魚皮低聚肽氨基酸組成及抗氧化活性研究

王寧麗，徐月敏，劉毅，劉永峰，張振興，邸多隆，劉曄瑋（1.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所，甘肅蘭州730000；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅蘭州730000；3.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心，山東青島266100）

?

魚皮低聚肽氨基酸組成及抗氧化活性研究

王寧麗1，2，徐月敏1，2，劉毅2，3，劉永峰2，3，張振興2，3，邸多隆2，3，劉曄瑋1，*
（1.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所，甘肅蘭州730000；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅蘭州730000；3.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心，山東青島266100）

摘要：以還原型谷胱甘肽和抗壞血酸為對照，采用DPPH·法和鄰二氮菲-Fe2+氧化法分別測定魚皮低聚肽清除DPPH·和·OH活性能力；并利用GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》方法測定魚皮低聚肽的氨基酸組成，進(jìn)行營養(yǎng)價值評價及抗氧化能力與氨基酸組成關(guān)系的初步分析。結(jié)果表明，在優(yōu)選的反應(yīng)體系中，魚皮低聚肽、谷胱甘肽和抗壞血酸對·OH的IC50值分別為2.482、0.357、0.100 mg/mL；對DPPH·的IC50值分別為0.635、0.030、0.003 mg/mL；魚皮低聚肽必需氨基酸含量為24.43 %，EAA/TAA值為24.19 %，EAA/NEAA值為32 %，CS均大于100，EAAI為352；含硫氨基酸含量為3.8 %，除蛋氨酸外的疏水性氨基酸占氨基酸總量的26.7 %，具有抗氧化活性的氨基酸總量為30.5 %，與魚皮低聚肽的抗氧化活性一致。

關(guān)鍵詞：魚皮低聚肽；抗氧化活性；含硫氨基酸；疏水性氨基酸

肽類的抗氧化活性強(qiáng)弱與分子量大小及氨基酸組成有一定的相關(guān)性[1]。研究表明，亮氨酸、纈氨酸、色氨酸、丙氨酸、脯氨酸等對清除自由基具有較好的效果[2-3]；除了這些疏水性氨基酸，含硫氨基酸甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸也具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其發(fā)揮作用的機(jī)理主要是蛋白質(zhì)中甲硫氨酸殘基的氧化還原作用和含硫氨基酸的代謝產(chǎn)物谷胱甘肽（GSH）的抗氧化作用[4]。劉淇等研究表明，鱈魚皮膠原蛋白肽對DPPH·和·OH的清除率隨著樣品溶液濃度的增大而升高[5]；劉成梅等研究結(jié)果顯示，添加羅非魚魚皮多肽對油脂具有良好的抗氧化作用[6]。目前，有關(guān)魚皮肽的抗氧化活性雖有相關(guān)研究，但對于魚皮低聚肽的抗氧化活性、氨基酸組成分析以及抗氧化活性與氨基酸組成關(guān)系的研究較少。

本文利用實驗室按工業(yè)化生產(chǎn)條件自制的魚皮低聚肽，測定清除·OH和DPPH·活性的能力及其氨基酸組成，并對魚皮低聚肽抗氧化活性與氨基酸組成的關(guān)系進(jìn)行初步分析，旨在為魚皮低聚肽作為功能性抗氧化劑的生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1儀器、試劑與材料

1.1儀器

BT224S分析天平：Sartorius公司；T6新世紀(jì)紫外-紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；HWS26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；PB-10 pH計：Sartorius公司；RART NO.835-0200氨基酸自動分析儀：Hitachi，日本；ZFD-5090電熱恒溫干燥箱：上海至誠分析儀器制造廠。

1.2試劑

還原型谷胱甘肽對照品（純度≥99.9 %，批號：M3139）：購自MP Biomedicals公司，美國；抗壞血酸對照品（純度≥99 %，批號：W13D01XL）：購自Fluka公司，美國；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH·）（批號：STBB0829V）：購自Sigma-Aldrich公司，美國；水為實驗室自制雙蒸水；濃鹽酸、苯酚、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、茚三酮、乙酸鋰、氫氧化鋰、二甲基亞砜、冰乙酸等：均為分析純；高純氮氣：純度99.99 %。

1.3材料

魚皮低聚肽（中科院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室提供）：類白色粉末，系新鮮魚皮經(jīng)前處理、酶解、分離、脫色所得，經(jīng)HPLC測定，其中90 %以上內(nèi)容物分子量小于1 000 Da。

2　方法

2.1魚皮低聚肽清除·OH能力測定

按照文獻(xiàn)[7]同樣方法進(jìn)行待測溶液制備、魚皮低聚肽清除羥基自由基能力的測定，具體步驟如下。

2.1.1待測溶液制備

按照表1所示制備待測溶液，分別得到損傷溶液、空白溶液和系列濃度的樣品溶液。

表1清除·OH待測溶液制備Table 1 Preparation of the test solution for scavenging·OH

2.1.2魚皮低聚肽清除羥基自由基的測定

按照表1所示配制的各待測溶液，在37℃保溫1 h后，在510 nm處測定吸光度，分別得到損傷溶液的吸光度A損傷、樣品溶液的吸光度A樣品和空白溶液的吸光度A空白，利用下式計算其對·OH的清除率：

