苦膚洗劑配合紅光治療小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎的機(jī)理研究＊

方 麗

（山東省泰安市婦幼保健院 泰安 271000）

苦膚洗劑配合紅光治療小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎的機(jī)理研究＊

方 麗＊＊

（山東省泰安市婦幼保健院 泰安 271000）

目的：觀察中藥苦膚洗劑聯(lián)合紅光治療小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎（ACD）模型的效果。方法：50只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、苦膚洗劑組、苦膚洗劑聯(lián)合紅光組、糠酸莫米松軟膏聯(lián)合紅光組，每組10只，連續(xù)治療5天。觀察小鼠耳變態(tài)反應(yīng)評分，采用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA 分別測定小鼠外周血IFN-γ / IL-4、IFN-γ、IL-4、IL-5數(shù)值。病理標(biāo)本觀察過敏反應(yīng)過程中皮膚組織的病理變化，進(jìn)行真皮炎性細(xì)胞計數(shù)。結(jié)果：各治療組均出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)評分下降，小鼠搔抓現(xiàn)象緩解，組織病理顯示炎癥反應(yīng)緩解，均能夠使IFN-γ / IL-4數(shù)值顯著提高，并且苦膚洗劑聯(lián)合紅光組促進(jìn)IFN-γ / IL-4數(shù)值顯著提高，效果優(yōu)于苦膚組。外周血相對應(yīng)的細(xì)胞因子IL-4、IL-5含量降低而IFN-γ含量相應(yīng)升高。結(jié)論：苦膚洗劑聯(lián)合紅光組和西藥膏聯(lián)合紅光組均能改善小鼠ACD模型耳部炎癥反應(yīng)。但在減輕ACD小鼠模型瘙癢程度上苦膚洗劑聯(lián)合紅光組更為明顯。

苦膚洗劑 變應(yīng)性接觸性皮炎 基礎(chǔ)研究

目前在濕疹治療上，無論中醫(yī)、西醫(yī)均以對癥治療為主，最常用的是藥物外治。西藥激素類藥膏雖廣為應(yīng)用，但在止癢、減少滲出及對皮損的保護(hù)方面遠(yuǎn)不及中藥。對于復(fù)雜的濕疹則可以中西醫(yī)結(jié)合，在應(yīng)用中藥的同時，輔以微波、紅光等治療手段。通過照射促進(jìn)中藥的滲透吸收，又能通過紅光消炎止痛，提高組織再生修復(fù)的速度[1]，提高機(jī)體免疫功能[2]達(dá)到消炎止痛及修復(fù)組織的作用。本研究利用2，4-二硝基氯苯（DNCB）誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic Contactdermatitis，ACD）作為模型，觀察中藥苦膚洗劑配合紅光照射對其皮膚損害及對IFN-γ / IL-4的影響，探討該法治療濕疹的機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級昆明小鼠50只，雌雄各半，7周齡，體質(zhì)量22-27 g，泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號：魯動質(zhì)字140908。飼養(yǎng)于泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，室內(nèi)溫度20-25℃，濕度40%-60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后進(jìn)行造模。

1.1.2 主要儀器、試劑及藥物

80-2106-20型紫外分光光度儀（英國Pharmacia公司），Ascent酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo Labsystems公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司），半導(dǎo)體激光發(fā)光管：電功率58.3 mW，波長650 nm，光斑直徑3 mm；照射時間均為5 min，能量密度為61.89 J/cm-2。鼠抗 IL-4-PE、鼠抗CD4-FITC、鼠抗IFN-γ-FITC（美國eBioscience公司）。小鼠IL-4 ELISA試劑盒（美國eBioscience，批號：88-7944），IL-5 ELISA試劑盒（美國eBioscience公司，批號：88-7054），小鼠IFN-γ ELISA試劑盒（批號：EK0375）。2，4-二硝基氯苯（2，4-Dinitrochlorobenzene ，DNCB）（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20120306），丙酮（中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，批號：20140225）。

所用苦膚洗劑主要成分為苦參30 g、地膚子30 g、野菊花10 g、蒲公英10 g、甘草10 g、蟬蛻6 g、花椒30 g、蛇床子30 g、黃柏15 g、荊芥15 g、防風(fēng)10 g。應(yīng)用韓國東華煎藥機(jī)制成水煎劑400 mL，生藥為0.415 g·mL-1放4℃冰箱冷藏備用。以上藥物為泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科制備，批號：20140921。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠ACD模型

