橄欖苦甙改善db/db小鼠肝臟胰島素抵抗作用機(jī)制研究＊

候 丹，孫 文，劉銅華，吳麗麗，秦靈靈，郭 璇，許光遠(yuǎn)，張 茁，侯 毅，張 露，張程斐

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 咸陽 712000；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029；5.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100029）

橄欖苦甙改善db/db小鼠肝臟胰島素抵抗作用機(jī)制研究＊

候 丹1，孫 文2，劉銅華3＊＊，吳麗麗2，秦靈靈4，郭 璇5，許光遠(yuǎn)5，張 茁1，侯 毅5，張 露5，張程斐5

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 咸陽 712000；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029；5.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100029）

目的：本研究主要觀察橄欖苦甙（OL）改善肥胖db/db小鼠胰島素抵抗的作用機(jī)制。方法：6-8周齡雄性db/db小鼠12只，按體質(zhì)量和隨機(jī)血糖隨機(jī)分為OL組和模型組，每組6只，另設(shè)同周齡 C57BL/6J小鼠6只為正常組。OL組灌服OL水溶液50 mg·kg-1體重，其余組給以等劑量生理鹽水。治療4周后，檢測各組小鼠的空腹血糖（FBG）、胰島素水平、計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)以及口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT），取肝臟組織，采用RT-PCR 、Western Blot檢測相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果：治療4周后，與模型組比較，OL組體重、空腹血糖、血清胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；OGTT實(shí)驗(yàn)后，OL組血糖明顯低于模型組（P＜0.01）；OL組小鼠肝臟組織InsR、IRS-1、GLUT-2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論：OL通過提高肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 mRNA和蛋白的表達(dá)起到降低血糖、改善胰島素抵抗的作用。

橄欖苦甙 2型糖尿病 胰島素抵抗 肝臟

糖尿病是因體內(nèi)胰島素絕對或相對分泌不足而引起的以糖、蛋白質(zhì)、脂肪等代謝絮亂為主的一種內(nèi)分泌疾病，可引起多系統(tǒng)損害，導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、血管、心臟等組織器官的慢性進(jìn)行性病變、功能減退及衰竭。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，糖尿病已成為第三大嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，且發(fā)病率有逐年上升。胰島素抵抗是指組織對胰島素敏感性降低，使得胰島素介導(dǎo)的組織對葡萄糖攝取和利用的效率下降。胰島素抵抗是糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制之一，伴隨糖尿病發(fā)生、發(fā)展的全過程。胰島素受體（Insulin Receptor，InsR）、胰島素受體底物1（Insulin Receptor Substrate 1，IRS1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2（Glucose Transporter-2，GLUT-2）在胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。胰島素與肝臟細(xì)胞膜表面的InsR特異性結(jié)合，激活多種激酶，活化IRS-1,完成下游信號蛋白的級聯(lián)效應(yīng)，促進(jìn)GLUT-2向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[1]。

油橄欖俗稱洋橄欖，系木犀科植物，是世界名貴常綠木本油料和果用樹種。橄欖苦甙（Oleuropein，OL）是橄欖葉提取物中最主要的活性成分（分子量：540.51，化學(xué)結(jié)構(gòu)式C25H32O13，見圖1）。有研究顯示，OL具有降血糖、抗真菌、抗病毒、抗炎以及抗氧化和抗癌等多種藥理作用[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察OL對自發(fā)性2型糖尿病模型db/db小鼠降糖作用和對肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控，探究OL對db/db小鼠肝臟糖代謝的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器與試藥

美國Bio-rad酶標(biāo)儀；美國ABI 7500 Real-Time PCR儀；美國BINTA數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)；美國Image-Pro Plus Analysis Soft ware計(jì)算機(jī)圖像分析儀；r-911全自動放免計(jì)數(shù)儀（中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司）。

