麥冬皂苷B體外調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞miRNA-34b表達(dá)的研究＊

邱雯莉，姜澤群，陳海彬，周紅光

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023）

麥冬皂苷B體外調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞miRNA-34b表達(dá)的研究＊

邱雯莉，姜澤群，陳海彬，周紅光＊＊

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023）

目的：本研究主要觀察不同方式處理后的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）A549細(xì)胞中miRNA-34b表達(dá)水平，探討miRNA-34b對(duì)MET信號(hào) 通路的調(diào)控機(jī)制，以及麥冬皂苷B（OPB）抑癌效應(yīng)的分子機(jī)理，探尋治療NSCLC的新靶點(diǎn)。方法：采用非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞、胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5、A549+OPB細(xì)胞、感染過表達(dá)慢病毒LV-hsa-mir-34b的A549細(xì)胞、以及感染陰性對(duì)照CON181B病毒的A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，分別設(shè)為CON組、MRC-5組、CON+OPB組、Micro-up組、NC組。采用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-34b在CON組、MRC-5組、A549+OPB組A549細(xì)胞中的表達(dá)情況。使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNA-34b可能的下游功能靶基因。使用qRT-PCR 的方法定量分析OPB對(duì)MET基因表達(dá)的影響，用Western blot檢測(cè)miRNA-34b和OPB對(duì)靶MET蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：與MRC-5組相比，A549細(xì)胞中miRNA-34b的表達(dá)明顯減少，加入OPB后miR-34b的表達(dá)增加。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示MET基因是miR-34b可能的關(guān)鍵下游靶基因。加入OPB后，MET基因水平和蛋白水平的表達(dá)均降低。結(jié)論：OPB可能通過上調(diào)A549細(xì)胞miRNA-34b表達(dá)，抑制下游靶基因MET進(jìn)而發(fā)揮抗癌作用。

非小細(xì)胞肺癌 miRNA-34b MET基因 麥冬皂苷B

肺癌嚴(yán)重危害人類健康是目前世界上最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中占第1位，造成極大的疾病負(fù)擔(dān)[1]。其中非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型，占所有肺癌病例的80.0%以上。隨著綜合治療模式以及分子生物化學(xué)的發(fā)展，NSCLC的治效有所提高，但預(yù)后仍不理想，5年總生存率不到20.0%。微小核糖核酸（miRNA）是一類廣泛存在的非編碼蛋白的小分子RNA，miRNA表達(dá)及調(diào)控失衡在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。近年來，隨著對(duì)miRNA研究的深入，越來越多的研究顯示miRNA在肺癌的發(fā)展過程中占有重要的地位[3]。其中miRNA-34b被證實(shí)與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

“周氏克金巖方”為國醫(yī)大師周仲瑛教授臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的抗肺癌有效驗(yàn)方,由軟堅(jiān)散結(jié)、燥濕化痰、活血祛瘀、養(yǎng)陰益氣等4類功效藥物組成。經(jīng)高通量篩選，得到對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）有細(xì)胞毒作用的單體靶點(diǎn)有20余種，包括麥冬皂苷、異甘草素、槲皮素、人參皂苷和聯(lián)芐類化合物等單體化合物。在這張抗肺癌方劑，麥冬皂苷B（OPB）[4]作為一味不可或缺的中藥組分，具有顯著的體外抗癌作用,但其相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)感染過表達(dá)慢病毒LV-hsa-miR-34b的A549細(xì)胞株以及加入了OPB的A549細(xì)胞株中miRNA-34b及MET基因的表達(dá)，來揭示OPB抗NSCLC的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1.1 細(xì)胞

胚胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 分組

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共分為CON組（A549細(xì)胞）、MRC-5組、CON+OPB組、Micro-up組（感染過表達(dá)慢病毒）、NC組（感染陰性對(duì)照病毒）。