參照《藥理實驗方法學(xué)》[3]建立小鼠ACD模型。流程如下：取健康小鼠腹部脫毛，面積約3 cm×3 cm，脫毛后待皮膚干燥后涂1%DNCB丙酮橄欖油溶液100 μL致敏，24 h后重復(fù)涂相同劑量強(qiáng)化致敏，再經(jīng)過72 h后于小鼠雙耳內(nèi)外側(cè)耳面均勻涂以上述溶液20 μL進(jìn)行激發(fā)。于激發(fā)后1 h，小鼠耳部開始發(fā)紅腫脹，同時出現(xiàn)搔抓現(xiàn)象，12 h后耳厚度明顯增加，紅腫明顯，變態(tài)反應(yīng)評分較前明顯增加，組織病理學(xué)檢查顯示表皮增厚，細(xì)胞水腫明顯，大量單核細(xì)胞浸潤，真皮血管有明顯充血，說明小鼠ACD模型造模成功。

根據(jù)耳變態(tài)反應(yīng)評分和病理切片判斷是否造模成功。正常對照組為同批次小鼠，耳部及腹部僅涂丙酮橄欖油溶液（4：1）作為陰性對照，小鼠耳部皮膚無紅腫，偶有搔抓，組織病理學(xué)檢測表皮層、真皮層無明顯異常變化，細(xì)胞間偶有單個細(xì)胞水腫。

1.2.2 治療方法

激發(fā)成功后12 h開始用藥。正常對照組耳廓涂等體積的生理鹽水，模型對照組為造模后小鼠耳廓涂等體積生理鹽水；苦膚洗劑組為ACD模型小鼠耳廓及腹部涂擦中藥洗劑，每日2次，每次100 μL，以玻璃棒反復(fù)涂擦內(nèi)外側(cè)耳面5 s左右，連續(xù)5日；苦膚洗劑聯(lián)合紅光組ACD模型小鼠耳廓及腹部涂擦苦膚洗劑，每日2次，每次100 μL，以玻璃棒反復(fù)涂擦內(nèi)外側(cè)耳面5 s左右，涂擦中藥10 min后小鼠裝入固定器，給予61.89 J·cm-2的紅光照射，固定波長650 nm，連續(xù)5日?？匪崮姿绍浉嗦?lián)合紅光組取適量藥膏外涂ACD模型小鼠耳廓及腹部，每日2次，涂擦西藥10 min后，紅光照射方法同上，每日2次，連續(xù)5日。

1.2.3 耳變態(tài)反應(yīng)評價指標(biāo)

該指標(biāo)包括小鼠耳變態(tài)反應(yīng)評分和搔抓次數(shù)。從抓痕、水腫、紅斑3個方面對小鼠雙耳變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行評分，取雙耳平均值，評分標(biāo)準(zhǔn)參見藥理實驗方法學(xué)[1]。從用藥后即開始觀察每只小鼠在1 min內(nèi)搔抓雙耳的次數(shù)。

1.2.4 采集血清及病理標(biāo)本

連續(xù)用藥5天后停藥，12 h后摘眼球取血，處死小鼠，取耳部皮損甲醛固定。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測定

取1 mL眼眶血液，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞試劑盒要求進(jìn)行IFN-γ和IL-4檢測。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定

按照各酶聯(lián)免疫試劑盒要求進(jìn)行小鼠血清IFN-γ、IL-4及IL-5檢測。

1.2.7 組織病理學(xué)檢測

將切取的耳部皮損做成石蠟切片、HE染色，由病理科兩名主任醫(yī)師分別單獨在40×10高倍鏡視野下進(jìn)行真皮淋巴細(xì)胞計數(shù)，取5個高倍鏡視野真皮淋巴細(xì)胞數(shù)值的平均值。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料兩樣本間比較采用t檢驗和q檢驗，多個樣本間比較采用方差分析。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-±s）表示。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠用藥前后耳變態(tài)反應(yīng)評價

2.1.1 耳變態(tài)反應(yīng)評分

模型對照組得分最高，與苦膚組、苦膚+紅外組、西藥膏+紅外組比較有明顯差異（P＜0.01）；苦膚+紅光組與西藥膏+紅光組比較兩者無明顯差異（P＞ 0.05）。詳見表1。

在可持續(xù)發(fā)展的背景之下，綠色建筑行業(yè)前程似錦。為了實現(xiàn)節(jié)能減排、環(huán)境友好以及安逸舒適的宗旨，有必要進(jìn)一步對光伏發(fā)電系統(tǒng)的組成、設(shè)計以及管理展開研究。

2.1.2 搔抓次數(shù)上的比較

模型對照組次數(shù)最多，與苦膚組、苦膚+紅外組、西藥膏+紅外組、苦膚+西藥膏+紅外組比較有明顯差異（P＜0.01），各治療組在一定程度上均降低了瘙癢。效果最好的是苦膚+紅外組，與西藥膏+紅外組比較有明顯差異（P＜0.05）。 詳見表1。

