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    富含右旋糖苷番茄汁發(fā)酵飲料研制

    2016-03-18 06:51:16韓瑨吳正鈞游春蘋高彩霞乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室上海0046上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心上海0046光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院上海0046
    食品研究與開發(fā) 2016年2期
    關(guān)鍵詞:番茄汁右旋糖苷

    韓瑨,吳正鈞,游春蘋,高彩霞(.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室,上海0046;.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,上海0046;.光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院,上海0046)

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    富含右旋糖苷番茄汁發(fā)酵飲料研制

    韓瑨1,吳正鈞2,游春蘋3,高彩霞3
    (1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室,上海200436;2.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,上海200436;3.光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院,上海200436)

    摘要:腸膜明串珠菌BD1710可在番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中代謝合成右旋糖苷,其發(fā)酵液可作為主要原料來勾兌制備富含右旋糖苷的發(fā)酵飲料,通過正交試驗確定了該多糖飲料的配方為:發(fā)酵液用量30 %(體積分?jǐn)?shù))、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2%,優(yōu)選配方制備的發(fā)酵飲料中多糖含量可達(dá)1.0%以上。

    關(guān)鍵詞:腸膜明串珠菌BD1710;右旋糖苷;番茄汁蔗糖培養(yǎng)基

    多糖(polysaccharide)是一類由多個相同或不同類型單糖縮合而成的高分子碳水化合物,其廣泛分布于高等植物、地衣、海藻、動物和微生物中,由于其具有免疫調(diào)節(jié)(牛膝多糖)[1]、降血糖(苦瓜多糖)[2]、抗腫瘤(香菇多糖)[3]、抗衰老(海帶多糖)[4]等生物活性,以及增加穩(wěn)定性(紅棗多糖)[5]、促進(jìn)澄清(魔芋多糖)[6]等優(yōu)良的加工性能,因此近年來被越來越多地應(yīng)用于多糖類保健飲料中。根據(jù)多糖來源的不同,這些產(chǎn)業(yè)化的多糖飲料主要采用了3類多糖:植物多糖、真菌多糖以及細(xì)菌多糖。其中,植物多糖主要來自植物的莖、葉以及種子,因其普遍存在性而應(yīng)用最廣,真菌多糖大多來源于真菌的菌絲體、菌柄以子實體,而細(xì)菌多糖主要指由微生物在生長代謝過程中分泌到胞外的粘液多糖,出于食用安全性的考慮以及相關(guān)法律法規(guī)的限制,目前應(yīng)用于飲料產(chǎn)品中的細(xì)菌性多糖僅限于包括乳酸菌在內(nèi)的少數(shù)微生物,而乳酸菌胞外多糖的降血壓[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等益生作用已獲得廣泛的認(rèn)同,因此,富含乳酸菌多糖飲料的開發(fā)有助于推動細(xì)菌多糖在功能性飲料領(lǐng)域進(jìn)一步的應(yīng)用。

    腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)是一類的高產(chǎn)多糖乳酸菌,研究表明,由L. mesenteroides合成的多糖大多為主鏈以葡萄糖經(jīng)α-(1→3)、α-(1→4)或α-(1→6)糖苷鍵鍵合而成的葡聚糖(Glucan),如主鏈僅以α-(1→6)糖苷鍵將葡萄糖聚合而成的dextran[9],主鏈由α-(1→6)和α-(1→3)交替鍵合而成的alternan[10]等。這些結(jié)構(gòu)各異的葡聚糖在改善發(fā)酵制品的質(zhì)地、生物分離(Sephadexgels)、醫(yī)藥(代血漿)等方面發(fā)揮著不同的作用[9]。然而,目前L. mesenteroides多糖通常以化學(xué)合成培養(yǎng)基(Chemically defined medi-um,CDM)[11]為基料發(fā)酵獲得,需經(jīng)不同方法(Sevag 法[12]、三氟三氯乙烷法[13]、三氯乙酸法[14])提純后才能應(yīng)用于相關(guān)產(chǎn)品中。發(fā)酵基料組成的復(fù)雜性,繁瑣的多糖制備工藝導(dǎo)致的成本問題以及有機溶劑純化時潛在的殘留風(fēng)險成為L. mesenteroides多糖商業(yè)化應(yīng)用的不利因素。因此,尋找一種來源廣泛、價格低廉、且可直接飲用的發(fā)酵介質(zhì)是L. mesenteroides多糖飲料研發(fā)的關(guān)鍵。

