基于“病證-效應-生物樣本分析”方法的桑寄生補肝腎強筋骨功效物質及歸經研究＊

趙華偉，汪 晶，崔 瑛＊＊，王桁杰，王君明，馬 開

（1. 河南中醫(yī)學院 藥學院 鄭州 450046；2. 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協同創(chuàng)新中心鄭州 450046；3. 河南省中醫(yī)藥研究院 鄭州 450000）

基于“病證-效應-生物樣本分析”方法的桑寄生補肝腎強筋骨功效物質及歸經研究＊

趙華偉1，2，汪 晶1，2，崔 瑛1，2＊＊，王桁杰1，2，王君明1，2，馬 開3

（1. 河南中醫(yī)學院 藥學院 鄭州 450046；2. 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協同創(chuàng)新中心鄭州 450046；3. 河南省中醫(yī)藥研究院 鄭州 450000）

目的：建立與桑寄生功效相對應的骨質疏松模型，觀察桑寄生補肝腎強筋骨功效物質及其在大鼠體內分布與歸經的關系。方法：采用維甲酸制造骨質疏松模型大鼠模型，觀察桑寄生水煎液藥效。同時以萹蓄苷、槲皮苷、蘆丁為指標成分，對含藥組織進行分析檢測，觀察其體內分布及代謝時間，研究功效相關物質的組織分布與歸經的關系。結果：桑寄生水煎液能明顯提高骨質疏松模型大鼠左股骨骨重、骨重/骨長、骨重/骨直徑等指標，且能降低大鼠血清中骨鈣素（OT）、堿性磷酸酶（ALP）含量。大鼠體內桑寄生指標成分的分析結果顯示，蘆丁僅在胃中有少量分布，萹蓄苷在組織中AUC0-t大小順序為胃＞腎＞腦＞小腸＞大腸＞肝＞肺，體內維持時間長短順序為腎=胃＞腦＞大腸＞小腸=脾＞肝＞心＞肺＞血清。槲皮苷在組織中AUC0-t大小順序為腎＞胃＞肝＞心＞肺＞脾＞小腸＞大腸＞腦，體內維持時間長短順序為腎=胃=腦=肺=肝=脾=心＞大腸＞血清＞小腸。結論：桑寄生水煎液可對抗維甲酸致大鼠骨質疏松，具有補肝腎、強筋骨作用；萹蓄苷、槲皮苷為桑寄生補肝腎、強筋骨代表成分；萹蓄苷、槲皮苷在大鼠體內分布與桑寄生歸腎經的傳統認識一致。

桑寄生 大鼠骨質疏松 藥效 功效物質 歸經

桑寄生為桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis（DC.） Danser的干燥帶葉莖枝，性平，味苦、甘，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎的功效，臨床常用于痹癥日久、傷及肝腎、腰膝酸軟、筋骨無力等病癥[1]。目前，關于桑寄生的研究主要集中在化學成分、藥理作用等方面。關于桑寄生功效物質和歸經的研究尚未見報道。因此，本研究進行了桑寄生功效補肝腎、強筋骨功效物質及歸經研究。

功效物質是指表達中藥傳統功效的化學物質。對中藥功效的認識，是以一定的證候為基礎，而化學物質的認識，又需要借助現代化學分析手段，故中藥功效物質的認識既需要以證候和藥效為基礎，又需要借助化學分析手段。基于以上認識，本研究建立了“病癥—效應—生物樣本分析”結合研究中藥功效物質的系統方法[2，3]。歸經是藥物對機體臟腑經絡選擇性的作用，有研究表明藥物的作用部位與歸經關系密切，且藥物中功效成分在體內的分布是藥物歸經的重要依據[4，5]。因此，結合藥代動力學方法，觀察功效物質在病癥模型動物中的分布，從而可以獲得中藥歸經與藥物分布相關性的認識[2，6，7]。

本研究是在上述思路的指導下，觀察桑寄生對骨質疏松模型大鼠的作用，以反映桑寄生補肝腎、強筋骨功效。在此基礎上，針對給藥模型大鼠，開展生物樣本（血清、臟腑組織）的化學成分分析，從而獲得對桑寄生補肝腎、強筋骨功效物質的認識，通過桑寄生指標成分在臟腑組織的分布，探討桑寄生的歸經。