1.1.3 主要試劑

1640、MEM、胎牛血清和鏈霉素（10 000 μg·mL-1）/青霉素（10 000 U·mL-1）（美國 Gibco公司，批號(hào)分別為：8115211、8114274、8172881、1491907）；Trizol （上海普飛公司，批號(hào)：3101-100）；oligo dT（上?；ぃ?hào)：B0205）；M-MLV、dNTPS、Rnase Inhibitor （promega 公司，批號(hào)分別為：M1705、U1240、N2115）；SYBR Master Mixture（TAKARA公司，批號(hào)：DRR041B）；hsa-miR-34b過表達(dá)慢病毒LV-hsa-miR-34b病毒（批號(hào)：17056-2）和陰性對(duì)照CON181B病毒以及Primer由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，批號(hào)：11668）；兔抗人MET一抗（Abcam 公司，批號(hào)：ab193599），山羊抗兔 IgG 二抗（Santa公司，批號(hào)：B0513）；BCA Protein Assay（上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：P0010S）；Polybrene 和 Enhanced Infection Solution （上海凱基基因，貨號(hào)：REVG0001、REVG0002）；麥冬皂苷B（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：ZL20110412B），配成 10 mmol·L-1貯液備用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MRC-5細(xì)胞用含有10%濃度的胎牛血清和1%濃度的青霉素/鏈霉素雙抗的MEM培養(yǎng)基，A549細(xì)胞用含有10%濃度的胎牛血清和1%濃度的青霉素/鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，均在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 給藥

根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]，A549細(xì)胞密度達(dá)80.0%時(shí)，加麥冬皂苷B 10 μmol·mL-1，處理6 h后收樣。1.2.3 目的細(xì)胞A549慢病毒感染

將指數(shù)生長期的A549細(xì)胞用胰酶消化，用完全培養(yǎng)基配制成5×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，6孔板每孔加入2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)至感染時(shí)細(xì)胞鋪板量達(dá)20.0%，每孔更換為1 mL的無雙抗培養(yǎng)基。根據(jù)MOI值公式計(jì)算每孔加入的過表達(dá)hsa-miR-34b的慢病毒LV-hsa-miR-34b和空白陰性對(duì)照慢病毒LV-NC病毒量（109TU·mL-1）來感染A549細(xì)胞，感染時(shí)加入5 μg·mL-1的polybrene以增加感染率。感染12 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。觀察細(xì)胞狀況，根據(jù)其生長狀況更換培養(yǎng)基。感染96 h后，倒置熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達(dá)情況，并攝像。

1.2.4 細(xì)胞總RNA的提取及純化

分別收集CON組細(xì)胞，CON+OPB組細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞，Micro-up組細(xì)胞及NC組細(xì)胞2×106個(gè)，按照Trizol試劑盒上的說明方法提取總RNA。待RNA沉淀基本透明時(shí)，加入RNase-free水至完全溶解，NanoDropTM2000/2000C分光光度計(jì)分別測(cè)定所抽提RNA的濃度及質(zhì)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了證實(shí)過表達(dá)慢病毒感染的情況，以及感染過表達(dá)病毒和加入OPB前后MET基因表達(dá)的變化，我們進(jìn)行了qRT-PCR 驗(yàn)證（以U6為內(nèi)參）。qRTPCR反應(yīng)條件為：95℃變性30 s；95℃退火5 s，60℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。分析目的基因循環(huán)次數(shù)（Cycle Time，Ct值），通過2-△△Ct法計(jì)算目的基因差異表達(dá)倍數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 miRNA-34b的靶基因預(yù)測(cè)

通過生物學(xué)信息軟件對(duì)miRNA-34b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究常用的三大miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件PicTar、Targetscan 和 Miranda同時(shí)對(duì)miRNA-34b的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)MET蛋白的表達(dá)

將指數(shù)生長期的各組細(xì)胞用PBS洗滌兩次后用輕輕刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移入EP管中，用含有苯甲基磺酰氟（Phenylmethyl Sulfonylfluoride，PMSF）的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整每個(gè)樣品濃度為2 μg·mL-1，每孔上樣20 μL，用SDSPAGE 膠進(jìn)行電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉PVDF 1 h，加入一抗（1:500稀釋），4℃過夜，TBST洗4次，每次8 min，再加入含有辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（1:2 000 稀釋）孵育1.5 h，TBST洗4次，每次8 min。以1:40的比例混合A液和B液均勻滴加到硝酸纖維素膜上，曝光檢測(cè)。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

圖1 miRNA-34b的表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞熒光視野下病毒感染結(jié)果（×100倍）

圖3 miR-34b的表達(dá)