    前期研究發(fā)現(xiàn),L. mesenteroides BD1710(CGMCC NO. 6432)在番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中可發(fā)酵產(chǎn)多糖,經(jīng)結(jié)構(gòu)解析確定為右旋糖苷。因此,本文首先比較了BD1710代謝不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基后,其發(fā)酵液的酸度、右旋糖苷及殘余蔗糖的含量,以確定適于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)選培養(yǎng)基配方,進(jìn)而以正交試驗為手段,研究了發(fā)酵液用量、蔗糖和檸檬酸的添加量對飲料感官效果的影響,確定了BD1710番茄汁發(fā)酵飲料的最佳工藝配方。此外,還對優(yōu)選配方制備獲得的飲料的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)進(jìn)行了測定,旨在為開發(fā)一種富含右旋糖苷的的發(fā)酵番茄汁飲料提供必要的理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1菌種與試驗材料

    菌種L. mesenteroides BD1710(CGMCC NO. 6432),由光明乳業(yè)股份有限公司提供;

    M17瓊脂/液體培養(yǎng)基:OXOID LTD.,英國;成熟番茄、蔗糖:市售;檸檬酸(食品級):市售;NaOH、無水乙醇:上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    1.2主要儀器設(shè)備

    主要儀器設(shè)備見表1。

    表1主要儀器設(shè)備Table 1 Experimental apparatus and equipment

    1.3方法

    1.3.1工藝流程

    工藝流程如下。

    1.3.2發(fā)酵種子的制備

    從L. mesenteroides BD1710(CGMCC NO. 6432)深冷保藏管中以接種環(huán)挑取少量菌粉劃線于M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)[以5.0%(g/mL)蔗糖取代M17培養(yǎng)基中0.5% (g/mL)的乳糖,在120℃下滅菌20 min即得]上,28℃好氧培養(yǎng)24 h取出,用接種環(huán)挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養(yǎng)基中,采用渦旋混合儀將細(xì)胞均勻分散后,28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h取出,再以2 %(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養(yǎng)基中,于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)液經(jīng)15 000 g離心10 min后取沉淀,并以相同體積的無菌蒸餾水重懸,即得發(fā)酵用的種子。

    1.3.3番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備

    1)番茄汁的制備:成熟番茄清洗、去皮,榨汁,果汁部分經(jīng)多層紗布過濾后,經(jīng)15 000 g離心10 min,取清液即得。

    2)番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備:向100 %(體積分?jǐn)?shù))的番茄汁中加入5 %、10 %、15 %、20 %(g/mL)的蔗糖,加熱溶解并冷卻后,用5.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,在120℃下滅菌20 min即得相應(yīng)蔗糖濃度的無菌番茄汁蔗糖培養(yǎng)基。

    1.3.4 L. mesenteroides BD1710番茄汁蔗糖發(fā)酵液的制備

    將1.3.2方法制備的L. mesenteroides BD1710發(fā)酵種子以2.0 %(體積分?jǐn)?shù))接種量無菌操作接入1.3.3方法制備的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中,180 r/min、28℃搖床恒溫培養(yǎng)48 h即得發(fā)酵液。

    1.3.5調(diào)配、均質(zhì)和滅菌

    將白砂糖、檸檬酸以一定比例完全溶解于50℃的水中,即得勾兌液。將L. mesenteroides BD1710 48 h的發(fā)酵液與上述勾兌液以一定比例充分混合均勻后在30 MPa壓力下進(jìn)行均質(zhì),并于100℃滅菌20 min。

    1.3.6右旋糖苷含量的測定

    將不同時間獲得的發(fā)酵液在沸水浴30 min,冷卻至室溫后加入4倍體積的無菌水稀釋,15 000 g離心10 min,取上清,加入3倍體積經(jīng)過預(yù)冷的無水乙醇,靜置過夜,15 000 g離心10 min,收集沉淀物,沉淀采用少量無水乙醇洗滌后,采用蒸餾水溶解后經(jīng)真空冷凍干燥后即得右旋糖苷,稱重即可。