2.1.3半數(shù)抑制率（IC50）的計算

不同濃度的樣品對自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，計算IC50值，IC50值定義為清除率為50 %時所需抗氧化劑的濃度。

2.2魚皮低聚肽清除DPPH·能力測定

按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行待測溶液制備、魚皮低聚肽清除DPPH·能力的測定，具體步驟如下。

2.2.1待測溶液制備

按照表2所示制備待測溶液，分別得到空白溶液和系列濃度的樣品溶液。

表2清除DPPH待測溶液制備Table 2 Preparation of the test solution for scavenging DPPH

2.2.2魚皮低聚肽清除DPPH·的測定

按照表2所示配制的各待測溶液，室溫反應(yīng)30min后，在517 nm處測定吸光度，分別得到樣品溶液的吸光度A樣品和空白溶液的吸光度A空白，利用下式計算其對羥基自由基DPPH·的清除率：

2.2.3半數(shù)抑制率（IC50）的計算

不同濃度的樣品對自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，計算IC50值，IC50值定義為清除率為50 %時所需抗氧化劑的濃度。

2.3統(tǒng)計學(xué)分析

魚皮低聚肽清除·OH和DPPH·能力測定的所有試驗至少重復(fù)3次，并采用SPSS13.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以P＜0.05判斷為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4魚皮低聚肽的氨基酸成分分析

2.4.1溶液的配制

試驗中所用溶液均按照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》[9]方法配制。

2.4.2氨基酸含量測定

用氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定[9]。

2.4.3必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算

必需氨基酸（EAA）含量與氨基酸總量（TAA）之比（E/T），必需氨基酸與非必需氨基酸（NEAA）之比（E/ N）按下式計算：

2.4.4氨基酸評價指標(biāo)的計算

根據(jù)FAO/WHO/UNU 1985年推薦的氨基酸評分模式[10]，按下式計算魚皮低聚肽中必需氨基酸評分（AAS）及化學(xué)評分（CS）：

氨基酸評分（AAS）= 1 g受試蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸的毫克數(shù)/FAO/WHO需要量模式中相應(yīng)必需氨基酸的毫克數(shù)

根據(jù)Oser[11]提出的必需氨基酸指數(shù)計算方法，按下式計算魚皮低聚肽的必需氨基酸指數(shù)（EAAI）：

必需氨基酸指數(shù)（EAAI）=

式中：n為比較的氨基酸數(shù)，本試驗中n=8；t為試驗蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸含量；s為雞蛋蛋白質(zhì)相同必需氨基酸含量。

3結(jié)果與分析

3.1魚皮低聚肽清除·OH能力測定結(jié)果

以濃度對清除率作圖，結(jié)果見圖1。

圖1清除·OH能力測定結(jié)果Fig.1 Specific measurements for scavenging·OH

由圖1可知：魚皮低聚肽、谷胱甘肽和抗壞血酸對·OH均有一定的清除作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.482、0.357、0.100 mg/mL。

3.2魚皮低聚肽清除DPPH·能力測定結(jié)果

以濃度對清除率作圖，結(jié)果見圖2。

圖2清除DPPH·能力測定結(jié)果Fig.2 Specific measurements for scavenging DPPH·

由圖2可知：魚皮低聚肽、谷胱甘肽和抗壞血酸對DPPH·均有一定的清除作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.635、0.030、0.003mg/mL。

3.3魚皮低聚肽的氨基酸成分分析結(jié)果

3.3.1魚皮低聚肽氨基酸含量測定及必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

魚皮低聚肽氨基酸含量測定及必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見表3。

表3魚皮低聚肽氨基酸含量Table 3 The amino acid content in oligopeptides from fish skin%

如表3所示，魚皮低聚肽中必需氨基酸含量為24.43 %，EAA/TAA值為24.19 %，NEAA/TAA值為75.81 %，EAA/NEAA值為32 %。

3.3.2魚皮低聚肽氨基酸評價指標(biāo)

粗蛋白為基數(shù)與以全氨基酸為基數(shù)均可計算化學(xué)評析法中的各評價指標(biāo)，本研究選用以粗蛋白為基數(shù)計算以下氨基酸評價指標(biāo)，結(jié)果見表4。

表4魚皮低聚肽氨基酸評價指標(biāo)Table 4 Comparison of AAS，CS and EAAI in the oligopeptides from fish skin

由表4中AAS值可知，魚皮低聚肽的第一限制性氨基酸為色氨酸，除色氨酸外其他必需氨基酸含量都高于WHO/FAO推薦值，均能滿足人體需要。魚皮低聚肽的CS均大于100，EAAI為352。