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，組間兩樣本的均數(shù)比較采用成組 t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-34b在MRC-5組、A549組、A549+ OPB組的表達(dá)

以U6為內(nèi)參，MRC-5組為基準(zhǔn)，校正計(jì)算各組2-△△Ct值。miRNA-34b在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯降低，加入抑制腫瘤的OPB后其含量升高，說明miRNA-34b具有明顯的抑癌作用，且OPB能升高A549細(xì)胞中miRNA-34b的含量（圖1）。

2.2 各組細(xì)胞感染結(jié)果

Micro-up組感染LV-hsa-mir-34b（17056-2）病毒，NC對(duì)照組感染陰性對(duì)照CON181病毒，病毒感染后96 h進(jìn)行熒光拍照，放大100倍，各組細(xì)胞熒光拍照結(jié)果見圖2，可見病毒感染成功。

2.3 miRNA-34b潛在靶基因的預(yù)測(cè)

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)并利用生物學(xué)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-34b預(yù)測(cè)的靶基因中包括MET，且提示MET可能是miRNA-34b的關(guān)鍵下游靶基因，這種基因已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用。

2.4 通過qRT-PCR驗(yàn)證miR-34b的表達(dá)以及miR-34b和OP-B對(duì)MET基因表達(dá)的影響

為驗(yàn)證A549細(xì)胞是否感染成功，以及OPB和miR-34b和MET基因的影響，感染96 h后通過qRT-PCR來測(cè)定miR-34b和MET基因的表達(dá)水平，以NC組為基準(zhǔn)，計(jì)算各組細(xì)胞2-△△Ct。qRTPCR結(jié)果顯示，Micro-up組miR-34b的表達(dá)豐度是NC組的398.456倍（P=0.012），說明過表達(dá)慢病毒感染成功；轉(zhuǎn)染LV-hsa-miR-34b病毒和加入OPB后，都能使MET基因表達(dá)減少，說明miR-34b和OPB能抑制MET基因的表達(dá)，結(jié)果見圖3、圖4。

2.5 miR-34b以及OPB對(duì)MET蛋白表達(dá)的影響

過表達(dá)慢病毒LV-hsa-miR-34b感染96 h以后，以及加入OP-B6h以后，檢測(cè)A549細(xì)胞MET蛋白的表達(dá)水平?；叶确治鼋Y(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒以及加入OP-B均使MET蛋白的表達(dá)量下調(diào)，與CON組相比P＜0.05，結(jié)果見圖5。

3 討論

microRNA（miRNA）是一類長度大約21-25 nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,它們由較長的初級(jí)轉(zhuǎn)錄前體（pri-miRNA）被剪切形成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)初級(jí)miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNAs 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，并被Dicer酶切割為成熟的miRNA。miRNA主要通過與靶標(biāo)基因3’非編碼區(qū)（3’-UTR）的完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化 凋亡、代謝，個(gè)體發(fā)育，腫瘤形成[6]。近年來隨著腫瘤研究的不斷深入，miRNA已經(jīng)成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新靶點(diǎn)[7]。miRN的調(diào)控相當(dāng)復(fù)雜，至今miRNA數(shù)據(jù)庫“miRBas”中已收錄近1 000種人類的miRNA，并且每一個(gè)miRNA都有很多潛在的作用靶點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，microRNA調(diào)控了人體中近1/3的基因表達(dá)[8]。已發(fā)現(xiàn)的miRNA約50%在基因組上定位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的區(qū)域和脆性位點(diǎn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到調(diào)控的樞紐作用。miRNA-34家族包括miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34，其中miRNA-34a有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄本，而miRNA-34b和miRNA-34c共用一個(gè)轉(zhuǎn)錄本[9]。由于miRNA-34b在肺部組織的特異性表達(dá)，且miRNA-34b影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮抑制腫瘤的作用[10]，提示miRNA-34b對(duì)于肺癌研究的價(jià)值。因此，我們以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞與正常胚肺成纖維細(xì)胞中miRNA-34b的表達(dá)差異為切入點(diǎn)，研究其在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中的作用及作用機(jī)制。

