家蠶微孢子蟲診斷方法研究進(jìn)展

曹琛福， 林彥星， 呂建強(qiáng)， 花群義

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045)

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家蠶微孢子蟲診斷方法研究進(jìn)展

曹琛福， 林彥星， 呂建強(qiáng)， 花群義

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045)

摘要自家蠶微粒子病被發(fā)現(xiàn)近200a來(lái)，它給世界各養(yǎng)蠶國(guó)家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已被列為蠶種生產(chǎn)的唯一檢疫對(duì)象。為了更好地了解并總結(jié)家蠶微孢子蟲現(xiàn)有的診斷方法及其研究進(jìn)展，該研究主要對(duì)近些年來(lái)在光學(xué)顯微鏡檢測(cè)、電鏡觀察檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)方面的研究進(jìn)行了綜述，并且展望未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，以期對(duì)家蠶微粒子病進(jìn)行更快速、準(zhǔn)確的診斷與防治。

關(guān)鍵詞家蠶微孢子蟲；診斷；方法

家蠶微粒子病是由微孢子蟲(Microsporidia)寄生而引起的一類蠶的傳染性原蟲病。微孢子蟲是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的真核生物，廣泛寄生于昆蟲等無(wú)脊椎動(dòng)物及哺乳類、鳥類、魚類等脊椎動(dòng)物體內(nèi)，至今已被發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲達(dá)150屬、1 200種以上[1]。家蠶微孢子蟲(Noesmabombycis)屬于真菌界微孢子蟲門微孢子蟲綱微孢子蟲目。1857年Nageli首次從病蠶中鑒定出家蠶微孢子蟲[2]，由于它既可以食下傳染又可以胚胎傳染，對(duì)蠶業(yè)養(yǎng)殖造成致命的損害。1845年，法國(guó)Vaucluse洲首次暴發(fā)家蠶微粒子病，隨后迅速蔓延到歐洲其他蠶區(qū)，給19世紀(jì)的歐洲養(yǎng)蠶業(yè)帶來(lái)毀滅性打擊，后來(lái)微粒子病又傳播到日本和中國(guó)等亞洲國(guó)家，給這些國(guó)家的養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界各養(yǎng)蠶國(guó)家和地區(qū)都將其列為蠶種生產(chǎn)的唯一檢疫對(duì)象，也成為蠶業(yè)界研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

1986年我國(guó)農(nóng)牧漁業(yè)部動(dòng)物檢疫所將家蠶微粒子病列入《動(dòng)物檢疫》目錄，之后相繼發(fā)布農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《桑蠶一代雜交種檢驗(yàn)規(guī)程》(NY/T327-1997)、《桑蠶原種檢驗(yàn)規(guī)程》(GB19178-2003) 和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《桑蠶原種》(GB19179-2003)，2014年又發(fā)布出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《家蠶微粒子病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 4292-2015)。這些標(biāo)準(zhǔn)對(duì)家蠶微粒子病的檢驗(yàn)檢疫進(jìn)行了規(guī)范。筆者對(duì)家蠶微粒子病病原的主要檢測(cè)技術(shù)、診斷方法和最新的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1光學(xué)顯微鏡檢測(cè)家蠶微孢子蟲