1 材料

1.1 實驗藥物

本研究中的桑寄生樣品購于河南張仲景大藥房（生產日期為2014年5月18日）。經河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定為桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis （DC.） Danser的干燥帶葉莖枝。

龍牡壯骨顆粒（武漢健民藥業(yè)集團股份有限公司，批號：1407223）；維甲酸（大連美侖生物技術有限公司）；萹蓄苷、槲皮苷（四川省維克其生物科技有限公司，批號分別為：130625、130508）；槲皮素（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200306）。

1.2 試劑

骨鈣素（OT） ELISA檢測試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）ELISA檢測試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號分別為：201501、201501）。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純。

1.3 實驗儀器

TGL-16gR高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；不銹鋼數顯卡尺（上海尺喜工量具有限公司）；酶標儀（美國BioTek Instruments公司），Waters e2695高效液相色譜儀自帶Waters2489檢測器（美國Waters公司）； AE240電子分析天平（瑞士梅特勒儀器有限公司）；氮氣吹干儀（北京八方世紀）。

1.4 實驗動物

SPF級Wistar大鼠，雄性，體質量160±10 g，購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質檢中心實驗動物室，批號：0017218，許可證號：SCXK（魯）20130001；分籠飼養(yǎng)在20±2 ℃的動物室，專人飼養(yǎng)和管理，飼以標準全價飼料。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 桑寄生水煎液的制備

取桑寄生藥材粉碎成粗粉，加10倍量（重量）水浸泡30 min，煎30 min，濾過，藥渣加8倍量（重量）水煎煮20 min，濾過，合并兩次濾液，低溫濃縮至1 g·mL-1的桑寄生水煎液。

2.1.2 龍牡壯骨顆?；鞈乙旱闹苽?/p>

取龍牡壯骨顆粒255 g，加蒸餾水超聲溶解，配制成0.5 g·mL-1的混懸液。

2.2 造模與給藥

大鼠不限食水飼養(yǎng)5天，禁食24 h后稱重，標記，隨機分為正常組、模型組、陽性組（龍牡壯骨顆粒組）、桑寄生高、中、低劑量組，每組9只（其中桑寄生高劑量組18只）。除空白組外各組大鼠上午用1%羧甲基纖維素鈉配成的維甲酸混懸液70 mg·kg-1灌胃[8，9]；下午各組大鼠給予相應的藥物或生理鹽水，其中桑寄生各劑量組分別給予桑寄生高（10 g·kg-1）、中（5 g·kg-1）、低（2.5 g·kg-1）劑量水煎液，陽性組給予龍牡壯骨顆粒混懸液（5 g·kg-1）[10-12]，每日灌胃1次，空白、模型給予生理鹽水。灌胃體積1 mL/100g，連續(xù)給藥14天后，停止給予維甲酸，每日下午各組大鼠繼續(xù)給予相應藥物或生理鹽水14天。

2.3 取材

各組大鼠于給藥28天當晚禁食不禁水。次日桑寄生高劑量組9只大鼠分別于給予桑寄生高劑量水煎液后10、30、40、60、80、90、120、240、360min時摘眼球取血，脫頸椎處死，立即取心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、大腸、小腸，用于測定各成分的組織分布，其余大鼠分別于給藥30 min后摘眼球取血，脫頸椎處死。所有全血均靜置0.5 h后置低溫高速離心機中10 000 r·min-1離心10 min，取上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血清樣品的處理

全血10 000 r·min-1離心10 min后，精密吸取1.5 mL血清置10 mL離心管中，加入3倍量甲醇（按血清：甲醇=1:3的比例），用快速混勻器充分振搖5 min，10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液置另一個10 mL離心管中，沉淀物再次精密加入3倍量甲醇，用快速混勻器充分振搖5 min，10 000 r·min-1離心10 min，合并兩次上清液。50℃氮氣吹干，精密加入甲醇2 mL，超聲提取5 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。血清用于血清中骨鈣素（Osteocalcin，OT）濃度、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）濃度的檢測，按照試劑盒說明書用ELISA（酶聯免疫法）檢測。血清也用于桑寄生的化學成分分析。