葡萄糖氧化酶法葡萄糖測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，產(chǎn)品編號：YZB/京 0111-2013）；GoScript? Reverse Transcription System、GoTaq?qPCR Master Mix（美國Promega公司，貨號：0000076581）；GAPDH、InsR、IRS-1、GLUT 2 mRNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如下：GAPDH上游引物5'-TGAAGCAGGCAT CTGAGGG-3'，下游引物 5'-CGAAGGT GGAAGAG TGGGAG-3'；InsR 上游引物5'-TTTGTCATGGATG GAGGCTA-3'，下游引物5'-CCT CATCTTGGGGTT GAACT-3'；IRS-1上游引5'-TCCTATCCCGAAGAG GGTCT-3'，下游引物5'-TG GGCATATAGCCATCA TCA-3'；GLUT-2上游引物5'-ATCATTGGCACATC CTA CT-3'；下游引物5'-TCAGTTCCTCTTAGTCTC TTC-3'。InsR（英國Abcam 公司，批號：ab172965）、IRS-1（英國Abcam 公司，批號：ab52167）、GLUT-2（英國Abcam 公司，批號：ab54460）；二抗Anti-rabit IgG（德國CST公司，批號：26）；橄欖苦甙凍干粉，純度為99%（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，貨號：32619-42-4）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選取SPF級6-8周齡雄性db/db小鼠12只，同周齡雄性C57BL/6J小鼠6只，均購自南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，許可證編號：SCXK（蘇）2010-0001，飼養(yǎng)于北京動物實(shí)驗(yàn)中心動物實(shí)驗(yàn)室（SPF級）。飼養(yǎng)條件：溫度21-25℃、濕度45%-65%，12 h/12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。db/db小鼠喂養(yǎng)全價高脂飼料（基礎(chǔ)飼料78.8%，蛋黃粉10%，豬油10%，膽固醇1%，膽鹽0.2%）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供；C57BL/6J小鼠喂養(yǎng)普通全價營養(yǎng)顆粒鼠飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將db/db小鼠按體重和隨機(jī)血糖隨機(jī)分為OL組和模型組，每組6只，均用高脂營養(yǎng)飼料；C57BL/6J小鼠6只為正常組，給予普通營養(yǎng)飼料。

圖1 橄欖苦甙化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 給藥方法

OL組灌服OL水溶液50 mg·kg-1（體質(zhì)量），其余組給以等劑量生理鹽水。每日1次，連續(xù)給藥4周。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 一般情況觀察

觀察各組小鼠一般狀態(tài)（精神狀態(tài)、活動情況、毛色等），每周檢測1次動物體質(zhì)量。

2.3.2 血液生化指標(biāo)檢測

給藥4周末，禁食不禁水12 h，麻醉后眼眶靜脈取血，4℃ 3 500 r·min-110 min離心抽取血清，葡萄糖氧化酶法檢測各組小鼠空腹血糖（Fasting Blood-Glucose，F(xiàn)BG）；放免法檢測血清胰島素水平由北京華英生物技術(shù)研究所檢測，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（Homa Insulin-Resistance，HOMA-IR），公式如下：HOMA-IR=空腹血糖×血清胰島素水平/22.5。

2.3.3 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

給藥后第4周中，進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，檢測前一天禁食不禁水12 h，給予葡萄糖2 g·kg-1灌胃，尾靜脈取血，分別測定0、30、60、120 min時的血糖值。

2.3.4 RT-PCR檢測

取液氮凍存的小鼠肝組織，采用Trizol 法提取組織總RNA，利用GoScript? Reverse Transcription System試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，退火25℃ 5 min，延伸42℃ 1 h，滅活70℃ 15 min，得到cDNA；20 μL反應(yīng)體系，2 μL cDNA稀釋液加入10 μL GoTaq反應(yīng)液、7.2 μL Nuclease-Free Water和0.8 μL引物混合物，置于Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min（共40次循環(huán)）；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s溶解。運(yùn)用2-△△CT相對定量法比較各組目標(biāo)mRNA表達(dá)差異。

