運行狀態(tài)存在較大差異，反應(yīng)器Mfc-1和Mfc-3可獲得220~240 mV電壓及1.85~2.33 W/m3的功率密度；Mfc-2電壓一直較低，最高僅為120 mV.同一底物富集的MFC陽極微生物群落組成和豐度差異明顯，Mfc-1和Mfc-3中富集了高豐度的有利于產(chǎn)電的微生物種屬Anaeromusa、Dechloromonas、Geobacter；Mfc-2則存在較獨特的與產(chǎn)電無關(guān)的高豐度種屬Acinetobacter，這種優(yōu)勢種屬的差異最終導(dǎo)致Mfc-2產(chǎn)電效能較差.表面上操作條件相同的平行MFC其陽極微生物優(yōu)勢類群可能存在顯著差異，進(jìn)而決定MFC產(chǎn)電效率的不同.應(yīng)用MFC探討其產(chǎn)電效能與影響因子關(guān)系時，需運行至少3個平行MFC反應(yīng)器，以減少潛在的操作失誤或缺陷，提高數(shù)據(jù)可靠性.

關(guān)鍵詞:微生物燃料電池;平行操作;高通量測序;產(chǎn)電微生物

微生物燃料電池(microbial fuel cell，MFC)是一種通過微生物的催化作用，將儲存在有機(jī)物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成電能的工藝模式[1].近年來，MFC作為一種新的廢水處理和能源回收工藝形式，受到廣泛關(guān)注.深入探討和分析影響MFC產(chǎn)電效能的各種環(huán)境因素，是進(jìn)一步提升MFC普適性與工藝放大的重要步驟.探討某些影響因素作用下的MFC產(chǎn)電效能時，以往采用單個的MFC研究污染物的降解和MFC產(chǎn)電，很少有報道設(shè)置多個平行的MFC反應(yīng)器進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)的系統(tǒng)研究[2-4].由于MFC啟動和運行存在較大的不確定性或潛在的操作失誤，應(yīng)用單個MFC反應(yīng)器啟動獲得的數(shù)據(jù)其重復(fù)性和可靠性受到質(zhì)疑[5].

MFC中有機(jī)物降解和產(chǎn)電過程是由微生物主導(dǎo)實現(xiàn)，MFC陽極生物膜中富集的產(chǎn)電微生物群落具有極高的多樣性，廣泛分布于變形細(xì)菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)以及酸桿菌門(Acidobacteria)[6-7].絕大多數(shù)產(chǎn)電微生物對系統(tǒng)的操作條件極為敏感，外部環(huán)境條件的微小改變往往引起微生物群落結(jié)構(gòu)、組成和豐度的極大變化[8].這種變化會進(jìn)一步影響MFC運行效率.微生物群落圖譜是研究MFC過程中需要考慮的重要指征[1]，探討不同環(huán)境因素對MFC微生物群落圖譜影響時，單個反應(yīng)器中給出的微生物群落特征可能缺乏普遍性，根據(jù)單個MFC微生物群落的響應(yīng)過程可能做出錯誤的判斷.為此，有必要研究平行操作的MFC之間微生物群落的差異性，探討可能對MFC產(chǎn)生的影響.本研究采用3個平行啟動和運行的MFC反應(yīng)器，應(yīng)用高通量測序技術(shù)對接種污泥和陽極生物膜中微生物樣品進(jìn)行測序分析，對微生物群落的組成、豐度及多樣性進(jìn)行研究，并探討其差異性與反應(yīng)器效能的對應(yīng)關(guān)系，為MFC的選擇和操作提供微生物學(xué)依據(jù).

1實驗

1.1實驗裝置

采用3個結(jié)構(gòu)完全一致的單室空氣陰極MFC，MFC主體為有機(jī)玻璃，內(nèi)部為圓柱體形結(jié)構(gòu)，直徑3 cm，高4 cm，有效容積28 mL.圓柱體一側(cè)為碳刷陽極，碳刷以鈦絲纏繞碳纖維絲制成，直徑2.5 cm，長3 cm；圓柱體另一側(cè)為經(jīng)過防水預(yù)處理的碳布空氣陰極，預(yù)處理過程按照Cheng等[9]的方法進(jìn)行.有機(jī)玻璃接縫、陽極碳刷、導(dǎo)線等穿孔處均用環(huán)氧樹脂密封，以防止溶液滲漏，并保持極室的缺氧狀態(tài).陽極、陰極通過鈦絲導(dǎo)出，外接1 000 Ω電阻，電阻兩端接電壓在線監(jiān)測裝置.

