大麥及麥芽酚類提取物的抗氧化活性研究

趙寧，趙珮，何夢飛，田呈瑞，馬婷婷（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062）

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大麥及麥芽酚類提取物的抗氧化活性研究

趙寧，趙珮，何夢飛，田呈瑞*，馬婷婷
（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062）

摘要：為比較大麥發(fā)芽前與發(fā)芽后酚類提取物的抗氧化活性變化。以大麥和麥芽為原料，采用分光光度法分別測定了原料中酚類提取物的總還原力、鐵還原力（FRAP）及對ABTS自由基、DPPH自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、亞硝酸鹽的清除作用，并與人工合成的抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和天然抗氧化劑VC進行對比。結果表明：大麥和麥芽均有一定的抗氧化活性，且麥芽的抗氧化活性普遍高于大麥，部分指標甚至高于陽性對照。通過對大麥及麥芽抗氧化活性的全面評價，為進一步的研究提供了理論。

關鍵詞：大麥；麥芽；酚類提取物；抗氧化活性

大麥是世界上最古老的糧食作物之一，一直以來主要用作啤酒工業(yè)原料和牲畜飼料，極少為人類食用。國內(nèi)，對大麥及麥芽在中藥上的研究較多，據(jù)報道，大麥及麥芽有助消化、抗結腸炎、降血糖降血脂、抗氧化等重要作用[1]。張端莉[2]等人通過對大麥在發(fā)芽過程中營養(yǎng)物質的變化的研究發(fā)現(xiàn)：大麥在發(fā)芽過稱中蛋白質、脂肪和淀粉都顯著降低，而還原糖、部分非必需氨基酸和所有的必需氨基酸（特別是賴氨酸）等都大幅度增加，說明大麥經(jīng)發(fā)芽后，營養(yǎng)成分可能發(fā)生較大的改變。

近幾年，國內(nèi)外學者開始關注大麥及麥芽的抗氧化活性。楊慶明[3]對大麥及麥芽提取物抗氧化活性做了研究，結果表明：大麥和麥芽提取物在體外有顯著清除自由基的作用，大麥提取物較麥芽提取物有更好的清除效果。朱麗麗[4]等對大麥和麥芽中酚類物質與抗氧化力關系的研究發(fā)現(xiàn)，不同大麥和麥芽之間的抗氧化力有顯著差異。劉青[5]等對大麥提取物的體外抗氧化活性進行了研究，結果表明：不同大麥提取物在70 %丙酮、70 %乙醇、70 %甲醇3個體系中均具有較強的抗氧化活性，并且抗氧化能力的大小與提取物中總酚和原花青素的含量高低相一致。但是將大麥和麥芽兩者作為對照，較全面的比較發(fā)芽前和發(fā)芽后抗氧化活性變化的研究還少見報道。本研究以大麥和發(fā)芽60 h的麥芽為原料，采用7種體外抗氧化體系，全面評價大麥及麥芽酚類提取物的抗氧化活性，以期為大麥、大麥芽的開發(fā)利用提供理論參考及技術參數(shù)。

1材料與方法

1.1材料

大麥：甘啤4號，于2013年9月購買于甘肅蘭州。

沒食子酸標準品、碳酸鈉、福林酚試劑：無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、氯仿、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、鄰苯三酚、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水等均為分析純；BHT、抗壞血酸為食品級；西安化學試劑廠。

BS200S-WEl電子分析天平：北京賽多利斯；恒溫水浴鍋；LXJ-II B型高速離心機、RE-5旋轉式蒸發(fā)器：上海安亭；722型可見分光光度計：上海光譜；FW100型高速萬能植物粉碎機；其他均為實驗室常用設備與儀器。

1.2方法

1.2.1大麥的發(fā)芽

發(fā)芽60 h麥芽的制備：挑選飽滿完好的干燥大麥籽粒，除雜后用0.05 %的次氯酸鈉溶液浸泡30 min消毒，去離子水反復沖洗。將其平鋪于墊有紗布的容器中，并蓋上2層紗布，蒸餾水潤濕至紗布不析出水為止。置于16℃的恒溫培養(yǎng)箱中，保持濕潤，浸泡36 h至大部分麥粒出現(xiàn)露白，此部分樣品為浸麥，隔60 h再取樣，于35℃烘箱中低溫烘干，-20℃凍藏，此部分為所制的發(fā)芽60 h麥芽[6]。