2.2 ELISA法檢測各組小鼠IFN-γ、IL-4、IL-5因子

ACD小鼠耳部分別給不同處理后，外周血IFN-γ、IL-4、IL-5水平變化有明顯差異，ACD小鼠應(yīng)用苦膚洗劑后與模型對照組比較，IL-4、IL-5水平降低而IFN-γ水平升高（P＜0.05）。西藥膏組+紅外組與苦+紅外組兩兩比較未見明顯差異，詳見表2。

表1 小鼠耳變態(tài)反應(yīng) 評價（±s，n=10）

表1 小鼠耳變態(tài)反應(yīng) 評價（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥膏+紅光組比較，△P＜0.05。

組別耳變態(tài)反應(yīng)評分搔抓次數(shù)/次·min-1正常對照組0.25±0.15 0.80±1.16模型對照組5.40±0.45 22.90±2.23苦 膚組2.40±0.32＃11.45±2.01＃苦 膚+紅 光組1.70±0. 16＃#△ 4.37±3.45##△西 藥膏+紅光組1.60±0.14＃＃ 3.96±2.85##

2.3 小鼠ACD建模用藥后外周血炎癥因子水平檢測流式細(xì)胞儀檢測

相比模型對照組ACD小鼠耳部分別給不同處理后，苦膚組與模型對照組比較IL-4降低而IFN-γ升高，IFN-γ/IL-4有顯著差別，苦膚+紅外組，西藥膏+紅光組與模型對照組也有顯著性差別。西藥膏+紅光組與苦膚+紅光組兩兩比較沒有顯著差異，詳見表3、圖1。

2.4 小鼠ACD模型耳部皮膚組織炎癥變化

表皮層增厚，細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間輕中度水腫。真皮乳頭水腫，可見大量淋巴細(xì)胞，伴有肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的單核細(xì)胞，血管擴(kuò)張明顯，周圍可見滲出的紅細(xì)胞。

ACD小鼠經(jīng)苦膚洗劑治療后，耳部皮膚表皮層變薄，細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間水腫減輕，淋巴細(xì)胞浸潤減少，與模型對照組比有顯著差異（P＜0.05）。在淋巴細(xì)胞浸潤減少程度上，苦膚+紅光組與西藥膏+紅光組比較無明顯差異，說明膚洗劑與西藥膏在減少淋巴細(xì)胞上無差別。詳見圖2、表4。

表2 ACD建模及用藥后外周血炎癥因子水平檢測/pg·mL-1（±s）

表2 ACD建模及用藥后外周血炎癥因子水平檢測/pg·mL-1（±s）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組IL-5 IL-4 IFN-γ正常對照組12.37±0.19 9.12±0.23 207.26±0.42模型對照組42.79±0.61 63.26±0.12 126.34±0.17苦膚組32.12±0.74#31.23±0.37#147.27±0.28#苦膚+紅光組24.17±0.52##23.57±0.15##162.18±0.24##西藥膏+紅光組22.82±0.34##21.06±0.19##148.67±0.43#

表3 ACD建模及用藥后外周血炎癥因子水平檢測流式細(xì)胞術(shù)/%（±s）

表3 ACD建模及用藥后外周血炎癥因子水平檢測流式細(xì)胞術(shù)/%（±s）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；西藥膏+紅光組與苦膚+ 紅光組比較，▲P＜0.05。

組別IFN-γ IL-4 IFN-γ/IL-4正常對照組1.81±2.29 2.43±1.59 0.63±3.70模型對照組2.14±1.35 2.03±1.19 1.13±2.90苦膚組3.23±1.29##1.32±9.3##1.87±1.60##苦膚+紅外組5.13±2.05##▲0.87±0.23##▲2.17±3.50##▲西藥膏+紅外組4.83±2.23##0.93±0.12##2.03±2.10##

圖1 各組ACD小鼠外周血IFN-γ和IL-4百分率流式圖

圖2 小鼠ACD模型耳部皮膚組織炎癥變化（HE染色，40×10）

3 討論

濕疹的臨床表現(xiàn)以皮膚紅斑、丘疹、水皰、糜爛、滲出伴劇烈瘙癢為特征，中醫(yī)認(rèn)為其基本病機(jī)是濕熱毒邪蘊于肌膚，復(fù)感風(fēng)邪，兩邪相搏而致皮膚濕疹癥狀，治療應(yīng)以清熱解毒、疏風(fēng)散邪、利濕止癢為主。所用苦膚洗劑中苦參、地膚子、蛇床子、黃柏、荊芥、防風(fēng)、野菊花、蒲公英、甘草、蟬蛻、花椒諸藥合用，共奏清熱解毒、疏風(fēng)散邪、利濕止癢之效。同時配合紅光治療能更好的增強(qiáng)其消炎、止癢、抗過敏的作用。