3.3.3魚皮低聚肽抗氧化活性氨基酸含量

魚皮低聚肽中總氨基酸含量達(dá)到100 %，含硫氨基酸蛋氨酸占氨基酸總量的3.8 %，除蛋氨酸外的疏水性氨基酸占氨基酸總量的26.7 %。因此，具有抗氧化活性的氨基酸總共占30.5 %。

4　結(jié)論

1）魚皮低聚肽清除·OH與DPPH·的IC50值均較低，說明其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2）由AAS、CS和EAAI可知，魚皮低聚肽必需氨基酸總量高、種類齊全，尤其是蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸的含量很高，因此魚皮低聚肽可作為氨基酸的強(qiáng)化劑或高效的功能性食品添加劑。

3）魚皮低聚肽氨基酸含量的測定結(jié)果顯示，魚皮低聚肽中具有抗氧化活性的氨基酸占氨基酸總量的30.5 %，與魚皮低聚肽的抗氧化活性一致。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen H M, Muramoto K, Yamauchi F, et al. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of soybean protein[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1996,44(9):2617-2623

[2] Gimenez B, Aleman A, Montero P, et al. Antioxidant and functional properties of gelatin hydrolysates obtained from skin of sole and squid[J]. Food Chemistry,2009,114(3):976-983

[3] Suetsuna K, Ukeda H, Ochi H. Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein[J]. The Journal of nutritional biochemistry,2000,11(3):128-131

[4]霍湘,王安利,楊建梅.含硫氨基酸的抗氧化作用[J].生物學(xué)通報, 2006,41(4):3-4

[5]劉淇,李慧,趙玲,等.鱈魚皮膠原蛋白肽的功能特性及抗氧化活性[J].食品工業(yè)科技,2012,33(1):135-137

[6]劉成梅,梁漢縈,劉偉.羅非魚魚皮多肽(TSP- I)抗氧化活性的研究[J].食品研究與開發(fā),2007,28(11):148-151

[7]金鳴,蔡亞欣,李金榮.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產(chǎn)生

的羥自由基[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1996,23(6):553-555

[8]卜令娜,張佳,徐月敏,等.油橄欖葉清除自由基活性部位篩選[J].食品工業(yè),2013,34(6):131-133

[9]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003

[10] Joint FAO/WHO/UNU expert consultation on energy and protein requirements. Energy and protein requirements: Report of a joint FAO/WHO/UNU expert consultation[R]. Geneva: World Health Organization,1985

[11] Oser B L. An integrated essential amino acid index for predicting the biological value of proteins[M]. New York: Academic Press, 1959: 281-295

Study on Amino Acid Composition and Antioxidative Activity of Fish Skin Oligopeptides

WANG Ning-li1，2，XU Yue-min1，2，LIU Yi2，3，LIU Yong-feng2，3，ZHANG Zhen-xing2，3，DI Duo-long2，3，LIU Ye-wei1，*
（1. Institute of Nutrition and Food Hygiene，F(xiàn)aculty of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China；2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，Gansu，China；3. Centre of Resource Chemical and New Material，Qingdao 266100，Shandong，China）

Abstract：Under the optimum conditions using glutathione and ascorbic acid as the controls，DPPH·andbook=32,ebook=39phenanthroline-Fe2+oxidation assays were applied to evaluate the capacities for scavenging free radicals of fish skin oligopeptides. Determination of amino acid composition of fish skin oligopeptides put to use the GB/T 5009.124-2003（Determination of amino acids in foods）method. The relationship between antioxidative activity and amino acid composition of fish skin oligopeptides was analyzed，and the nutritional values of those were evaluated. The results showed that the values of half-inhibitory concentration（IC50）of fish skin oligopeptides，glutathione and ascorbic acid for·OH were 2.482，0.357，0.100 mg/mL，respectively，and those for DPPH· were 0.635，0.030 and 0.003 mg/mL，respectively. Essential amino acids contents of fish skin oligopeptides were 24.43 %，EAA/TAA was 24.19 %，EAA/NEAA was 32 %，CS was greater than 100，and EAAI was 352. Sulphur amino acids contents were 3.8 %，hydrophobic amino acids except methionine accounted for 26.7 % of total amino acids，so the total antioxidative activity amino acids were 30.5 % which was consistent with the antioxidative activity of fish skin oligopetides.

Key words：fish skin oligopeptides；antioxidative activity；sulphur amino acids；hydrophobic amino acids

收稿日期：2014-09-29

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.008

*通信作者

作者簡介：王寧麗（1990—），女（漢），在讀碩士生，研究方向：天然產(chǎn)物中功能成分的篩選與評價。

基金項目：青島市民生科技計劃項目（14-2-3-51-nsh）；“西部之光”人才培養(yǎng)計劃