1.2.2樣品制備工藝流程

大麥→粉碎→篩分（60目）→按照1∶20（g/mL）的料液比加入體積分數(shù)為70 %的乙醇→超聲輔助提取30 min（二次提?。? 500 r/min離心4 min→旋轉蒸發(fā)，40℃的條件下烘干→得到多酚提取物

麥芽多酚提取流程同大麥。

分別將大麥和麥芽的多酚提取物用蒸餾水配成濃度分別為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的溶液即為待測液；用相同濃度的抗壞血酸和BHT溶液做陽性對照。

1.3不同濃度樣液酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定樣液中的酚含量。取2.0 mL不同濃度待測液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL的福林酚試劑，再加入7.5 %的碳酸鈉2.0 mL，用蒸餾水定容至10 mL搖勻，暗室放置60 min后在765 nm波長條件下測定。

測得的吸光度（A）代入標準曲線（y=0.115x+ 0.004，R2=0.999），求得試樣中總多酚的濃度。

1.4清除DPPH自由基能力的測定

參照Brandwilliams等[7]的方法，并稍作修改，對大麥及麥芽清除DPPH自由基的能力進行測定。先配制0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液。精確吸取1.0 mL的不同濃度多酚樣品溶液（0.25 mg/mL~4.0 mg/mL）和3.0 mL新配制的DPPH溶液于試管中混勻，避光反應30 min 于517 nm處測定其吸光度。空白對照用等體積的蒸餾水代替多酚樣品液測定乙醇溶液中未反應之前DPPH的吸光度。用與樣品溶液同濃度的抗壞血酸溶液和BHT溶液作為陽性對照。對DPPH自由基的清除能力按公式（1）計算：

式中：I表示對自由基的清除率，%；Ai表示樣品溶液和DPPH溶液混合液的吸光度（1 mL樣品溶液+3 mL 的DPPH溶液）；Aj表示未加DPPH溶液的樣品溶液的吸光度（1 mL樣品溶液+3 mL的乙醇溶液）；A0表示未加樣品時DPPH溶液的吸光度（1 mL乙醇溶液+3 mL 的DPPH溶液）。

1.5 ABTS自由基清除能力的測定[8]

將ABTS溶于水配成濃度為7 mmoL/L的溶液，然后與2.45 mmoL/L的過硫酸鉀溶液等比例混合，在室溫、避光條件下放置16 h~24 h，此溶液即為ABTS自由基陽離子儲備液。取適量的儲備液，在30℃條件下用乙醇稀釋至734 nm處的吸光值為0.7（±0.05）。取ABTS稀釋液1.9 mL與150 μL的不同濃度的樣品液混合，室溫、避光條件下反應6 min，立即測定其在734 nm處的吸光度。自由基的清除率按照公式（2）進行計算：

式中：Ai表示樣品溶液和ABTS溶液混合液的吸光度（150 μL樣品溶液+1.9 mL的ABTS溶液）；Aj表示未加ABTS溶液的樣品溶液的吸光度（150 μL樣品溶液+1.9 mL蒸餾水）；A0表示未加樣品時ABTS溶液的吸光度（150 μL蒸餾水+1.9 mL的ABTS溶液）。

1.6還原能力的測定

參照Vaquero[9]的方法進行測定，具體操作步驟為：取0.5 mL的樣液加入裝有2.5 mL的磷酸緩沖液（0.2 mol/L pH 6.6）的試管中，再加入2.5 mL 1 %的鐵氰化鉀溶液混合均勻。50℃反應20 min后，加入2 mL 10 %的三氯乙酸在3 000 r/min的轉速下離心10 min。取上清液2 mL與2 mL的蒸餾水和0.3 mL 0.1 %的三氯化鐵溶液混合。反應10 min后，在700 nm處測其吸光度。測得的吸光值越高表示樣液的還原能力越強。