    1.3.7酸度的測定

    稱取10 g發(fā)酵液于三角瓶中,加入蒸餾水20 mL、1 %酚酞指示劑3滴,搖勻,以0.1 mol/L NaOH滴定至終點。所用NaOH毫升數(shù)即為發(fā)酵液酸度(°T)。

    1.3.8殘余蔗糖含量的測定

    吸取20 μL發(fā)酵液原液(或稀釋過的發(fā)酵液)注入1260型高效液相色譜儀(Agilent,美國)進(jìn)行流速為1.0 mL/min的等度洗脫[流動相為乙腈∶水85∶15(體積分?jǐn)?shù))],以RID示差檢測器測定待測樣品溶液的響應(yīng)值(峰面積)。所測得的峰面積代入蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積的線性回歸方程式中,求得發(fā)酵液中的蔗糖含量。

    1.3.9多糖飲料配方正交試驗設(shè)計

    以發(fā)酵液用量(A)、蔗糖添加量(B)、檸檬酸添加量(C)為因素,以飲料的感官風(fēng)味為指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗設(shè)計。因素水平表如表2所示。

    表2 L9(34)正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

    1.3.10感官評定標(biāo)準(zhǔn)

    由20人組成的感官評定小組按表3所示標(biāo)準(zhǔn)對多糖飲料進(jìn)行感官評定。

    表3多糖飲料感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Evaluation standards of polysaccharide drink

    2結(jié)果與討論

    2.1 L. mesenteroides BD1710優(yōu)選番茄汁蔗糖發(fā)酵液配方的選擇

    將L. mesenteroides BD1710接種于不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中,180 r/min、28℃搖床恒溫培養(yǎng)48 h,發(fā)酵終點處各發(fā)酵液中右旋糖苷含量、殘余蔗糖含量與酸度如圖1所示。

    圖1蔗糖濃度對右旋糖苷含量、發(fā)酵液殘余蔗糖含量以及酸度的影響Fig.1 Effect of sucrose concentration on acidity,content of dextran and residual-sucrose of culture

    從右旋糖苷含量來看,發(fā)酵終點處(48 h),蔗糖濃度為5 %的發(fā)酵液中右旋糖苷含量最低,僅為19 g/L,而右旋糖苷含量最高(32.15 g/L)的發(fā)酵液中蔗糖濃度為15 %,蔗糖濃度為10 %和20 %的發(fā)酵液中右旋糖苷含量分別為28.8 g/L和29.44 g/L。蔗糖濃度與右旋糖苷產(chǎn)量正相關(guān)的現(xiàn)象表明蔗糖是L. mesenteroides BD1710右旋糖苷合成的關(guān)鍵性原料,這與目前關(guān)于L. mesenteroides合成多糖的報道是一致的,這些研究發(fā)現(xiàn),結(jié)合在L. mesenteroides菌體細(xì)胞壁上的右旋糖苷蔗糖酶(Dextransucrase)可將蔗糖水解,并依靠葡萄糖殘基在主鏈上的聚合延長作用來合成右旋糖苷[15]。

    同時,隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的不斷提高(5 %→15 %),發(fā)酵液酸度及其殘余蔗糖含量均有相應(yīng)的增加,為63°T→95°T,6 g/L→41.1 g/L。而當(dāng)蔗糖濃度為20 %時,酸度不再大幅度增加(96°T),而殘余蔗糖含量顯著增加70.8 g/L,這說明L. mesenteroides BD1710 在15 %的蔗糖培養(yǎng)基中生長產(chǎn)酸能力達(dá)到了極限,而更高的蔗糖濃度雖然對酸度沒有過多的影響,但是由于滲透壓過高的原因影響細(xì)胞合成多糖的性能,使其多糖產(chǎn)量反而低于15 %的培養(yǎng)基,同時導(dǎo)致發(fā)酵液中大量蔗糖的殘余。

    綜上所述,在蔗糖濃度為15 %(g/mL)的培養(yǎng)基中L. mesenteroides BD1710的產(chǎn)糖、產(chǎn)酸效果最佳,因此是制備發(fā)酵飲料的優(yōu)選培養(yǎng)基。

