鄰二甲苯高效降解菌的分離及其降解特性

陳佩，顏家保，，武文麗，胡茜茜（武漢科技大學化學工程與技術學院，湖北 武漢 43008；武漢科技大學教務處，湖北 武漢 43008）

?

鄰二甲苯高效降解菌的分離及其降解特性

陳佩1，顏家保1，2，武文麗1，胡茜茜1
（1武漢科技大學化學工程與技術學院，湖北 武漢 430081；2武漢科技大學教務處，湖北 武漢 430081）

摘要：以鄰二甲苯作為唯一碳源，從長期受焦化廢水污染的土壤中分離得到一株能降解鄰二甲苯的高效菌株LJ5，經生理生化和16S rDNA鑒定，該菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。菌株LJ5適宜的降解條件為：培養(yǎng)溫度35℃，pH=7.0～8.0，搖床轉速150r/min。菌株LJ5在鄰二甲苯濃度高達2500mg/L時，對其的去除率在30h內可達到73%，它對鄰二甲苯的降解過程符合Monod動力學方程，當鄰二甲苯濃度遠遠大于64.32mg/L時，LJ5降解底物速率最高，達到43.29mg/(L?h)。菌株LJ5能在實際焦化廢水中很好的生長，菌液投加48h后可使COD降解率達到34.74%。

關鍵詞：鄰二甲苯；分離；降解；動力學

第一作者：陳佩（1990—），女，碩士研究生。E-mail 504532896@qq.com。聯(lián)系人：顏家保，教授，博士生導師，主要研究方向為環(huán)境友好化工新技術。E-mail 972787445@qq.com。

焦化廢水含有大量有毒有機物，如酚類、苯系物及吡啶等雜環(huán)化合物[1]。鄰二甲苯是一種典型的苯系物污染物，由于其毒性大和難生物降解的性質使得傳統(tǒng)生物法對其處理效果不佳[2]。任源等[3]研究發(fā)現(xiàn)焦化廢水經生物處理后的出水中仍含有苯類物質，因此，向生物處理系統(tǒng)中投加從自然界中篩選出的高效菌[4]，從而提高對目標污染物的去除率，受到了國內外廣大環(huán)保者的關注。目前，已報道的降解苯系物的微生物有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）等，但其對苯系物的降解速率都較低并且對高濃度的苯系物的耐受性較差[5-7]。

本研究從長期受焦化廢水污染的土壤中篩選得到一株能以鄰二甲苯為唯一碳源的高效降解菌，對該菌進行了生理生化和16S rDNA鑒定，并就其降解和生長特性進行了研究，為對鄰二甲苯的生物強化處理提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

實驗所用菌源取自武漢平煤武鋼聯(lián)合焦化有限責任公司污水處理廠內長期受焦化廢水污染的土壤，呈黑色。

1.2 試劑

鄰二甲苯及正己烷為色譜純標準，均購自國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LB富集培養(yǎng)基：NaCl 1.0g，蛋白胨 1.0g，酵母提取物0.5g，蒸餾水定容至100mL，調節(jié)pH=7.2左右。

鄰二甲苯無機鹽培養(yǎng)基：Na2HPO41.5g，KH2PO41.5g，(NH4)2SO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g， CaCl20.01g，2mL微量元素儲備液，蒸餾水定容至1000mL，pH值約為7.0，120℃、0.1～0.15MPa高壓鍋內滅菌后加入鄰二甲苯作為唯一碳源。

平板培養(yǎng)基：每100mL LB液體培養(yǎng)基中各加入約2g左右瓊脂粉。

1.4 主要儀器

T6-新世紀型紫外可見光分光光度計，北京譜析儀器有限責任公司。

1.5 菌株的篩選

稱取15g土壤加入裝有100mL自來水的錐形瓶中，振蕩24h，靜置后離心，取5mL上清液接種于已滅菌的LB培養(yǎng)基內富集培養(yǎng)24h。取2mL富集的菌液轉接至含有100mg/L鄰二甲苯的無機鹽培養(yǎng)基中于30℃、150r/min下培養(yǎng)，待培養(yǎng)基由澄清變渾濁后取2mL菌液接入底物濃度更高的無機鹽培養(yǎng)基中同條件下培養(yǎng)，以此來馴化鄰二甲苯降解菌，鄰二甲苯的濃度分別為100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、2000mg/L。因為鄰二甲苯難溶于水且易揮發(fā)，本實驗在無機鹽培養(yǎng)基中加入0.7%（體積比）吐溫-80助溶[6]，并用封口膜封住瓶口，保證鄰二甲苯基本不揮發(fā)。將馴化后的菌液采用稀釋涂布平板和平板劃線法分離、純化得到單菌落，然后檢測各菌株對底物的降解率。