自Louis Pasteur創(chuàng)立母蛾鏡檢法100多年以來(lái)，在蠶業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中一直沿用普通光學(xué)顯微鏡鏡檢法(母蛾鏡檢法)來(lái)診斷家蠶微孢子蟲，但其存在很多不足。首先，該方法只能以中間產(chǎn)品母蛾作為檢驗(yàn)對(duì)象；其次，該方法需依賴有經(jīng)驗(yàn)人員實(shí)施檢驗(yàn)，易與母蛾樣本中的綠僵孢子、曲霉孢子、花粉粒等混淆。在實(shí)施鏡檢時(shí)，常用的染色方法有姬姆氏染色、革蘭氏染色。在此基礎(chǔ)上，研究人員采用多種特殊染色法來(lái)鑒定微孢子蟲。唐順明等[3]應(yīng)用高錳酸鉀-甲基紫法將家蠶微孢子蟲染成紫色，而綠僵孢子、曲霉孢子則呈紫褐色，花粉粒呈淡黃色塊狀，從而能快速地鑒別家蠶微孢子蟲和其他干擾物。Ignatius等[4]采用抗酸的三色染色法將微孢子蟲染成粉紅色，從而將真菌、細(xì)菌及糞樣區(qū)別開來(lái)。牛安歐等[5]采用韋伯氏Chromotrop染色法將比氏腸微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、海倫腦炎微孢子蟲及兔腦炎微孢子蟲等染成紅色，而細(xì)菌和糞渣等染成綠色。劉吉平等[6]用Calcofluor M2R染色法染色后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)家蠶微孢子蟲發(fā)出強(qiáng)烈的青藍(lán)色熒光，病毒多角體和細(xì)菌不被染色，真菌孢子染色后的熒光相對(duì)較弱，可有效地對(duì)形狀相似物進(jìn)行鑒別。采用多種染色法鏡檢，可提高檢測(cè)的敏感性。雖然采用這些方法可以很好地與其他孢子及雜物相區(qū)分，但染色法不能鑒別孢子蟲的具體種屬[7]，對(duì)微孢子蟲種屬特異性的鑒別仍需借助電子顯微鏡、現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)的技術(shù)和手段[8]。

2電子顯微鏡檢測(cè)家蠶微孢子蟲

成熟微孢子蟲主要由孢子壁(Sporewall)、孢原質(zhì)(Sporoplasm)、發(fā)芽裝置(Extrusion apparatus)和孢子細(xì)胞器(Organelle)等組成[9]。孢子壁厚而堅(jiān)硬，由3層結(jié)構(gòu)組成，由外入內(nèi)依次為刺突狀外層孢子外壁(Exospore)、透明薄層孢子內(nèi)壁(Endospore)和纖維性內(nèi)層的原生質(zhì)膜(Plasmamembrane)[10-11]。孢子外壁由致密的淀粉纖維狀的蛋白質(zhì)基質(zhì)組成；孢子內(nèi)壁由殼多糖和蛋白質(zhì)組成，厚而均一，分別與孢子外壁和孢原質(zhì)膜相連；原生質(zhì)膜則將孢子壁與內(nèi)部的孢原質(zhì)隔開。孢原質(zhì)的前部是由平滑的薄膜層疊成的極膜層，孢原質(zhì)的后部有沿孢子短軸方向稍伸長(zhǎng)的孢子。發(fā)芽裝置主要由孢子壁內(nèi)側(cè)螺旋狀盤繞的極管、若干疊成片狀的薄膜層、結(jié)構(gòu)相對(duì)松散的極膜層和由多層膜包圍成的后極泡構(gòu)成，極膜層可分為緊密和疏松兩個(gè)形態(tài)不同的前后部分。孢子細(xì)胞器主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplastic reticulum)、極膜層結(jié)構(gòu)(Polaroplast)、高爾基體(Golgiosome)和高度簡(jiǎn)化的線體(Mitosome)等組成[12]。家蠶微孢子蟲的成熟孢子大小為(3.6~3.8)μm×(2.0~2.3)μm，呈卵圓形，表面光滑且折光性較強(qiáng)。家蠶微孢子蟲的極管前端與孢子縱軸呈平行狀，后端沿孢子壁與縱軸形成螺旋狀卷曲。它在感染的過(guò)程中存在2種形態(tài)的感染體即長(zhǎng)極絲孢子和短極絲孢子，其中長(zhǎng)極絲孢子的極管圈數(shù)一般為12~14圈，13圈居多，極絲傾斜角一般為52°[13]。