1.2MFC的啟動與運行

3個MFC反應(yīng)器分別記為Mfc-1、2、3，采用批式培養(yǎng)方式平行啟動與運行.接種污泥取自青島市李村河污水處理廠的好氧曝氣池.人工配制的模擬廢水中，乳酸鈉500 mg/L(以COD計)，并添加營養(yǎng)鹽及微量元素，包括(L)：0.31 g NH4Cl，0.13 g KCl，2 mL微量元素，100 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH7.4)，0.2 mL維生素溶液，0.2 mL氨基酸溶液[10].

取10 mL污泥置于MFC反應(yīng)器中，加滿乳酸模擬廢水，開始在線記錄產(chǎn)電數(shù)據(jù).每48 h換水一次，直至反應(yīng)器電壓輸出升高并穩(wěn)定.MFC反應(yīng)器啟動成功后，在運行過程中當(dāng)輸出電壓低于10 mV時即更換陽極溶液，兩次更換模擬廢水之間的運行過程，計為一個周期.實驗過程中，對陽極溶液及MFC極室未采取除氧處理，實驗裝置于25 ℃條件下運行.

1.3化學(xué)及電化學(xué)監(jiān)測分析

COD應(yīng)用重鉻酸鉀法[11]進(jìn)行測定.輸出電壓(U)用數(shù)據(jù)采集卡(PISO-813型，泓格公司，臺灣)在線紀(jì)錄；電路中的電流、功率密度、極化曲線、庫倫效率等MFC的表征電化學(xué)參數(shù)均按文獻(xiàn)[10]計算.

1.4微生物群落高通量測序分析

分別對接種污泥和穩(wěn)定運行的MFC陽極生物膜進(jìn)行采樣，用土壤DNA提取試劑盒(Mobio公司，美國)提取總DNA.參考文獻(xiàn)[12]方法，以微生物總DNA為模板，對細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)進(jìn)行高通量測序，委托北京諾禾公司采用基于Illumina公司Miseq平臺進(jìn)行.測得的序列通過篩選后，以相似性97%為標(biāo)準(zhǔn)獲得操作分類單元(OTU)，OTU數(shù)據(jù)用RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/)中的Classifer程序進(jìn)行分類；按文獻(xiàn)[12]方法，對微生物群落的多樣性(包括Shannon指數(shù)、稀釋曲線)、種類組成和相對豐度、群落在屬水平的主成分進(jìn)行分析.將獲得的16S rDNA 高通量測序序列提交至MG-RAST公共數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為4565698.3(種泥)；4614367.3(Mfc-1)；4614364.3(Mfc-2)；4614370.3(Mfc-3).

2結(jié)果與討論

2.1MFC的啟動與運行

以乳酸為底物啟動的3個MFC，電壓隨時間變化如圖1所示.雖然3個反應(yīng)器的構(gòu)造、啟動條件均完全一致，啟動成功的時間、達(dá)到的最高電壓和最大功率密度卻不同.

Mfc-1和Mfc-3反應(yīng)器啟動成功所需要時間大約為300 h，最高電壓分別為240和220 mV；Mfc-2電壓一直較低，最高僅為120 mV.在第400小時左右，3個MFC的最高功率密度分別為2.33、1.19和1.85 W/m3，對應(yīng)的內(nèi)阻分別為16、19和21 Ω.實驗中，為了保證反應(yīng)器的平行運行，反應(yīng)器構(gòu)型完全一致，反應(yīng)器的接種、啟動和運行控制條件也完全相同.即使這樣，MFC的啟動和運行仍然存在較大差異，尤其是本研究的Mfc-2.這種差異可能是MFC陽極、陰極結(jié)構(gòu)上的微小差異，MFC運行過程中系統(tǒng)的氣密性，以及一些實際存在但尚未注意的影響因子的不同造成的[13].此外，接種物活性污泥是混合菌群，細(xì)菌的分布存在非均相性，因而細(xì)菌的掛膜速度和效率以及膜成分均會受影響.Logan[5]指出，探索不同影響因素對MFC影響的實驗時，需至少2組以上MFC的平行運行，并摒除明顯存在運行意外的MFC實驗組，以降低不確定環(huán)境因素的干擾.有研究者通過對同一條件下8組MFC反應(yīng)器研究后甚至認(rèn)為，為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可信度需要至少4組MFC的平行運行[14]，因為即使應(yīng)用同一種接種物在同一個反應(yīng)器中，其產(chǎn)電效率亦存在很大變數(shù)[15].本研究結(jié)果即證實了這一點，Mfc-2電壓及功率密度一直處于較低水平，與其他兩個MFC差異很大，其運行數(shù)據(jù)僅可作為參考.