1.6 菌種的鑒定

將降解速率最高的一株單菌菌液稀釋涂布到LB平板上，于35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，從菌落的外形、大小、顏色等方面來觀察。生理生化特征實驗參考文獻[8]來進行。提取細菌DNA[9]，16S rDNA PCR擴增，產物回收純化后送至武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進行測序。

1.7 高效菌降解特性

（1）將高效菌接入含有1000mg/L鄰二甲苯的無機鹽培養(yǎng)基中，探究不同溫度、pH值、搖床轉速對其降解能力的影響，找出其適宜的生長條件，研究不同底物濃度時菌株的降解特性，每組實驗均設置對照組。

（2）對菌株降解鄰二甲苯的過程進行動力學研究。

（3）將高效菌按接種量2%分別接入含有250mg/L的苯、甲苯、喹啉、己二酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、吡啶、苯酚和鄰甲酚的無機鹽培養(yǎng)基中，在其適宜的生長條件下培養(yǎng)，間隔一段時間取樣檢測菌密度。

（4）將高效菌加入實際焦化廢水中，考察其對COD的降解情況。錐形瓶中溶液的組成如下：①實驗組，12mL廢水原水+83mL蒸餾水+5mL菌液；②對照組，12mL廢水原水+88mL蒸餾水。將錐形瓶放在35℃、150r/min恒溫搖床中培養(yǎng)，定時取樣檢測COD的濃度。

1.8 分析方法

（1）細菌的菌密度由紫外分光光度計測定培養(yǎng)液在波長600nm處的吸光度值表示；鄰二甲苯含量的測定采用紫外分光光度法。由于鄰二甲苯難溶于水，本實驗均采用正己烷等體積整瓶萃取培養(yǎng)基中剩余的底物，于波長210nm處測定鄰二甲苯含量；COD的測定采用重鉻酸鉀法。

（2）鄰二甲苯降解率的計算如式(1)。

式中，C0為對照組中殘留底物濃度，mg/L；C1為實驗組中殘留底物濃度，mg/L。

2 結果與討論

2.1 高效菌的篩選與鑒定

經過分離純化，得到10株能夠降解鄰二甲苯的菌株，選取其中降解能力最好的一株LJ5來進行后續(xù)研究。菌株LJ5為革蘭氏陰性菌，菌落呈圓形，微凸，表面濕潤光滑。通過菌落形態(tài)和生理生化試驗結果初步推斷菌株LJ5與假單胞菌（Pseudomonas sp.）相似。

對菌株LJ5進行16S rDNA測序后，將測得的基因序列輸入到Blast中在線進行比對，得到分析數(shù)據，其中與菌株LJ5序列相關性達到99%甚至更高的均是假單胞菌，因此可以判斷LJ5在分子生物學上歸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

2.2 高效菌的降解特性

2.2.1 溫度對菌株降解鄰二甲苯的影響

溫度主要通過影響微生物體內酶的活性從而對細菌的生長和降解性能產生一定的促進或抑制作用。溫度過高或過低都會使酶的活性降低，只有適宜的溫度才有利于微生物的生長和代謝。在pH值為7.0、搖床轉速為150r/min的條件下，不同溫度對鄰二甲苯降解率的影響如圖1所示。

圖1 溫度對菌株LJ5降解性能的影響

從圖1中可以看出，在25～35℃之間，隨著溫度升高，鄰二甲苯的降解率增大，在35℃時達到98.75%，而40℃時有所下降。這可能是因為25℃時溫度過低使得微生物體內酶的活性較差，從而降解能力變差；40℃時溫度過高，導致細菌細胞內蛋白質酶的活性降低甚至失活。在24h之前，30℃、35℃和40℃時的降解曲線基本重合，這可能是因為前期營養(yǎng)物質豐富，環(huán)境對其影響不大，隨著時間的延長，底物被消耗，溫度對高效菌的影響開始顯著。因此，菌株LJ5的適宜生長和降解溫度為35℃。2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株降解鄰二甲苯的影響

pH值能夠影響微生物的細胞膜所帶的電荷和改變培養(yǎng)基中有機物的離子化程度，因此是保證微生物能否正常生長和代謝的一個重要因素。在培養(yǎng)溫度為35℃、搖床轉速150r/min的條件下，不同培養(yǎng)基初始pH值對鄰二甲苯降解率的影響如圖2所示。