    2.2發(fā)酵飲料配方正交試驗結(jié)果

    以發(fā)酵液用量(A)、蔗糖添加量(B)、檸檬酸添加量(C)為因素進(jìn)行L9(34)正交試驗,以確定最佳的原輔料配比方案,結(jié)果見表4。

    由表4的R值可知,各因素對L. mesenteroides BD1710多糖飲料影響的主次順序為:A>C>B,即多糖發(fā)酵液的用量對飲料品質(zhì)的影響最大,影響較大的是檸檬酸的添加量,而蔗糖添加量影響最小。從k值可知,最佳因素水平組合為A2B2C3,即最佳配方為發(fā)酵液用量30 %(體積分?jǐn)?shù))、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。正交試驗最高評分93分一組試驗配方與最佳配方一致??沈炞CA2B2C3為最佳配方組合。

    表4 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 4 Results of L9(34)orthogonal test

    發(fā)酵液的用量是飲料品質(zhì)高低的關(guān)鍵因素,由于明串珠菌多糖在溶液體系中本身具有穩(wěn)定劑的作用[16],因此,當(dāng)發(fā)酵液用量過低時,會直接影響成品在貨架期的穩(wěn)定性,其次,成品的色澤略淺,特殊的番茄汁風(fēng)味與口感不明顯。而發(fā)酵液用量過高時,飲料顏色略顯渾濁,流動性差。

    蔗糖添加量的高低會影響飲料的甜度,其添加量過低時,則無法掩蓋發(fā)酵液中菌株代謝所產(chǎn)生的苦澀味物質(zhì),給人以不愉快的感覺,而過高時,會因過甜而掩蓋了番茄的特有風(fēng)味。

    檸檬酸添加量同樣會對飲料的口感產(chǎn)生影響,適量的添加檸檬酸,會令制成的飲料口感清新、爽口,但若檸檬酸的添加量過高,制成的飲料口感因過酸而破壞了特有的番茄風(fēng)味。

    2.3 L. mesenteroides BD1710發(fā)酵飲料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

    2.3.1感官指標(biāo)

    色澤:透明、淺澄黃色;酸甜比:適宜;風(fēng)味:具有獨特的番茄風(fēng)味;口感:柔和、清爽;組織狀態(tài):均勻無雜質(zhì),穩(wěn)定且久置無分層和沉淀現(xiàn)象。

    2.3.2理化指標(biāo)

    右旋糖苷含量:1.0%蔗糖含量:6.5%;檸檬酸濃度:0.2 %。

    2.3.3微生物指標(biāo)

    菌落總數(shù)≤100 CFU/mL;大腸菌群≤5MPN/100mL;霉菌≤30 MPN/100 mL,致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等)不得檢出。

    3 討論

    隨著經(jīng)濟的飛速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高,消費者在要求飲料美味可口、營養(yǎng)豐富的同時,更希望它們具有一定的益生功能來促進(jìn)人體健康和提高生活質(zhì)量,其中功能性多糖飲料因其免疫調(diào)節(jié)作用的多樣化(抗炎護肝[17]、促體液免疫與細(xì)胞免疫[18]、改善2型糖尿病[19]等)而受到消費者越來越多的追捧。

    植物與真菌來源的多糖應(yīng)用相對單一,只能通過熱水浸提法、水提醇沉法[20]、稀酸稀堿提取法[21]、酶法[4]等提取獲得后,再勾兌制成多糖飲料,而細(xì)菌多糖的應(yīng)用顯得更靈活多變,既可通過離心、醇沉等簡易分離手段從產(chǎn)糖發(fā)酵液中方便獲得多糖后再深加工成相應(yīng)飲料,亦可直接保留于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)揮其特定的益生功效與加工性能;其次,鑒于微生物合成代謝的高效性以及所需培養(yǎng)基的廣泛性,獲得細(xì)菌多糖的時間和物料成本均遠(yuǎn)低于其他來源的多糖。盡管細(xì)菌性多糖優(yōu)點眾多,但目前應(yīng)用于飲料的細(xì)菌性多糖種類較少(大多為乳酸菌),加之較低的胞外多糖產(chǎn)率,如嗜熱鏈球菌(230 mg/L~270 mg/L),保加利亞乳桿菌(58 mg/L~540 mg/L)[22],這些限制性因素成為此類多糖飲料大規(guī)模生產(chǎn)的最大瓶頸。