3免疫學(xué)方法檢測(cè)家蠶微孢子蟲

3.1微孢子蟲蛋白質(zhì)組學(xué)采用一維和二維蛋白電泳技術(shù)對(duì)微孢子蟲的蛋白成分、蛋白組成進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)微孢子蟲進(jìn)行識(shí)別、分類和鑒定。1982年Streett等[14]利用SDS-PAGE技術(shù)區(qū)分家蠶微孢子蟲和變形微孢子蟲。1989年梅玲玲等[15]從蛋白質(zhì)氨基酸組成上發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲和桑尺蠖來(lái)源的微孢子蟲基本相同。1999年高永珍[16]通過(guò)電泳圖譜發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲的谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸含量要比其他微孢子蟲高。2004年黃少康等[17]利用雙向電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲和內(nèi)網(wǎng)蟲屬樣微孢子蟲的蛋白點(diǎn)差異明顯。黨曉群等[18]利用質(zhì)譜技術(shù)及序列分析發(fā)現(xiàn)微孢子蟲的亮氨酰氨肽酶和絲氨酸蛋白酶在兔腦炎微孢子蟲、蝗蟲微孢子蟲、蜜蜂微孢子蟲、腸道微孢子蟲和比氏腸道微孢子蟲中的相似度較高，其進(jìn)化較保守。

微孢子蟲孢壁蛋白的成分和特性可被應(yīng)用于微孢子蟲的分類和檢測(cè)上。趙唯希[19]鑒定了家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP5、SWP8、SWP12、SWP26、SWP30、EOB14207.1，認(rèn)為它們可能成為微孢子蟲檢測(cè)和抗微孢子蟲藥物設(shè)計(jì)的新靶標(biāo)。河原煙勇等[20]比較了8種微孢子蟲的表面蛋白，證實(shí)它們可以作為微孢子蟲的分類依據(jù)，其中包括熱休克蛋白。Peyretaillade等[21]也獲得小孢子蟲和腦炎微孢子蟲的HSP70基因的“同系物”。極絲蛋白主要有PTP1、PTP2、PTP3，與孢子的侵染作用密切相關(guān)，這可能會(huì)給微孢子蟲的診斷和治療帶來(lái)新的發(fā)展空間[22]。高永珍[16]從家蠶微孢子蟲和藍(lán)螢葉甲微孢子蟲中抽提了極絲蛋白進(jìn)行SDS-PAGE的比較，發(fā)現(xiàn)這2種孢子蟲孢子極絲蛋白的電泳圖譜基本相同，都含有多條蛋白帶，并且都有33 kD的主帶。

3.2家蠶微孢子蟲免疫學(xué)檢測(cè)檢測(cè)技術(shù)包括免疫測(cè)定法、間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳和蛋白印跡分析等[23]。郭廣清[24]利用發(fā)芽液制備單克隆抗體來(lái)鑒定家蠶微孢子蟲，還針對(duì)家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32制備單克隆抗體，結(jié)合免疫層析技術(shù)制備膠體金免疫試劑條，其檢測(cè)靈敏度達(dá)8.0×106個(gè)/mL。李艷紅等[25]通過(guò)制備家蠶微孢子蟲總蛋白多克隆抗體，建立免疫熒光檢測(cè)家蠶微孢子蟲的方法(IFA)。該方法具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。萬(wàn)淼[26]建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)家蠶微孢子蟲的方法，對(duì)純化孢子的檢測(cè)最低量為 3.125×105個(gè)/mL，對(duì)“添毒”蠶卵的檢測(cè)最低量為 5.000×106個(gè)/mL。陳祖佩等[27]采用家蠶微粒子蟲致敏碳素凝集法檢測(cè)母蛾微孢子敏感性，發(fā)現(xiàn)它明顯高于顯微鏡檢測(cè)技術(shù)對(duì)家蠶微粒子蟲的檢測(cè)。萬(wàn)嘉群[28]分別采用酶標(biāo)抗體間接法和酶標(biāo)抗體 PAP 法檢測(cè)家蠶微粒子蟲孢子。