2.5 組織樣品的處理

將各組織用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，精密稱取約1 g的組織（不足1 g的稱取全部），剪碎，加入3倍量生理鹽水（按組織：生理鹽水=1 g：3 mL的比例），置10 mL離心管中，用細胞破碎儀破碎。組織破碎液精密加入3倍量甲醇（按組織1 g：甲醇3 mL的比例），快速混勻器充分振搖5 min，10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液置另一個10 mL離心管中，沉淀物再次精密加入3倍量甲醇，用快速混勻器充分振搖5 min，10 000 r·min-1離心10 min，合并兩次上清液。50℃氮氣吹干，精密加入甲醇2 mL，超聲提取5 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。用于桑寄生化學成分分析。

2.5 HPLC含量測定方法

2.5.1 色譜條件

Platisil ODS C18色譜柱（5μm，250×4.6 mm），流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸水（B）；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：28℃；進樣量10 μL；檢測波長：330 nm；洗脫梯度：79%B（2 min）→79%B（15 min）→77%B（20 min）→77%B（30 min）→79%B（35 min）。

2.5.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品萹蓄苷1.00 mg、槲皮苷1.00 mg和蘆丁1.00 mg，分別于3個10 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成萹蓄苷、槲皮苷和蘆丁濃度為0.100 mg·mL-1的單一對照品儲備液。

分別精密量取單一對照品溶液適量于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成濃度分別為含0.005、0.02、0.08、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75、1 μg·mL-1萹蓄苷的對照品溶液， 0.005、0.02、0.08、0.15、0.25、0.5、1、2、2.5 μg·mL-1槲皮苷的對照品溶液，含0.005、0.02、0.05、 0.08、0.15、0.2、0.25、0.5、0.75 μg·mL-1蘆丁的對照品溶液，4℃冷藏避光貯藏備用。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠一般情況觀察

實驗過程中各組大鼠體重均有所增加，模型組大鼠體重增加幅度不及其它組，除空白組外其余各組在給予維甲酸一周左右相繼出現豎毛、拱背，活動量減少，其中模型組最為明顯。停止給予維甲酸后，陽性組和桑寄生高、中、低劑量組大鼠的豎毛、拱背狀況得到極大改善。

3.2 對骨質疏松模型大鼠左股骨骨重、骨長、骨直徑的影響

模型組較空白組左股骨骨重、骨長、骨重/骨直徑、骨重/骨長均有顯著降低，陽性組、桑寄生水煎液高劑量組與模型組比較，骨重、骨重/骨直徑、骨重/骨長均有明顯改善；桑寄生水煎液中劑量、低劑量與模型組相比，骨重、骨重/骨直徑、骨重/骨長差別不顯著。結果表明，一定劑量桑寄生水煎液能增加大鼠左股骨骨密度，見表1、2。

表1 對骨質疏松模型大鼠左股骨骨重、骨長、骨直徑的影響（±s，n=9）

表1 對骨質疏松模型大鼠左股骨骨重、骨長、骨直徑的影響（±s，n=9）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別骨重/g骨長/mm骨直徑/mm正常組0.816 3±0.419 3 30.664 4±1.359 0 6.573 3±0.584 4模型組0.530 4±0.079 4##27.524 4±1.670 4##6.368 9±0.569 5陽性組0.707 8±0.064 2**27.380 0±2.025 86.241 1±0.429 7桑寄生高劑量0.684 7±0.100 3**27.764 4±1.135 26.162 2±0.302 8桑寄生中劑量0.589 4±0.041 928.565 6±0.915 26.616 7±0.462 1桑寄生低劑量0.542 3±0.059 827.152 2±1.594 36.383 3±0.3692 2

表2 對骨質疏松模型大鼠左股骨骨重/骨長、骨重/骨直徑的影響（±s，n=9）

表2 對骨質疏松模型大鼠左股骨骨重/骨長、骨重/骨直徑的影響（±s，n=9）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01。

