撒壩豬成纖維細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性分析

呂春榮，權(quán)國波，吳國權(quán)，洪瓊花

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224)

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撒壩豬成纖維細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性分析

呂春榮1，權(quán)國波1，吳國權(quán)1，洪瓊花*

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224)

摘要：實驗采用撒壩豬耳緣組織塊貼壁培養(yǎng)法首次對撒壩豬成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍保存建立了撒壩豬耳緣成纖維細(xì)胞系；并對其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活率、細(xì)胞核型等生物學(xué)特性進(jìn)行分析；還利用透射電鏡觀察了耳緣組織細(xì)胞。結(jié)果表明：細(xì)胞倍增時間為48 h，生長曲線為 “S” 型；染色體中正常二倍體染色體(2n=38)所占比例為 92.56%；細(xì)菌、真菌、病毒和支原體等微生物污染檢測均顯示為陰性。透射電鏡觀察顯示，成纖維細(xì)胞呈長梭型。

關(guān)鍵詞：撒壩豬；成纖維細(xì)胞系；生物學(xué)特性

資助項目：云高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展(201404)項目

隨著全球生物多樣性及其遺傳資源喪失程度的加劇，使得各國紛紛投入大量人力和財力，并以多種方式收集、保存和整理大自然賦予人類的寶貴財富，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Culture,ECACC)都相繼保存了大量生物資源的培養(yǎng)物。

云南地方物種豐富，撒壩豬是云南省優(yōu)良的地方豬種，耐粗飼、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)好(味好鮮嫩)，為農(nóng)民增收做出了極大的貢獻(xiàn)，是較好的地方品種。作為我省的特色品種，為了更好地保護(hù)和利用撒壩豬遺傳資源，非常有必要開展撒壩豬種質(zhì)資源保存研究。與傳統(tǒng)的活體保存相比，體細(xì)胞保存具有占用場地小、投資少、不受群體和個體生理利用年限制約、可以長期保存種質(zhì)資源等優(yōu)勢。為加強(qiáng)撒壩豬這一獨(dú)特地方品種保護(hù)，本試驗以撒壩豬耳緣組織為材料，體外培養(yǎng)和建立了成纖維細(xì)胞系，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料：撒壩豬來源于楚雄州種豬場，試驗用組織塊來源于2月齡撒壩豬耳緣組織。

1.1.2主要試劑、儀器 ：胎牛血清(FBS)、高糖DMEM由 Gibco 公司生產(chǎn)。胰蛋白酶和青鏈霉素溶液購自Bioind 公司；一次性塑料培養(yǎng)皿為 Nunclon 公司生產(chǎn)。

主要儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、倒置相差顯微鏡(Olympus，Nikon)、透射電鏡(JEM-1011)、實體顯微(Olympus)、細(xì)胞計數(shù)儀等。

1.2方法

1.2.1耳緣組織成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

撒壩豬耳緣組織剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。取耳緣組織樣本0.6 cm×0.6 cm，75 %酒精浸泡2 min，然后用生理鹽水+1 %青鏈霉素溶液洗3 次，放入高糖DMEM+1%青鏈霉素中，放入4 ℃泡沫箱，確保24 h內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行培養(yǎng)。超凈臺上剪刀刮去皮膚表面污物。PBS清洗4次后，用手術(shù)剪和鑷子剪成碎塊，放入直徑為 50 mm 培養(yǎng)皿中，每皿 8 塊左右進(jìn)行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為：高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素。最后放入培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2，飽和濕度)中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察、照相，記錄細(xì)胞遷移和增殖情況。

1.2.2成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶(皿)底壁80%左右時，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶(含0.01%EDTA)37 ℃消化5 min后，倒置相差顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞開始變圓時，加細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，吹打細(xì)胞使其完全脫落，以1∶2或1∶3的比例進(jìn)行傳代。倒置相差顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞生長增殖狀況，并拍照。傳代培養(yǎng)液與原代培養(yǎng)液相同。

1.2.3成纖維細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇

胰酶消化收集細(xì)胞，1 200 r/min 離心5 min，棄上清，用凍存液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1～3×107/ mL 左右，充分混勻，分裝于凍存管中。標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存管編號、性別和凍存日期。-80 ℃冰箱過夜，次日投人液氮罐中長期保存[1]。細(xì)胞凍存液為高糖DMEM + 30% FBS +10%二甲基亞砜(DMSO)。

細(xì)胞復(fù)蘇時將凍存管從液氮中取出，迅速投人42 ℃水浴鍋中 1 min，不停搖動使其受熱均勻。轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。移至培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[2]。倒置顯微鏡下觀察復(fù)蘇細(xì)胞生長狀況，并拍照。