從圖2可以看出，pH=5.0時，48h后，菌株LJ5對鄰二甲苯的降解率為25.2%，該株菌在酸性條件下很難生長。當pH=7.0～8.0時，30h后其降解率均可達到90%以上，隨著pH值的繼續(xù)增大其降解率又有所下降，表明菌株LJ5對環(huán)境pH值比較敏感，其適宜pH范圍為7.0～8.0，這與焦化廢水生化處理時的水質條件相吻合。經過約48h培養(yǎng)后測定各搖瓶中培養(yǎng)液的終態(tài)pH值，初始pH值為5.0～9.0的錐形瓶中的終態(tài)pH值分別變?yōu)?.14、4.03、5.11、6.18、6.64。結果顯示，搖瓶中的終態(tài)pH值均略有下降，這可能是因為菌株LJ5在生長過程中產生了酚類等顯酸性物質。

2.2.3 搖床轉速對菌株降解鄰二甲苯的影響

搖床轉速影響體系內的溶解氧溶度和微生物與底物的充分接觸，因為本實驗用封口膜封住瓶口，因此主要影響因素應該為后者。在溫度為35℃，培養(yǎng)基初始pH值為7.0的條件下，不同搖床轉速對鄰二甲苯降解率的影響如圖3所示。

圖2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株LJ5降解性能的影響

圖3 搖床轉速對菌株LJ5降解性能的影響

從圖3可以看出，搖床轉速為100r/min時菌株對鄰二甲苯的降解率較低，這可能是因為轉速過低導致菌株與底物不能充分接觸或者反應時間較短。當轉速在150～250r/min時，48h后鄰二甲苯的降解率都達到了90%以上，差別不明顯，結合實際生產中的可行性和成本考慮，選擇菌株LJ5的適宜搖床轉速為150r/min。

2.2.4 菌株LJ5對不同濃度鄰二甲苯的降解特性

在溫度為35℃、培養(yǎng)基初始pH值為7、搖床轉速為150r/min的條件下，將菌株LJ5按接種量2%接入分別含50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L鄰二甲苯的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30h，得到鄰二甲苯降解率結果如圖4所示。由圖4可見，當鄰二甲苯濃度低于200mg/L時，其降解速率隨著鄰二甲苯濃度的提高而增加；鄰二甲苯濃度200mg/L時，降解速率達到99%，在此之前細菌與底物表現(xiàn)為聯(lián)合控制階段；鄰二甲苯濃度高于500mg/L后，降解速率開始下降，但保持在90%以上；當鄰二甲苯濃度增加至1500mg/L之后，其降解率明顯下降，底物的毒性對細菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但其降解率仍然高于70%。段云霞等[10]篩選出的菌株TD3在甲苯濃度高于50mg/L時其降解率開始下降，而LJ5對比其對高濃度苯系物具有更強的耐受性，在處理較高濃度廢水時具有明顯的優(yōu)勢。

圖4 鄰二甲苯濃度對菌株LJ5降解率的影響

2.2.5 菌株LJ5的降解動力學

采用Monod方程[式(2)]對菌株LJ5在鄰二甲苯濃度為1000mg/L時的降解動力學實驗數(shù)據（圖5）進行擬合，并由雙倒數(shù)法作圖得出1/v與1/S的關系（圖6），通過回歸分析得出Monod方程的參數(shù)。

式中，v、vmax為底物的降解速率和最大底物的降解速率，mg/(L?h)；Ks半飽和常數(shù)，mg/L；S為底物濃度，mg/L。

圖5 菌株LJ5的降解曲線

圖6 1/v～1/S關系圖

由圖6得出菌株LJ5降解鄰二甲苯的動力學方程見式(3)。

得Km=64.32mg/L，當S?64.32mg/L時，最大降解速率vmax=43.29mg/(L?h)。霍丹群等[11]篩選的一株甲苯降解菌的最大降解速率僅為0.221mg/(L?h)，高效菌LJ5在降解鄰二甲苯時具有快速的降解速率，對比已查閱文獻中篩選到的苯系物降解菌具有更大的實際意義。

2.2.6 菌株LJ5的降解廣譜性分析

菌株LJ5在含不同底物的無機鹽培養(yǎng)基中生長48h后的菌密度如表1所示，在含有苯、甲苯這類苯系物的無機鹽培養(yǎng)中LJ5生長良好，因為它們與鄰二甲苯有相似的分子結構，LJ5能耐受這類化合物的毒性將其作為唯一碳源，合成自身生長所需的物質；喹啉和吡啶均屬于氮雜環(huán)類化合物，但LJ5僅能在喹啉中生長，這可能是因為喹啉的分子結構中含有一個苯環(huán)，更易于被LJ5利用；己二酸二辛酯和鄰苯二甲酸二丁酯這類增塑劑在生物處理時很難被微生物利用，而LJ5在其中具有一定的生長能力和去除效果；對于苯酚和鄰甲酚這些酚類物質，LJ5則不具有降解能力。由表1可看出，LJ5在處理成分復雜的廢水體系中能同時去除多種有機物，這對降低廢水COD有巨大的潛力。