組別骨重/骨直徑（g?mm-1）骨重/骨長（g?mm-1）正常組0.125 0±0.012 3 0.026 6±0.001 4模型組0.083 7±0.012 9##0.019 2±0.001 9##陽性組0.113 8±0.011 4**0.026 1±0.003 9**桑寄生高劑量0.110 9±0.013 3**0.024 8±0.004 2**桑寄生中劑量0.089 5±0.010 1 0.020 6±0.001 5桑寄生低劑量0.085 4±0.014 5 0.020 1±0.003 4

3.3 血清中骨鈣素、堿性磷酸酶濃度的檢測結果

模型組與正常組比較，血清中骨鈣素（OT）、堿性磷酸酶（ALP）濃度明顯提高，陽性組及桑寄生給藥組能明顯降低血清中OT、ALP濃度水平，其中陽性組及桑寄生給藥組中OT 、ALP 濃度水平與模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。

3.4 組織樣品桑寄生指標成分藥代動力學參數分析

各組織桑寄生成分濃度-時間經DAS 2.0統計處理后發(fā)現，萹蓄苷在組織中AUC0-t大小排序為胃＞腎＞腦＞小腸＞大腸＞肝＞肺，Cmax大小排序為胃＞腎＞小腸＞腦＞肝＞大腸＞肺，Tmax大小排序為大腸＞小腸=胃＞腎=肝＞肺=腦；槲皮苷組織中AUC0-t大小排序為腎＞胃＞肝＞心＞肺＞脾＞小腸＞大腸＞腦，Cmax大小排序為胃＞肝＞腎＞心＞脾＞小腸＞肺＞腦＞大腸，Tmax大小排序為大腸＞肺＞肝=心=胃＞小腸＞腦＞脾=腎，見表4、5、6。

表3 對大鼠血清OT、ALP 測定值的影響（ˉx±s，n=9）

表4 維甲酸骨質疏松模型桑寄生水煎液高劑量組織萹蓄苷含量藥代動力學參數

表5 維甲酸骨質疏松模型桑寄生水煎液高劑量組織槲皮苷含量藥代動力學參數

表6 桑寄生指標成分在大鼠體內組織分布與歸經相關性

4 討論

4.1 桑寄生補肝腎、強筋骨藥效觀察

本實驗中，模型組大鼠拱背、豎毛、體重增加遲緩、活動減少、反應遲鈍，并且該組大鼠左股骨重、骨重/股直徑、骨重/骨長等指標明顯下降，從側面反映出維甲酸可致大鼠左股骨骨密度降低，表明造模成功[13]。陽性組和桑寄生水煎液高、中劑量組均能提高大鼠左股骨重、骨重/股直徑、骨重/骨長，與模型組比較，差異顯著（P＜0.01），表明桑寄生具有對抗維甲酸大鼠骨質疏松作用。維甲酸可降低正常人成骨細胞的活性，并抑制成骨細胞增殖、激活破骨細胞，使血清中ALP、OT等指標明顯升高[14]。陽性組、桑寄生各劑量組均能降低血清中OT 、ALP水平，與模型組比較，差異顯著（P＜0.01，P＜0.05），表明桑寄生水煎液可抑制骨吸收，提高骨質量，改善骨代謝的負平衡狀態(tài)，從而達到治療骨質疏松的作用。上述結果表明，桑寄生水煎液可對抗維甲酸所致大鼠骨質疏松，具有補肝腎、強筋骨作用。