圖1　3個平行運行MFC啟動及運行過程中電壓變化

MFC在單一周期內(nèi)COD的去除率具有相似的趨勢(圖未給出).在最初的10 h內(nèi)，Mfc-1對COD的去除率為78.6%，Mfc-2為65.6%，Mfc-3為73.6%.運行24 h后，陽極室內(nèi)COD降至100 mg/L左右時，Mfc-2去除率提升最快，達(dá)85.6%；Mfc-1、Mfc-3僅為80.6%、75.6%.3個反應(yīng)器的庫侖效率均為9%左右，遠(yuǎn)低于同樣以乳酸為底物的雙室MFC反應(yīng)器，也低于以乙酸為底物的MFC[10].由于乳酸并非發(fā)酵的末端產(chǎn)物，這一較低的庫侖效率說明在MFC產(chǎn)電過程中，可能存在大量的發(fā)酵微生物、氧化物質(zhì)如氧氣，進(jìn)而消耗了大量有機(jī)物氧化過程中產(chǎn)生的電子[16-17].因此，在MFC反應(yīng)器運行過程中，需要保證較好的氣密性，并協(xié)調(diào)產(chǎn)電微生物與其他輔助微生物的代謝關(guān)系.

可見，對于控制條件完全一致的平行MFC反應(yīng)器，其啟動時間、最大電壓和功率密度卻存在較大不同.在探討某些影響因子對MFC的作用時，為保證數(shù)據(jù)的可信度，需要至少平行運行2個以上MFC反應(yīng)器.

2.2MFC陽極微生物群落多樣性及組成

微生物群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，接種物活性污泥中微生物群落的多樣性最高，Shanno多樣性指數(shù)為8.7左右，包含的微生物種類達(dá)2 000種以上.種泥在MFC內(nèi)經(jīng)過底物選擇、馴化后，微生物種群數(shù)量和多樣性明顯下降，一些無法參與乳酸代謝的微生物逐漸被淘汰.Mfc-2多樣性指數(shù)為7.1，含有約800種微生物；Mfc-1和Mfc-3多樣性更低.經(jīng)過馴化后Mfc-2的多樣性仍然較高，表明可能含有大量的乳酸發(fā)酵甚至乳酸降解非產(chǎn)電微生物存在，進(jìn)而導(dǎo)致其產(chǎn)電效率的下降.一般而言，運行效率較高的MFC其微生物群落多樣性往往較低[15,18].

污泥中微生物群落的組成和豐度與乳酸底物富集后的群落存在顯著差異，結(jié)果見圖2.在接種活性污泥中，豐度高于5%的優(yōu)勢類群依次為擬桿菌門(Bacteroidetes)(19.90%)、β變形細(xì)菌綱(Betaproteobacteria)(15.70%)、硝化螺菌門(Nitrospirae)(14.60%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(7.50%)、δ變形細(xì)菌綱(Deltaproteobacteria) (5.80%)以及γ變形細(xì)菌綱(Gammaproteobacteria)(5.70%).然而，用乳酸富集后的優(yōu)勢類群明顯不同.Mfc-1中β變形細(xì)菌綱豐度高達(dá)32.0%；樣品Mfc-3中厚壁菌門(Firmicutes)的豐度更是高達(dá)43.6%；只有樣品Mfc-2中優(yōu)勢菌群仍與種泥一致，均為擬桿菌門，其豐度為26.9%.

大量研究表明，產(chǎn)電微生物廣泛分布在β變形細(xì)菌綱，厚壁菌門中，而在擬桿菌門較少發(fā)現(xiàn)[6-7]，擬桿菌門微生物主要是人體腸道內(nèi)的發(fā)酵細(xì)菌[19].這表明在Mfc-2中，乳酸底物并未完成對微生物群落的選擇過程，最優(yōu)勢菌群仍然同種泥一致，這可能是導(dǎo)致該反應(yīng)器一直處于較低產(chǎn)電水平的原因之一.

在接種污泥中，微生物群落的分布比較分散，在門或綱水平包含更多的類群.而經(jīng)過乳酸底物馴化、篩選后，某些微生物類群的豐度進(jìn)一步提高，進(jìn)而更好地代謝利用乳酸底物，適應(yīng)MFC反應(yīng)器的環(huán)境.