2.3.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)

取液氮凍存的小鼠肝組織，加入冰浴的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育30 min，收集溶解產(chǎn)物，12 000 rpm 4℃ 30 min離心；抽取上清，加入上樣緩沖液，100℃5 min 蛋白變性；上樣，以每孔20 μg量加入12.5% SDS-PAGE凝膠，100 V 2 h電泳，預(yù)處理PVDF膜及濾紙，半干法凝膠轉(zhuǎn)膜，100 A 2 h，膜在TBS溶液洗15 min；Blocking one/ Blocking one-P封閉30 min，一抗以solution1按1：1 000比例稀釋，4℃孵育過夜，TBST（Tris緩沖液加吐溫20）洗膜后二抗（1：10 000）孵育，室溫1 h。洗膜后加ECL發(fā)光液，室溫反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)成像，蛋白條帶用Image J 7.0圖像分析。

2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法；兩組間比較，滿足方差齊性時用LSD-t檢驗(yàn)，不滿足方差齊性時用非參數(shù)檢驗(yàn)；P＜0.05表示結(jié)果有顯著性差異，P＜0.01表示結(jié)果有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后，正常組小鼠精神良好，動作靈活，反應(yīng)靈敏，皮毛光澤。模型組小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后，體重較正常組顯著增高（P＜0.01）（表1），并出現(xiàn)多飲、多尿、多食、皮毛無光澤等現(xiàn)象。OL組有類似模型組表現(xiàn)，但多飲、多尿、多食程度較低，皮毛較有光澤。

3.2 OL對db/db小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素抵抗的影響

db/db小鼠具有肥胖、高血糖、胰島素抵抗特點(diǎn)。治療4周后，模型組體質(zhì)量、空腹血糖、血清胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)比正常組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，OL組體質(zhì)量、空腹血糖、血清胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；說明OL有改善db/db小鼠肥胖、高血糖和胰島素抵抗的作用（表1）。

3.3 OL對db/db小鼠糖耐量的影響

由表2可知，口服葡萄糖120 min后模型組的糖耐量仍維持在較高水平，顯著高于正常組（P＜0.01）；OL組0 min至120 min各點(diǎn)血糖明顯低于模型組（P＜0.01）；各組OGTT曲線下面積（AUC）計(jì)算顯示，模型組明顯高于正常組（P＜0.01），OL組較模型組顯著降低（P＜0.01），說明OL具有改善2型糖尿病小鼠糖耐量異常的作用（表2）。

3.4 OL對db/db小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 mRNA表達(dá)的影響

利用上述DOL的定義公式計(jì)算經(jīng)營杠桿系數(shù)，必須同時取得利潤變動率和銷售變動率，這些都是事后反映的數(shù)據(jù)，不便于DOL的預(yù)測。因此，要設(shè)法推導(dǎo)出只需基期數(shù)據(jù)計(jì)算經(jīng)營杠桿的公式，即假定該企業(yè)產(chǎn)品的成本、銷量和利潤保持線性關(guān)系，產(chǎn)品可變成本在銷售收入中所占的比例不變，固定成本在一定產(chǎn)能范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，則經(jīng)營杠桿系數(shù)可通過銷售額和成本的關(guān)系來表示。

由表3可知，模型組小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 mRNA表達(dá)較正常組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，OL組小鼠肝臟組織InsR、IRS-1、GLUT-2 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。表明OL能夠上調(diào)胰島素信號傳導(dǎo)中關(guān)鍵分子 InsR、IRS-1、GLUT-2 的mRNA表達(dá)。

表1 OL對db/db小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響(± s，n=6）

表1 OL對db/db小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響(± s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；下同。

分組體質(zhì)量/g空腹血糖/mmol·L-1胰島素/μIU·mL-1胰島素抵抗指數(shù)正常組26.72±1.084.70±0.52 2.58±0.31 0.54±0.11模型組35.90±2.13**22.33±2.14**30.81±4.58**30.39±3.97**OL組30.58±2.44##8.87±1.35##23.01±6.59#9.23±3.45**