1.7鐵還原力（FRAP）的測定

參照XU[10]等的方法，稍作修改測定大麥及麥芽酚提取液的鐵還原能力。吸取0.4 mL不同濃度的樣品提取液，加入2.8 mL蒸餾水和新鮮配制的預熱至37℃的1.8 mL TPTZ工作液，混勻后37℃條件下水浴反應30 min，593 nm處測定吸光度。測得的吸光值越大，表明樣品的鐵還原能力越大。

1.8清除羥基自由基能力的測定[11]

將1.0 mL的樣品溶液與0.6 mL 2 mmol/L的硫酸亞鐵、0.5 mL 10 mmol/L的過氧化氫溶液和0.5 mL 6 mmol/L的水楊酸混合，加入0.5 mL蒸餾水，在37℃的水浴鍋中反應30 min。在510 nm處設置空白對照測其吸光值，按照公式（3）對清除能力進行測定：

式中：SA表示樣液對羥基自由基的清除率，%；A0表示未加樣品混合液的吸光度（0.6 mL的硫酸亞鐵+ 0.5 mL過氧化氫+0.5 mL水楊酸+1.0 mL蒸餾水）；Ai表示樣品的吸光度（0.6 mL的硫酸亞鐵+0.5 mL過氧化氫+0.5 mL水楊酸+1.0 mL的樣品溶液）；Aj表示未加過氧化氫溶液樣品的吸光度（0.6 mL的硫酸亞鐵+ 0.5 mL蒸餾水+0.5 mL水楊酸+1.0 mL的樣品溶液）。1.9清除超氧陰離子自由基能力的測定

通過對Marklund[12]等的方法稍作改動，測定樣液清除超氧陰離子自由基的能力。取3.6 mL Tris-HCL （0.05 mol/L，pH=8.2）的緩沖液，25℃水浴預熱20 min，然后加入1 mL不同濃度的大麥及麥芽酚提取液和0.2 mL鄰苯三酚溶液（0.025 mol/L）混合均勻。將混合液置于25℃水浴反應4 min。加入0.5 mL鹽酸溶液（8 mmol/L）終止反應。設置空白對照于320 nm處測定混合液的吸光值，測定BHT吸光值時，以等量的蒸餾水加BHT調(diào)零測定。以抗壞血酸和BHT作陽性對照。樣品液清除超氧陰離子的能力按公式（4）計算：

式中：I表示清除率，%；A0表示未加樣品混合液的吸光值；Ai表示測試樣品的吸光值；Aj表示不含鄰苯三酚混合液的吸光值。

1.10對亞硝酸鹽清除作用的測定[13]

取不同濃度大麥及麥芽的酚提取液1.0 mL，加入NaNO2標準溶液（5 μg/mL）0.75 mL，檸檬酸－磷酸緩沖溶液（pH＝3.0）1 mL，37℃下反應30 min，立即加入0.5 mL 0.4 %對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3 min~ 5 min后，加入0.25 mL 0.2 %鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min，蒸餾水調(diào)零，在544 nm處測吸光度。按公式（5）計算NO2－的清除率。式中：M表示清除率，%；A0表示未加樣品混合液的吸光值；Ai表示測試樣品的吸光值；Aj表示不含亞硝酸鹽混合液的吸光值。

1.11統(tǒng)計分析

采用EXCEL2007、SPSS等軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2結果與分析

2.1大麥及大麥芽不同濃度樣液酚含量測定

圖1不同濃度原麥、麥芽提取液中的酚含量Fig.1 Different concentrations of barley and malt extract phenol content

2.2清除DPPH自由基的能力

不同質量濃度的樣液和陽性對照清除DPPH自由基的能力如圖2所示。由圖2可以看出，樣液對DPPH自由基有一定的清除作用，隨著樣液質量濃度的增加，清除率隨之增加，在0.25 mg/mL～4 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，清除率的變動范圍為6.8 %～57.61 %。由顯著性分析可知，大麥和麥芽對DPPH自由基的清除能力無顯著性差（P> 0.05），這表明大麥經(jīng)60 h的發(fā)芽，清除DPPH自由基的物質并未顯著增加。