圖2　應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析微生物群落的組成及豐度

2.3MFC陽極微生物群落差異

在微生物種屬水平探討微生物群落的組成、豐度及差異，有助于理解某些特殊類群在MFC中的作用和功能.因此，在微生物屬級水平，對MFC陽極生物膜微生物的差異進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3.樣品Mfc-1、Mfc-2和Mfc-3均背離初始種泥群落組成，并沿著坐標(biāo)軸PC1的方向向左發(fā)展，表現(xiàn)出很大的分離距離；而3個平行運行的MFC微生物群落間，其差異主要沿著PC2的方向，在PC1的方向差異較小.這表明由乳酸富集的陽極生物膜微生物群落間的差異，同它們與種泥之間的差異不同.Mfc-1、2、3在PC1的方向具有很大相似性，表明這些生物膜內(nèi)包含大量一致的類群；而沿著PC2的方向具有很大分離，表明確實包含許多比較獨特的菌屬.

圖3　各樣品高通量測序數(shù)據(jù)的主成分分析

在微生物屬級水平上，比較各樣品中微生物群落的組成和豐度，結(jié)果見表1.在接種污泥中，能夠鑒定到屬的微生物較少，最優(yōu)勢的微生物屬是Nitrospira，其豐度達(dá)13.90%.同樣以乳酸為底物富集的MFC陽極微生物群落，其組成和豐度存在明顯差異，其中Mfc-1和Mfc-3微生物種屬更為相似.在樣品Mfc-1中，豐度為5%以上的優(yōu)勢菌屬依次為Anaeromusa(13.89%)、Geobacter(9.51%)、Dechloromonas(6.06%)、Zoogloea(5.05%)；在Mfc-3中，優(yōu)勢菌屬依次為Anaeromusa(42.59%)、Pseudomonas(10.92%)；與之相比，Acinetobacter(8.37%)是樣品Mfc-2中的優(yōu)勢屬，該樣品中種屬分布更加分散多樣.

在好氧活性污泥中，Nitrospira的豐度達(dá)13.90%.在微生物氮循環(huán)中，硝化作用是關(guān)鍵的中心過程，在此過程中，NH4+依次被氧化成NO2-及NO3-，氨的氧化和亞硝酸鹽的氧化是由系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上兩類不同的微生物催化完成的，即氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌.Nitrospira即為典型的氨氧化微生物[20]，在好氧活性污泥中，高豐度的Nitrospira屬微生物為李村河污水處理廠曝氣池中良好的氨氧化過程提供了微生物佐證.

表1　以乳酸為底物啟動MFC陽極微生物群落在屬級水平的差異

由表1可知，Mfc-1和Mfc-3中具有相同的高豐度微生物種屬，如Anaeromusa、Dechloromonas、Geobacter；Mfc-2則擁有較特殊的高豐度種屬，如Acinetobacter、擬桿菌門中的種屬.從微生物學(xué)角度而言，MFC反應(yīng)器間這些種屬的差異是決定MFC產(chǎn)電效率的關(guān)鍵因素.

在MFC陽極微生物群落中Anaeromusa屬的微生物被乳酸富集，在Mfc-1和Mfc-3中，其豐度分別達(dá)13.98%和42.59%.該屬微生物的高度富集表明其在乳酸的降解和MFC產(chǎn)電過程中發(fā)揮重要作用.該菌屬最初認(rèn)為是能夠利用氨基酸的類群，后來Borole等[18]首次富集得到了具有很高產(chǎn)電能力的陽極微生物群落，其中Anaeromusa屬微生物的豐度高達(dá)41%，從而證實該類微生物能夠參與MFC的產(chǎn)電過程，本研究得到相似的結(jié)果.

Dechloromonas屬中的有些菌種是重要的反硝化聚磷菌，能夠在厭氧條件下完全降解芳香烴化合物產(chǎn)生二氧化碳，或者當(dāng)硝酸鹽存在時，利用硝酸鹽為電子受體，實現(xiàn)反硝化過程[21].這類微生物在一些MFC陽極微生物群落中經(jīng)常被檢測到，而且一般豐度都很高[22].在Mfc-1和Mfc-3中，其豐度達(dá)6.06%和3.30%.

δ變形細(xì)菌綱中Geobacter屬的微生物是典型的產(chǎn)電微生物[23]，在氧化有機(jī)化合物的同時，能夠利用產(chǎn)生的電子還原Fe(III).這類微生物在厭氧微生物食物鏈中占有重要位置.在樣品Mfc-1和Mfc-3中，Geobacter的豐度從種泥中的0.90%分別上升至9.51%和1.62%，而Mfc-2中僅為0.67%.由于MFC的功率密度與Geobacter屬微生物的數(shù)量和豐度成正比[24]，這類微生物的高豐度意味著MFC反應(yīng)器有高的功率密度.3個MFC的產(chǎn)電性能與其產(chǎn)電微生物豐度一致，其中Geobacter豐度最高的Mfc-1產(chǎn)電性能最好.