表2 OL對db/db小鼠糖耐量的影響/mmol·L-1(± s，n=6）

表2 OL對db/db小鼠糖耐量的影響/mmol·L-1(± s，n=6）

分組0 min 30 min 60 min 120 min AUC正常組4.25±0.54 12.73±0.55 7.18±0.67 4.33±0.45 899±56.85模型組20.37±2.01**32.70±1.44**25.95±1.89**22.28±0.89**3 123±123.39**OL組8.33±1.66##19.42±3.13##13.95±2.42##8.93±1.37##1 603.33±256.24##

3.5 OL對db/db小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2蛋白表達(dá)的影響

如表4所示，模型組db/db小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2蛋白表達(dá)明顯降低，較正常組有顯著差異（P＜0.01）；OL組較模型組顯著提高肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2蛋白表達(dá)（P＜0.05），表明OL上調(diào)InsR、IRS-1、GLUT-2等胰島素信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)。

4 討論

油橄欖主要分布在美國加州和歐洲地中海沿岸等國家和地區(qū)，主要應(yīng)用是將其鮮果加工成素有“植物油皇后”之稱的橄欖油[3,4]。橄欖葉是常用的降糖藥物，可代茶飲，也可磨成粉末使用。多項(xiàng)研究表明，橄欖葉水提物具有顯著的降低空腹血糖、隨機(jī)血糖，增加血液胰島素含量的作用[5-7]。現(xiàn)代生物技術(shù)分析表明，油橄欖葉中活性物質(zhì)主要有黃酮類、橄欖多酚、裂環(huán)烯醚萜類（包括OL）等，并且其抗氧化生物活性物含量高于油橄欖莖和果[8]。OL是橄欖葉提取物中最主要的活性成分，具有顯著的降血糖作用。以四氧嘧啶造模的糖尿病大鼠，經(jīng)過OL治療后血糖、血脂均顯著降低，肝臟脂肪樣變減少，組織損傷減低，其降糖機(jī)制可能與其改善肝臟氧化應(yīng)激水平有關(guān)[9]。Poudyal等[10]發(fā)現(xiàn)OL的降糖作用與其較強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān)。此外，對四氧嘧啶誘導(dǎo)的DM家兔OL按照20 mg·kg-1劑量灌胃給藥，在第8周時，OL治療組的血糖較DM模型組有明顯下降[11]。然而，目前對OL的降糖作用機(jī)制研究還不夠深入。

近年來，2型糖尿病的發(fā)病率逐年升高，其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，胰島素抵抗是重要機(jī)制之一[12]。肝臟是調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝的主要器官，在糖尿病發(fā)病中占重要地位[13]。InsR是胰島素信號傳導(dǎo)通路的起始因子，與胰島素結(jié)合后迅速發(fā)生磷酸化，并進(jìn)一步促使IRS磷酸化，激活下游分子，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖原合成，以起到降低血糖作用[14]。IRS-1是胰島素信號傳導(dǎo)通路中InsR的下游蛋白，其受InsR磷酸化的激活，將信號傳至胞內(nèi)進(jìn)而激活磷脂酞肌醇3激酶途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝[15]。研究發(fā)現(xiàn)，IRS-1敲除小鼠的血糖明顯升高[16]。GLUT-2是主要分布在肝臟一種介導(dǎo)葡萄糖攝取的載體蛋白，受上游分子調(diào)控，主要將細(xì)胞外葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)儲存[17]。