MET基因是原癌基因，其蛋白產(chǎn)物是肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor， HGF）的受體，具有酪氨酸激酶活性[11]。MET蛋白及其配體HGF的結(jié)合在多種惡性腫瘤如食管癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的非小細(xì)胞肺癌中都有MET蛋白的表達(dá)，其中超過60%為過表達(dá)[13]。而通過生物學(xué)信息軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MET基因可能為miRNA-34b下游調(diào)控靶基因，我們推測(cè)miRNA-34b可以通過調(diào)控MET基因的表達(dá)而發(fā)揮其抑癌作用[14]。miRNA-34b通過與MET mRNA的3’-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合而降解MET的mRNA，抑制其表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染了過表達(dá)慢病毒LV-hsa-miR-34b的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中，MET基因的表達(dá)降低，說明miRNA-34b對(duì)MET基因的表達(dá)起抑制作用。

圖4 MET基因的表達(dá)

圖5 MET蛋白的表達(dá)

OPB是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有抑癌作用的單體。研究發(fā)現(xiàn)OPB對(duì)于多種NSCLC細(xì)胞株均具有明顯的抑制作用。通過抑制MMP-2和MMP-9，抑制 NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移；通過抑制PI3K/Akt通路，OPB能誘導(dǎo)NSCLC腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬；還可以通過抑制CyclinB1、CyclinA2、CDK2等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)周期抑制蛋白P21和P27的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯[15]。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)加入OPB后A549細(xì)胞的miRNA-34b表達(dá)量升高，而MET基因和蛋白表達(dá)均降低；感染過表達(dá)慢病毒LV-hsa-miR-34b的A549細(xì)胞中MET基因和蛋白表達(dá)也降低。所以推測(cè)在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中OPB的抑癌效應(yīng)可能是通過調(diào)控miRNA-34b，從而調(diào)控MET通路來實(shí)現(xiàn)的。這一研究為明確miRNA-34b調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及OPB的新藥研發(fā)提供了一種新的思路。

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A Research on miRNA-34b Expression Regulated by Ophiopogonin-B in Vitro in Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells

Qiu Wenli, Jiang Zequn, Chen Haibin, Zhou Hongguang
(School of Basic Medical Sciences, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

This study aimed to observe miRNA-34b expression through different treatments of non-small cell lung cancer (NSCLC), and investigate the regulatory effect of miR-34b on MET signaling pathway and the molecular mechanism of anti-tumor effect of ophiopogonin-B (OPB), and explore the new target for the treatment of NSCLC. Taking A549 cells, MRC-5 cells, A549 cells with OPB treatment, A549 cells infected with hsa-miR-34b-over-expressed lentivirus vector, and A549 cells infected with negative control CON181B virus as researchobjects, the CON group, the MRC-5 group, the CON+OPB group, the Micro-up group and the NC group were involved in the study. The expression of miR-34b in the A549 group, the MRC-5 group and the A549+OPB group were detected by qRT-PCR. Downstream targets of miR-34b were predicted by a bioinformatics software. Quantitative analysis was performed to quantify the expression of MET gene by qRT-PCR method with OPB administration. The effects of miR-34b and OPB on the expression of MET protein was tested by Western blot. Compared with the MRC-5 group, the expression of miR-34b in A549 cells was significantly decreased, but increased combining with OPB. TargetScan bioinformatics software showed that MET gene was prodicted to be the high-related downstream target gene of miR-34b. Within the administration of OPB, both genatic and protein levels of MET were decreased. In conclusion, OPB may present its anti-tumor effects through up-regulating miR-34b expression in A549 cells and supposing its downstream gene MET.

Lung cancer, miRNA-34b, MET gene, ophiopogonin-B

10.11842/wst.2016.04.011

R73-3

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-03-07

修回日期：2016-03-25

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81473608）：基于microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的消癌解毒方抗腫瘤作用機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：周紅光； 國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81273717）：基于蛋白組學(xué)方法的“癌毒”病機(jī)研究，負(fù)責(zé)人：吳勉華；國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81503535）：基于mTOR信號(hào)通路調(diào)控缺氧微環(huán)境下細(xì)胞自噬的消癌解毒方抗腫瘤作用機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：李黎。

＊＊ 通訊作者：周紅光，醫(yī)學(xué)博士，副教授，副主任中醫(yī)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤研究。