圖2樣品、BHT、VC對DPPH自由基的清除效果Fig.2 Scavenging effects of sample，BHT and VCon DPPH radical

2.3 ABTS自由基清除能力的測定

不同質量濃度的樣液和陽性對照清除ABTS自由基的能力如圖3所示。由圖3可以看出，大麥和麥芽在試驗濃度范圍內(nèi)（0.25 mg/mL～4 mg/mL），對ABTS自由基的清除效果呈現(xiàn)良好的量效關系。VC和BHT在整個濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)較強的抗氧化能力，清除率均在95 %以上。由顯著性分析可知，濃度為2 mg/mL時，大麥和麥芽對ABTS自由基的清除沒有顯著性差異，大于2 mg/mL后，出現(xiàn)差異，且大麥對ABTS自由基的清除作用超過麥芽，可能在高濃度時，麥芽中酚類物質的溶解度降低[14]。

圖3樣品、BHT、VC對ABTS自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effects of sample，BHT and VCon ABTS radical

2.4還原能力的測定

不同質量濃度的樣液和陽性對照的還原能力測定見圖4。由圖4可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)（0.25 mg/mL～4 mg/mL），樣品的還原能力隨濃度的增加而增強，且麥芽的還原能力始終大于大麥的還原能力，說明在發(fā)芽60 h的過稱中，有一定量的還原性物質生成。同等濃度條件下，與陽性對照相比，各物質還原能力大小順序為：VC>BHT>麥芽>大麥，且在低濃度時，大麥和麥芽的清除能力沒有顯著性差異。

圖4樣品的還原能力Fig.4 Reducing power of sample，BHT and VC

2.5鐵還原力（FRAP）的測定

不同質量濃度的樣液和陽性對照的鐵還原能力測定結果見圖5。

圖5樣品、BHT、VC的鐵還原能力Fig.5 Iron reducing power of sample，BHT and VC

由圖5可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨濃度增加，大麥、麥芽、BHT的鐵還原能力逐漸增強，且還原力與濃度呈現(xiàn)一定的量效關系，VC的鐵還原能力始終大于其他三者，BHT在試驗濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出了較弱的鐵還原力，低于樣品的鐵還原力。由顯著性分析可知，樣液濃度小于1 mg/mL（包括1 mg/mL）時，大麥和麥芽的鐵還原力沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.6清除羥基自由基能力的測定

不同質量濃度的樣液和陽性對照對羥基自由基的清除能力見圖6。

圖6樣品、BHT、VC對羥基自由基的清除能力Fig.6 Scavenging effects of sample，BHT and VCon hydroxyl radical

由圖6不同濃度的樣品、BHT、VC對羥基自由基的清除效果可知，各物質均有一定清除羥基自由基的作用，在試驗濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的量效關系。在同等濃度條件下，對羥基自由基清除能力的大小順序為：VC>BHT>麥芽>大麥。在較高濃度條件下，麥芽的對羥基自由基的清除率接近于0，大麥的對其的清除率為負值，說明在較高濃度時，不但不能有效清除羥基自由基，反而能促進它的生成，可能是由于被測物質體系中含有某種物質可以產(chǎn)生羥基自由基，具體機理與原因需要進一步研究[15]。

2.7清除超氧陰離子自由基能力的測定

不同質量濃度的樣液和陽性對照對超氧陰離子自由基的清除能力見圖7。

圖7樣品、BHT、VC對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.7 Scavenging effects of sample，BHT and VCon superoxide free radical

從圖7可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，BHT對超氧陰離子自由基始終有較強的清除能力，基本保持在95 %以上。濃度為0.5 mg/mL時，大麥，麥芽和VC對超氧陰離子的清除能力沒有顯著性差異（P>0.01）。濃度大于0.5 mg/mL后，樣品對自由基的清除能力明顯大于VC，同時可以看出，隨濃度增加，麥芽對超氧陰離子自由基清除能力的增長速度較快，可能麥芽中清除超氧陰離子自由基的物質隨濃度增加會快速溶解。