    盡管L. mesenteroides是最早應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)多糖的乳酸菌之一,但其現(xiàn)有的多糖發(fā)酵技術(shù)大多依賴于化學(xué)合成培養(yǎng)基,并且應(yīng)用手段也與植物與真菌多糖相似,同為先提取后添加,鮮有利用多糖發(fā)酵液直接勾兌制備飲料的報道。研究表明,番茄汁對保加利亞乳桿菌[23]、嗜酸乳桿菌[24]以及植物乳桿菌[25]等乳酸菌具有普遍的促生長作用,但鮮見有過L. mesenteroides在番茄汁中發(fā)酵產(chǎn)糖的相關(guān)報道。本文在前期L. mesenteroides BD1710在番茄汁蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)右旋糖苷的研究基礎(chǔ)上,首先,比較了BD1710代謝不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基后,其發(fā)酵液的酸度、右旋糖苷及殘余蔗糖的含量,確定了適于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)選培養(yǎng)基配方,并探討了發(fā)酵液用量、蔗糖和檸檬酸的添加量對多糖飲料感官效果的影響,明確了發(fā)酵飲料的最佳工藝配方為:發(fā)酵液用量30 %(體積分?jǐn)?shù))、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。在此條件下制備獲得的飲料為淺澄黃色的透明液體,酸甜比適宜,口感柔和、清爽,具有獨特的番茄風(fēng)味,組織狀態(tài)穩(wěn)定、久置無分層和沉淀現(xiàn)象。該飲料中右旋糖苷含量達(dá)1.0%、蔗糖含量為6.5%、檸檬酸濃度為0.2 %。

    以L. mesenteroides發(fā)酵番茄汁蔗糖培養(yǎng)基所獲得的發(fā)酵液,經(jīng)勾兌來制備的發(fā)酵飲料的方法,為以往先提取多糖后添加勾兌的繁復(fù)飲料制備工藝提供了新思路,同時為乳酸菌多糖發(fā)酵果蔬汁在飲料制備方面的應(yīng)用開創(chuàng)了新途徑,因此,可作為一種以天然果蔬汁為發(fā)酵基料大規(guī)模制備乳酸菌多糖飲料的新方法。

    4 結(jié)論

    1)L. mesenteroides BD1710在接種量2.0 %(體積分?jǐn)?shù))、初始pH 7.0、番茄汁濃度100 %(體積分?jǐn)?shù))、蔗糖濃度15 %、發(fā)酵溫度28℃的條件下,其代謝番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的48 h發(fā)酵液中右旋糖苷含量為3.215 %、酸度95°T、蔗糖濃度4.11 %,此發(fā)酵液為用于制備發(fā)酵飲料的優(yōu)選勾兌基料。

    2)L. mesenteroides BD1710番茄汁發(fā)酵飲料的最佳配方為:48 h發(fā)酵液用量30 %(體積分?jǐn)?shù))、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。

    3)最佳配方制備的L. mesenteroides BD1710番茄汁發(fā)酵飲料為淺澄黃色的透明液體,酸甜比適宜,口感柔和、清爽,具有獨特的番茄風(fēng)味,組織狀態(tài)穩(wěn)定、久置無分層和沉淀現(xiàn)象。其中右旋糖苷含量達(dá)1.0 %、蔗糖含量為6.5 %、檸檬酸濃度為0.2 %,并且微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

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    Preparation of Fermented Tomato Juice Beverage Rich in Dextran

    HAN Jin1,WU Zheng-jun2,YOU Chun-ping3,GAO Cai-xia3
    (1. State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Shanghai 200436,China;2. Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Shanghai 200436,China;3. Dairy Research Institute,Bright Dairy & Foods Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China)

    Abstract:Leuconostoc mesenteroides BD1710 is capable of synthesis tising dextran by fermenting tomato juice-sucrose medium,and the culture could be used as primary raw material to produce such beverage rich in dextran. According to the orthogonal test results,the optimal processing parameters were as follow:fermentation 30 %(volume fraction)、sucrose 6 % and citric acid 0.2 %. Dextran content in the best formula beverage was above 1.0 %.

    Key words:Leuconostoc mesenteroides BD1710;dextran;tomato juice-sucrose medium

    收稿日期:2014-06-26

    DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.016

    作者簡介:韓瑨(1980—),男(漢),工程師,碩士,研究方向:乳品科學(xué)。

    基金項目:“十二五”國家科技支撐計劃課題“發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開發(fā)”(2013BAD18B01);“十二五”國家863項目“優(yōu)良益生菌高效篩選與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)”(2011AA100901)

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