4.2 桑寄生功效物質觀察及其分布與歸經的關系

桑寄生主要含黃酮類、生物堿、萜類、有機酸、多糖、蛋白質、凝集素等化學成分[15]。桑寄生中所含黃酮類成分主要為槲皮素、萹蓄苷、槲皮苷、蘆丁、廣寄生苷等[16，17]。體外研究表明，黃酮類物質可通過抑制破骨細胞分化，促進骨形成，起到抗骨質疏松的作用[18]。根據上述研究成果，本實驗選擇萹蓄苷、槲皮苷、蘆丁等黃酮類成分作為桑寄生的指標成分。維甲酸致骨質疏松模型大鼠的組織分布結果顯示，槲皮苷分布于腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、血清中，萹蓄苷分布于肺、腎、胃、小腸，蘆丁僅在胃中有少量分布。結合藥理實驗結果可知，萹蓄苷、槲皮苷是桑寄生補肝腎、強筋骨的代表性成分。指標成分在組織中的藥代動力學參數AUC0-t、維持時間結果分析表明，萹蓄苷在維甲酸致骨質疏松模型大鼠腎組織中AUC0-t較大（居于第2位），腎內藥物維持時間上居首位，提示萹蓄苷在腎組織中分布較多，維持較長，與桑寄生歸腎經的傳統認識一致。萹蓄苷在肺中分布較多，提示桑寄生還可能作用于肺經，但仍需要進一步實驗證明。槲皮苷在維甲酸致骨質疏松模型大鼠腎組織中AUC0-t和藥物維持時間均居首位，提示槲皮苷在腎組織中作用更強，這與桑寄生歸腎經的傳統認識的認識一致。因此，桑寄生歸腎經的主要功效物質為槲皮苷、萹蓄苷。

綜上所述，桑寄生對抗維甲酸所致大鼠骨質疏松的功效相關成分為萹蓄苷、槲皮苷。因此，萹蓄苷、槲皮苷為桑寄生補肝腎、強筋骨功效的代表性成分。萹蓄苷、槲皮苷在維甲酸致骨質疏松模型大鼠體內分布情況與桑寄生歸腎經具有高度一致性，符合桑寄生歸腎經的傳統認識。

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A Research of Effective Chemicals of Taxillus Chinensis Danser on Osteoporosis and Channel Tropism Based on Disease-Effect-Bioanalysis

Zhao Huawei1,2, Wang Jing1,2, Cui Ying1,2, Wang Hengjie1,2, Wang Junming1,2, Ma Kai3
(1. School of Pharmacy, Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;
2.Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis And Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046 ,China;
3. Henan Academy of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China)

This study aimed to observe the effect of Taxillus on osteoporotic rats and investigate effective chemicals of Taxillus, in order to find out the relationships between their body distribution and the channel tropism of Taxillus. The osteoporotic rat models were established through retinoic acid administration to observe the efficacy of the water solution of Taxillus. Besides, taking rutin, avicularin and quercetin as indexes, organs of all rats were prepared to measure their distributions and metabolism before analyzing the correlation between body distribution of effective chemicals and channel tropism of Taxillus. It was found that Taxillus solution significantly improved weight (W), W / length (L) and W / diameter (D) of osteoporotic rats, and reduced the contents of osteocalcin (OT) and alkaline phosphatase (ALP). Rutin, one of the indexes in this study, was seldom in the stomach. AUC0-t of avicularin showed its distribution in stomach, kidney, brain, small intestine, large intestine, liver, lung from most to least in content. The metabolism results showed that avicularin stayed longer time in stomach and kidney than that in brain, large intestine, small intestine and spleen, liver, heart, lung, and plasma. And AUC0-t of quercetin showed its distribution in kidney, stomach, liver, heart, lung, spleen, small intestine, large intestine and brain from most to least in content. Quercetin kept longer time in kidney, stomach, liver, heart, spleen and brain than that in large intestine, plasma and small intestine. In conclusion, water solution of Taxillus was effective in the treatment of osteoporotic rats. Avicularin and quercetin, as the main substance of Taxillus, functioned in nourishing liver and kidney. Their distributions in rats were consistent with the channel tropism of Taxillus.

Taxillus, osteoporotic in rats, pesticide effect, effective chemicals, channel tropism

10.11842/wst.2016.04.012

R285.1

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2015-10-08

修回日期：2015-11-17

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81473368）：基于“病證-效應-生物樣本分析”方法的生姜、干姜、炮姜藥性物質研究，負責人：崔瑛。

＊＊ 通訊作者：崔瑛，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥藥性物質研究。