2.8對亞硝酸鹽清除作用的測定

不同質量濃度的樣液和陽性對照對亞硝酸鹽的清除效果見圖8。

圖8樣品、BHT、VC對亞硝酸鹽的清除效果Fig.8 Scavenging effects of sample，BHT and VCon nitrite

如圖8所示為大麥、麥芽、VC和BHT對亞硝酸鹽的清除作用，由圖可知，試驗濃度范圍內(nèi)，樣品對亞硝酸鹽的清除作用隨濃度增加而增加，呈現(xiàn)一定的量效關系。相同濃度條件下，清除作用的大小順序為：VC> BHT>麥芽>大麥。此外，通過顯著性分析可知，濃度較低時，大麥和麥芽對亞硝酸鹽的清除作用沒有顯著性差異（P>0.01），且兩者的清除率均較小，說明大麥和麥芽中含有清除亞硝酸自由基的物質較少。

3　結論

本文采用7種體外抗氧化體系，對大麥、麥芽的體外抗氧化活性進行了綜合評價與比較。

結果表明：1）樣品對DPPH自由基的清除作用，隨樣品濃度增加而增強，且發(fā)芽前與發(fā)芽60 h后的清除能力沒有顯著性差異。2）對ABTS自由基有較強的清除作用，在試驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關系。3）同等濃度的條件下，還原能力大小順序為：VC>BHT>麥芽>大麥，濃度小于2 mg/mL時，大麥和麥芽的還原能力沒有顯著性差異。4）在鐵還原能力測定中，VC表現(xiàn)出了較強的鐵還原能力，樣液的鐵還原能力大于陽性對照BHT的還原能力，濃度較低時，大麥和麥芽的鐵還原力無差異。5）在試驗濃度范圍內(nèi)，樣品對羥基自由基的清除率較低，明顯低于VC和BHT對羥基自由基的清除，樣液在高濃度時清除率甚至出現(xiàn)了負值。6）在清除超氧陰離子自由基的試驗中，BHT表現(xiàn)出較強的清除作用，始終保持在95 %以上，大麥和麥芽對超氧陰離子的清除作用雖不及BHT，但明顯大于VC的清除作用。7）大麥、麥芽對亞硝酸鹽的清除作用較小，遠遠低于VC、BHT對亞硝酸鹽的清除作用，在試驗濃度范圍內(nèi)，樣品對亞硝酸鹽的清除率在6.30 %～15.97 %范圍內(nèi)。

綜上所述，大麥和麥芽的酚類提取物具有較好的抗氧化活性，且麥芽的抗氧化性能基本大于大麥，部分指標甚至超過陽性對照，為大麥及麥芽產(chǎn)品的進一步開發(fā)提供了理論參考。

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Antioxidant Capacity of Phenolic Extracts from Barley and Malt

ZHAO Ning，ZHAO Pei，HE Meng-fei，TIAN Cheng-rui*，MA Ting-ting
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China）

Abstract：The antioxidant activity of phenolic extracts from barley and malt was studied. The antioxidant activity of the extract was evaluated by spectrophotometry on its ability of scavenging ABTS radical，1 -diphenyl-2-picrylhydrazy（DPPH·），hydroxyl radical（·OH），superoxide anion radical（O2-·），nitrite，and total reducing power，iron reducing power. BHT and VCwere used as positive control. The polyphenol extracts from barley and malt all had a certain antioxidant capacity，and the antioxidant activity of malt was generally higher than barley，some even better than the positive control. Through the comprehensive evaluation of the antioxidant activity of barley and malt，and provided a theoretical basis for the further research.

Key words：barley；malt；phenolic extracts；antioxidant activity

收稿日期：2014-09-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.003

*通信作者：田呈瑞（1955—），男，教授，博士生導師。

作者簡介：趙寧（1990—），女（漢），本科生，研究方向：食品新資源開發(fā)利用。

基金項目：國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201310718016）