本實(shí)驗(yàn)中以自發(fā)性2型糖尿病模型db/db小鼠為模型，喂養(yǎng)4周后模型組出現(xiàn)高血糖、胰島素抵抗特點(diǎn)；OL組的血糖、胰島素水平、HOMA-IR則明顯降低，OGTT實(shí)驗(yàn)各時間點(diǎn)血糖均有明顯降低，且曲線下面積顯著減低，說明OL具有降糖、改善胰島素抵抗的作用（表1、表2）。與正常組比較，模型組小鼠肝組織InsR、IRS-1、GLUT-2表達(dá)明顯低于正常組，與模型組比較，OL組肝組織中InsR、IRS-1、GLUT-2表達(dá)明顯升高（表3、表4）。表1和表2的結(jié)果說明，OL通過促進(jìn)肝組織InsR、IRS-1、GLUT-2表達(dá)來降低血糖，改善胰島素抵抗和糖耐量異常。

表3 OL對db/db小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 mRNA表達(dá)的影響(± s，n=6）

表3 OL對db/db小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 mRNA表達(dá)的影響(± s，n=6）

分組InsR IRS-1 GLUT-2正常組1.02±0.211.03±0.26 1.01±0.12模型組0.14±0.04**0.53±0.12**0.31±0.09**OL組0.54±0.06##1.05±0.31##0.50±0.03##

表4 OL對db/db小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 蛋白表達(dá)的影響(± s，n=6）

表4 OL對db/db小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 蛋白表達(dá)的影響(± s，n=6）

分組InsR IRS-1 GLUT-2正常組1.22±0.10 1.18±0.11 0.97±0.06模型組0.85±0.10**0.78±0.18**0.53±0.04**OL組1.13±0.07#1.09±0.04#0.72±0.08#

圖1 OL對小鼠肝臟InsR、IRS-1、GLUT-2 蛋白表達(dá)的影響

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The Mechanism Behind the Effects of Oleuropein on Insulin Resistance in the Liver in db/db Mice

Hou Dan1, Sun Wen2, Liu Tonghua3, Wu Lili2, Qin Lingling2, Guo Xuan5, Xu Guangyuan5, Zhang Zhuo1, Hou Yi5, Zhang Lu5, Zhang Chengfei5
(1. College of First Clinical Medical, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, China;
2. Health-Cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
3. School of Graduates, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
4. Department of Science and Technology, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
5. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This study aimed to elucidate the mechanism behind the effects of oleuropein (OL) on improving insulin resistance in obese db/db mice. Twelve 6- to 8-week-old male db/db mice were randomly divided into the model group and the OL group with 6 in each group according to their levels of blood glucose and body weight, while six C57BL/6J mice with the same age were made up for the normal group. Mice of the OL group was intragastrically administered with (50 mg·kg-1) once a day. The mice of the other groups were treated with the saline solution with the same dosage. After treatment for four weeks, OGTT test was carried out, while fast blood glucose and serum insulin were tested. RT-PCT and western blot were used to quantify the mRNA and protein expressions of certain targets in the liver. As a result, it was found that the body weight, fast blood glucose, seruminsulin level and insulin resistance index were significantly decreased in the mice of the OL group when compared with model group after the treatment for 4 weeks (P＜0.05 or P＜0.01). Plasma glucose levels at each time point of OGTT tests were lower in the mice of the OL group than those of the model group (P＜0.01). The mRNA and protein expressions of InsR, IRS-1 and GLUT-2 in the mice of the OL group increased significantly (P＜0.01). In conclusion, it was demonstrated that oleuropein may reduce the blood glucose and improve the insulin resistance in db/db mice through up-regulating the mRNA and protein expressions of InsR, IRS-1 and GLUT-2 in the liver.

Oleuropein, type 2 diabetes, insulin resistance, liver

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.008

R587.1

A

2016-07-01

修回日期：2016-07-13

＊ 北京市教育委員會科學(xué)研究與研究生培養(yǎng)共建項(xiàng)目—科研項(xiàng)目：中藥干預(yù)胰島素抵抗技術(shù)平臺建設(shè)與方藥篩選研究，負(fù)責(zé)人：劉銅華。

＊＊ 通訊作者：劉銅華，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的臨床和基礎(chǔ)研究。