4分子生物學(xué)檢測(cè)家蠶微孢子蟲

4.1家蠶微孢子蟲核酸分子雜交診斷技術(shù)韋亞?wèn)|等[29]根據(jù)家蠶微孢子蟲的核糖體RNA基因高度保守的特點(diǎn)，采用原位雜交技術(shù)將標(biāo)記的探針在組織和細(xì)胞水平鑒定目標(biāo)核酸的存在，從而對(duì)家蠶卵和幼蟲體內(nèi)感染的家蠶微孢子蟲進(jìn)行早期診斷。然而，這些方法由于操作復(fù)雜、耗時(shí)和需要較高檔的儀器設(shè)備，很難在生產(chǎn)上大面積推廣和運(yùn)用。邱寶利等[30]利用核酸點(diǎn)雜交和Southern雜交技術(shù)，用1對(duì)家蠶微孢子蟲特異性引物(上游引物：5′-AGTGAATGTAGGAGGAGTAGAAAGAGGC-3′，下游引物：3′-GCGCAACTCATAATGGTTCGTCCTGTTT- 5′)[31]成功地從蠶業(yè)生產(chǎn)中流行的10多種病原性微孢子蟲中鑒定出來(lái)。采用特異性探針與SSU rRNA序列進(jìn)行原位雜交，也檢測(cè)出艾滋病病人感染的拜氏微孢子蟲[32]。

4.2家蠶微孢子蟲普通PCR檢測(cè)方法目前，采用PCR方法檢測(cè)家蠶微孢子蟲時(shí)，主要針對(duì)家蠶微孢子蟲小亞單位核糖體RNS基因來(lái)設(shè)計(jì)特異性引物。陳秀等[33]根據(jù)家蠶微孢子蟲和變形微孢蟲的SSU rRNA 基因序列分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，對(duì)家蠶微孢子和其他家蠶病原性微孢子蟲進(jìn)行 PCR 診斷。劉吉平等[34]根據(jù)家蠶微孢子蟲及其相近種屬微孢子蟲的SSU rRNA 保守區(qū)域設(shè)計(jì)了1對(duì)引物V1F/530R。該引物對(duì)純家蠶微孢子蟲孢子 DNA模板的檢測(cè)敏感度達(dá)到 3×104個(gè)/mL，對(duì)模擬感染家蠶微孢子蟲孢子的蠶蛾 DNA 模板的檢測(cè)敏感度高達(dá) 3×105個(gè)/mL，兩者均達(dá)到或超過(guò)目前生產(chǎn)上使用的顯微鏡檢測(cè)靈敏度。何永強(qiáng)等[35]也利用家蠶微孢子蟲小亞單位核糖體RNA基因鑒別、檢測(cè)家蠶微孢子蟲。Hatakeyama等[36]分別從感染家蠶微粒子病原蟲的蠶卵和家蠶中抽提基因組 DNA作為模板，用多引物 PCR擴(kuò)增特異的 DNA 序列，驗(yàn)證多引物 PCR 可以實(shí)際應(yīng)用于同時(shí)感染幾種能導(dǎo)致家蠶微孢子病的微孢子蟲的早期檢測(cè)，對(duì)蠶卵微粒子病的診斷研究具有實(shí)用價(jià)值。

4.3家蠶微孢子蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在微孢子蟲核酸定量檢測(cè)中也有很多應(yīng)用的實(shí)例[35,37-39]。 何永強(qiáng)等[40]以家蠶微孢子蟲SSU rRNA基因長(zhǎng)度為66 bp的片段作為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，成功構(gòu)建檢測(cè)家蠶微孢子蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，并且研制出診斷家蠶微孢子蟲的試劑盒。Bourgeois等[37]采用熒光定量PCR方法在樣本差異低的情況下對(duì)東方蜂微粒子蟲進(jìn)行檢測(cè)和定量分析。Polley等[38]研發(fā)了一種僅使用SYBR Green實(shí)時(shí)PCR方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)感染多種微孢子蟲的糞便樣品同時(shí)檢測(cè)和種屬鑒定，有17種陽(yáng)性樣品通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)方法分析，其中14種感染比氏腸微孢子蟲、2種感染具褶孢蟲屬孢子蟲、1種感染兔腦炎微孢子蟲。上述分子生物學(xué)方法在靈敏度和特異性方面比傳統(tǒng)的顯微鏡檢法有很大的優(yōu)勢(shì)。