表1 廣譜性分析

為檢驗菌株LJ5在實際廢水中的降解能力，將菌液投加至稀釋的焦化廢水（COD = 610mg/L）中，48h后COD降為398.11mg/L，降解率達到34.74%，未加入菌液的對照組COD基本沒變。這說明LJ5能很好地適應焦化廢水中種類繁多的有機物的毒性，并能將其中部分有機物降解，這與表1中LJ5的廣譜性相吻合，LJ5具有很大的實際應用價值。

3 結 論

（1）以鄰二甲苯作為唯一碳源，從長期受焦化廢水污染的土壤中分離得到一株鄰二甲苯高效降解菌LJ5，結合菌株菌落形態(tài)、生理生化特征實驗和16S rDNA測序分析，菌株LJ5為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）細菌。

（2）通過單因素實驗得到菌株LJ5的適宜降解條件為：培養(yǎng)溫度35℃，pH=7.0～8.0，搖床轉速150r/min。菌株LJ5在鄰二甲苯濃度高達2500mg/L時，對其的去除率在30h內可達到70%，它對鄰二甲苯的降解符合Monod動力學方程，當鄰二甲苯濃度遠遠大于64.32mg/L時，LJ5降解底物的速率最高，達到43.29mg/(L?h)。

（3）菌株LJ5能在多種有機物中生長，將菌液投加至焦化廢水48h后可使廢水COD從610mg/L降為398.11mg/L，降解率達到34.74%。

參 考 文 獻

[1] 朱強，王祖文，劉建如. 焦化廢水處理技術現(xiàn)狀與研究進展[J]. 有色金屬科學與工程，2011，2（5）：93-94.

[2] INOUE A，HORIKOSHI K．A Pseudomonas thrives in high concentration of toluene[J]. Nature，1989，338：264-266.

[3] 任源，韋朝海，吳超費，等. 焦化廢水水質組成及其環(huán)境學與生物學特性分析[J]. 環(huán)境科學學報，2007，27（7）：1094-1100.

[4] 靳茂霞，劉桂林．提高焦化廢水生化處理的方法[J]. 上海環(huán)境科學，1997，16（2）：13-14，18．

[5] 段傳人，胡江，宋永安. 1株甲苯降解真菌的篩選鑒定及其降解甲苯的特性[J]. 微生物學雜志，2011，31（3）：41-47.

[6] 章劍麗，仵彥卿，張小凡. 苯系化合物降解的微生物篩選及其特性初探[J]. 凈水技術，2010，29（3）：29-33.

[7] 王琳，邵宗澤. 4 株苯系物降解菌菌株的篩選鑒定、降解特性及其降解基因研究[J]. 微生物學報，2006，46（5）：753-757.

[8] 袁麗紅. 微生物學實驗[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2010.

[9] 馮廣達，陳美標，羊宋貞，等. 用于PCR擴增的細菌DNA提取方法比較[J]. 華南農業(yè)大學學報，2013，34（3）：339-442.

[10] 段云霞，唐運平，呂晶華，等. 甲苯降解菌的降解特性及生物強化作用的研究[J]. 環(huán)境污染與防治，2011，33（37）：50-53.

[11] 霍丹群，孫興福，饒佳家，等. 甲苯降解菌的分離、鑒定及其對甲苯的降解特性[J]. 化工環(huán)保，2005，25（5）：337-340.

研究開發(fā)

Separation and biodegradation characteristics of a o-xylene degrading strain

CHEN Pei1，YAN Jiabao1，2，WU Wenli1，HU Xixi1
（1Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China；2Officer of Academic Affairs of Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China）

Abstract：With o-xylene as the sole carbon source，a strain (LJ5) was separated from the soil which was contaminated in the long-term by coking waste water. This strain was identified as Pseudomonas sp. based on its morphology，and 16S rDNA gene sequence. The optimum initial temperature，pH，and shaking speed for B1 utilizing pyridine are 35℃，pH=7.0—8.0 and 150 r/min，respectively. The o-xylene degradation rate was 73% when LJ15 was cultured under o-xylene concentration of 2500mg/L，and the degradation kinetics of o-xylene could be described by the Monod model. When o-xylene concentration was ?64.32mg/L，the degradation rate of strain LJ5 reached an maximum of 43.29mg/(L?h). Strain LJ5 could grow well in the coking waste water which allowed the degradation rate of COD to be 34.74%.

Key words：o-xylene; separation; degradation; kinetics

基金項目：湖北省自然科學基金重點項目（2011CDA054）、武漢科技大學研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點項目（JCX0006）及武漢科技大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201310488009）。

收稿日期：2015-06-30；修改稿日期：2015-07-13。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.02.035

中圖分類號：X 784

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）02–0565–05