本研究中，小鼠經(jīng)1%DNCB腹部致敏和耳部激發(fā)后12 h即開始給予不同藥物加紅光處理后，小鼠過敏癥狀減輕，搔抓次數(shù)減少，組織病理示炎癥反應(yīng)減輕，外周血細(xì)胞因子IL-4、IL-5降低而IFN-γ相應(yīng)升高，IFN-γ/ IL-4增大，證明苦膚洗劑和西藥膏聯(lián)合紅光治療均能改善小鼠ACD模型耳部炎癥反應(yīng)。這與翁曉晨等[11]利用半導(dǎo)體激光照射急性佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的大鼠足三里穴位，可使大鼠TNF-γ與IL-1水平在治療后顯著下降相一致。但在減輕ACD小鼠模型瘙癢程度上苦膚洗劑更為明顯，可能的原因為：DNCB致敏的濕疹小鼠經(jīng)苦膚洗劑治療后，其免疫失衡狀態(tài)得到逐步糾正。同時，濕疹過程中常常表現(xiàn)出Th1 / Th2細(xì)胞亞群失調(diào)。Th2細(xì)胞反應(yīng)釋放IL-4、IL-5、IL-10等誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE；Th1細(xì)胞活化產(chǎn)生IFN-γ、TNF-β等參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。通過觀察濕疹小鼠的外周血IL-4、IL-5、IFN-γ，發(fā)現(xiàn)小鼠IL-4、 IL-5明顯高于正常組，而與IL-4為拮抗因子的IFN-γ則低于正常組，IFN-γ/ IL-4明顯增高說明濕疹中Th1 / Th2有失衡存在，這與既往研究相一致[4-10]。

表4 各組ACD小鼠耳組織淋巴細(xì)胞計數(shù)（±s，n=10）

表4 各組ACD小鼠耳組織淋巴細(xì)胞計數(shù)（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與苦膚+紅光組比較，▲P＜0.05。

組別淋巴細(xì)胞計數(shù)正常對照組 5.3±3.9模型對照組108.3±15.9苦膚組 42.3±15.9##苦膚+紅光組 37.7±9.3##▲西藥膏+紅光組 32.3±11.9##

本實驗中，苦膚洗劑聯(lián)合紅光治療，與單獨應(yīng)用苦膚洗劑相比，表現(xiàn)出更好的抗過敏作用，體現(xiàn)了兩者聯(lián)合的協(xié)同作用。在降低ACD模型小鼠變態(tài)反應(yīng)評分、減少皮損內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量上，苦膚洗劑聯(lián)合紅光療法與西藥膏聯(lián)合紅光療法，兩者療效無顯著性差異苦膚洗劑在變應(yīng)性接觸性皮炎的療效較優(yōu)，為本課題組進(jìn)一步替換激素藥膏打下基礎(chǔ)。

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Mechanisms of Kufu Lotion and Infrared Laser Therapy for Allergic Contact Dermatitis (ACD) in Mice

Fang Li
(Tai'an Maternal and Child Care Hospital, Tai'an 271000, China)

This study was aimed to observe the effects of Kufu lotion complicated with infrared ray therapy on ACD mice. Fifty mice were randomly divided into five groups: blank control group, model group, Kufu lotion group (Kufu group), Kufu lotion and infrared laser therapy group (Kufu plus infrared laser group), furoic acid betamethasone ointment and infrared laser therapy group (furoic acid plus infrared laser group). After treatments for five days, allergic reaction scores of ear skin, and levels of inflammatory factors such as serum IFN-γ, IL-4 and IL-5 in were tested. Pathological changes of allergic reaction in ear skin were observed, and inflammatory cell count was recorded. It was found that allergy reaction scores of all treatment groups decreased accompanied by the reducing of scratching behavior. Pathological observation showed that the ratio of IFN-γ / IL-4 increased significantly among all treatment groups, which indicated lower inflammatory reaction after treatment. In addition, there were lower levels of IL-4 and IL-5, a higher level of IFN-γ and an increased the ratio of IFN-γ / IL-4 in Kufu plus infrared laser group than those of Kufu group. In conclusion, it was effective in relieving ear inflammatory reaction in ACD mice through both Kufu lotion with infrared laser therapy and furoic acid with infrared laser therapy. Moreover, the former was optimum.

Kufu lotion, allergic contact dermatitis, basic research

10.11842/wst.2016.04.016

R275.9

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-08-14

修回日期：2016-02-12

＊ 泰安市科技局科學(xué)技術(shù)成果鑒定（泰科成鑒字[2014]第111號）：苦膚洗劑聯(lián)合遠(yuǎn)紅外線治療小兒濕疹的基礎(chǔ)和臨床研究。

＊＊ 通訊作者：方麗，主治醫(yī)師，主要研究方向：皮膚組織病理。