4.4家蠶微孢子蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)技術(shù)LAMP是近年來(lái)建立的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便且成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。燕薇[41]運(yùn)用LAMP法檢測(cè)家蠶微孢子蟲，最低檢測(cè)極限為10個(gè)孢子/mL，可有效區(qū)分感染家蠶的主要致病細(xì)菌(靈菌、蘇云金桿菌)和真菌(白僵菌、綠僵菌、曲霉)。對(duì)感染微粒子病的家蠶進(jìn)行早期診斷時(shí)，應(yīng)用LAMP技術(shù)比常規(guī)的顯微鏡檢查提早24 h左右。

目前，在診斷家蠶微孢子蟲時(shí)，除了選擇家蠶微孢子蟲的蛋白或核酸作為靶標(biāo)，也有學(xué)者嘗試通過(guò)比較感染微孢子蟲的家蠶(卵)與未感染微孢子蟲家蠶(卵)的差異蛋白為檢測(cè)靶標(biāo)。龔娟娟[42]發(fā)現(xiàn)，家蠶低分子量Lip 30 kD蛋白在感染了微孢子蟲的蠶卵中的表達(dá)量比未感染蠶卵中的表達(dá)量高3倍。

5展望

對(duì)家蠶微孢子蟲的診斷方法的研究主要包括光學(xué)鏡檢、電鏡檢查、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等。光學(xué)鏡檢是較古老且經(jīng)典的檢測(cè)方法，但是一般需要在感染晚期才能觀察到，對(duì)防治起不了太大的作用。電鏡檢查必須經(jīng)過(guò)超薄切片、電鏡觀察，對(duì)設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求較高，目前主要用于科研。免疫學(xué)的方法多數(shù)是用家蠶微孢子蟲蛋白進(jìn)行免疫獲取相應(yīng)的多克隆抗體或單克隆抗體，其準(zhǔn)確性較高，靈敏性也好，但由于對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白研究不夠深入，在鑒別各屬微孢子蟲時(shí)較為困難。分子生物學(xué)技術(shù)憑借其特異、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，近年在鑒別家蠶微孢子蟲方面研究比較活躍，但其檢測(cè)也需要在實(shí)驗(yàn)室條件下才能完成。總之，這些方法雖然有各自的優(yōu)點(diǎn)，但都存在一定的缺陷，很難在基層生產(chǎn)上推廣。因此，研究人員需要更多地發(fā)掘家蠶微孢子蟲特異性結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)研制出諸如膠體金試劑條等既快速、簡(jiǎn)便、高效又能夠在基層廣泛使用的檢測(cè)方法，或利用分子生物學(xué)技術(shù)研制適合現(xiàn)場(chǎng)的快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

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Research Progress of Diagnosis ofNoesmabombycis

CAO Chen-fu, LIN Yan-xing, LV Jian-qiang et al (Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Centre, Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen, Guangdong 518045)

AbstractSince the discovery of pebrine disease nearly two hundred years ago, pebrine disease has caused serious damage to the world’s sericulture country.It is the only quarantine object of the silkworm eggs in the sericulture countries and regions.In order to better understand and summarize the diagnostic method ofNoesmabombycisand its research progress, we reviewed the researches on optical microscopic microscopy detection, electron microscope inspection, immunology and molecular biology detection in recent years.The future development was forecasted in order to rapidly and accurately control and diagnose theNoesmabombycis.

Key wordsNoesmabombycis; Diagnosis;Method

收稿日期2015-12-16

作者簡(jiǎn)介曹琛福(1977- )，男，江西南康人，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，從事動(dòng)物及其產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫工作。

基金項(xiàng)目國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2013IK042)。

中圖分類號(hào)S 884.2+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-001-03