Mfc-2中高豐度的Acinetobacter種屬，是一類嚴(yán)格好氧、不能進(jìn)行發(fā)酵的革蘭氏陰性球狀或桿狀菌，能夠引起人類感染的病源微生物，能夠以乙酸、乳酸、丙酮酸為唯一碳源生長[25].是一類與產(chǎn)電微生物營養(yǎng)生態(tài)位相似但與產(chǎn)電不相關(guān)的類群.其大量富集除了有適合的碳源外，存在高濃度的溶解氧也是重要因素.這說明該MFC的密閉性較差，有空氣進(jìn)入導(dǎo)致該類群的大量繁殖.可見，在MFC的結(jié)構(gòu)設(shè)計或運行方式上存在表面上觀察不到的缺陷.

由此可見，用相似底物富集的MFC陽極微生物群落，由于反應(yīng)器設(shè)計或操作原因可能出現(xiàn)顯著差異.產(chǎn)電較差的Mfc-2與產(chǎn)電較好的Mfc-1/Mfc-3，其差異主要源于反應(yīng)器的密閉性不同而導(dǎo)致的功能微生物類群的差異.Mfc-1/Mfc-3中富集了高豐度的有利于產(chǎn)電的微生物類群，而Mfc-2中富集了與產(chǎn)電相關(guān)性不大的微生物種屬.

3結(jié)論

1)表面上控制條件完全一致的平行MFC反應(yīng)器，由于潛在的操作差異，其啟動時間、最大電壓和功率密度可能存在較大不同.應(yīng)用MFC探討其產(chǎn)電效能與影響因子關(guān)系時，需要運行2個以上平行MFC反應(yīng)器，以提高數(shù)據(jù)可靠性.

2)在接種污泥中，微生物群落的分布比較分散，在門或綱水平包含更多的類群.底物馴化、篩選后，微生物在某些類群中豐度進(jìn)一步提高，從而更好地代謝利用底物.

3)相似底物富集的MFC陽極微生物群落差異顯著，產(chǎn)電性能較好的Mfc-1/Mfc-3中富集了高豐度的有利于產(chǎn)電的微生物，而產(chǎn)電較差的Mfc-2中富集了高豐度的非產(chǎn)電微生物.

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(編輯劉彤)

Comparison of anodic microbial communities in parallel-operated microbial fuel cells

GAO Chongyang1, WU Weimin2, WANG Aijie1, REN Nanqi1, ZHAO Yangguo3, ZHAO Yanghui3, WANG Min3

(1.School of Environmental and Municipal Engineering, Harbin Institute of Technology,150090 Harbin,China;2.Department of Civil and Environmental Engineering, Stanford University, Stanford, CA 94305-4020, USA;3.College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, 266100 Qingdao, Shandong,China)

Abstract:The composition, abundance and diversity of anodic microbial communities in three parallel-operated MFCs,which inoculated with activated sludge, were investigated by 16S rDNA based high-throughput sequencing. The relationship between the microbial populations and MFC efficiency was evaluated. The efficiency of MFCs was markedly different even if these MFCs were started up and operated under the same conditions. Two of them (named after Mfc-1 and Mfc-3)arrived at the maximum voltage of 220 to 240 mV with power density of 1.85 to 2.33 W/m3. However, the maximum voltage of MFC Mfc-2 was relative low and kept at about 120 mV. Microbial community composition and abundance were significantly different even if they were enriched by the same substrate. Highly abundant bacteria, such as Anaeromusa，Dechloromonas, Geobacter, that are capable of producing electricity were enriched in Mfc-1 and Mfc-3. However, the genus Acinetobacter, a non-electrogen, existed at high abundance in the Mfc-2. This study concluded that divergence of dominant anodic microbial groups in MFCs,due to possible mismanagement and reactor design drawbacks,resulted in the difference of electricity-producing efficiency. To improve the reliability of experimental results during investigating the MFC function and its influencing factors, at least three parallel-operated MFCs were preferred.

Keywords:microbial fuel cells; parallel-operation; high-throughput sequencing; electricity-producing bacteria

中圖分類號:X703;Q938

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:0367-6234(2016)02-0015-06

通信作者:王愛杰，waj0578@hit.edu.cn.

作者簡介:高崇洋(1979—)，女，博士研究生；王愛杰(1974—)，女，教授，博士生導(dǎo)師;任南琪(1959—)，男，博士生導(dǎo)師，中國工程院院士.

基金項目:國家自然科學(xué)基金(40801193).

收稿日期:2015-03-18.

doi:10.11918/j.issn.0367-6234.2016.02.003