1.2.4耳緣組織透射電鏡觀察

撒壩豬耳緣組織剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。用消毒好的耳號鉗取材后，用鋒利的手術(shù)剪立即剪小并放入裝有3.5%戊二醛的離心管中固定，放入4 ℃泡沫箱，送昆明醫(yī)學(xué)院電鏡中心進(jìn)行透射電鏡分析。

1.2.5成纖維細(xì)胞生長曲線測定

取傳至第2代的撒壩豬成纖維細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板。從第2天開始到細(xì)胞長滿，每天隨機(jī)取3 孔，連續(xù)7 d 記數(shù)。用血球計數(shù)板在倒置相差顯微鏡下計數(shù)，取其平均值，以時間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6撒壩豬成纖維細(xì)胞的核型檢測

取培養(yǎng)至匯合度為85%左右，并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞為試驗材料，參照Sun Y L[3]方法進(jìn)行染色體制備。

1.2.7細(xì)胞活率測定及微生物檢測

對凍存前后的第 2、4、6 代細(xì)胞進(jìn)行PI染色，統(tǒng)計計算細(xì)胞存活率。微生物檢測參見 Doyle[4]，Hay RI[5]和 Guan[6]等。

2結(jié)果與分析

2.1撒壩豬成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

組織塊培養(yǎng)5 d左右，成纖維細(xì)胞和少量類上皮細(xì)胞從組織塊周圍移出生長。隨著培養(yǎng)時間延長，大量成纖維細(xì)胞從組織塊周圍遷出并迅速增殖，成纖維細(xì)胞呈典型的長梭形。當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶(皿)底壁80 %左右時，進(jìn)行消化并傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后，生長加快，3～4 d 細(xì)胞即可長滿瓶底而再次傳代。原代細(xì)胞及傳代后細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。

圖1　撒壩豬成纖維細(xì)胞A：原代細(xì)胞(20 X)B：第5代細(xì)胞(20X)

2.2撒壩豬耳緣成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞活率

撒壩豬耳緣組織成纖維細(xì)胞凍存前活率為94.16 %，復(fù)蘇后活率為91.12 %，細(xì)胞在凍存前和復(fù)蘇后都有較高的存活率，達(dá)到90 %以上，表明細(xì)胞在生長時健康狀況良好，培養(yǎng)條件適宜。另外，凍存對其存活率影響不大。

2.3撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析

撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析結(jié)果如圖2所示：細(xì)胞與細(xì)胞之間排列疏松，無緊密連接和橋粒，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細(xì)胞器，胞核呈長梭形，常染色質(zhì)較為豐富。圖2A黃色箭頭所示為表皮層和真皮層的皮膚類細(xì)胞，為橢圓形。圖2A、2B紅色箭頭所示為位于基底層的成纖維細(xì)胞，為長梭型。

圖2　撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析(黃色箭頭所示皮膚類細(xì)胞，紅色箭頭所示為成纖維細(xì)胞)

2.4撒壩豬成纖維細(xì)胞生長的動態(tài)觀察

每天計數(shù)結(jié)果取平均值，繪制撒壩豬成纖維細(xì)胞生長曲線呈“S”型(圖3)，細(xì)胞有約3d的緩慢生長期。此后進(jìn)入指數(shù)生長期，第7天細(xì)胞數(shù)達(dá)最大。然后細(xì)胞生長進(jìn)入平頂期，此時由于細(xì)胞密度增大，細(xì)胞生長受接觸抑制的影響，細(xì)胞開始衰老凋亡。

圖3　撒壩豬成纖維細(xì)胞的生長曲線

2.5撒壩豬成纖維細(xì)胞核型分析

參照 Levan[7]等的標(biāo)準(zhǔn)，第 3 代細(xì)胞核型取 100 個分裂相進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，撒壩豬染色體中正常二倍體染色體 (2n=38)所占比例為92.56%。說明所培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，該細(xì)胞系為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系。

圖4　撒壩豬核型圖(母)(1000x)

2.6撒壩豬成纖維細(xì)胞系微生物污染檢測結(jié)果

2.6.1細(xì)菌、真菌污染檢測結(jié)果

接種細(xì)胞的液體培養(yǎng)基和陰性對照一樣，沒有混濁，而陽性對照表現(xiàn)有明顯微生物生長。

2.6.2病毒檢測結(jié)果

紅細(xì)胞吸附實驗結(jié)果為陰性。日常相差顯微鏡觀察，未見有病毒造成的細(xì)胞損傷現(xiàn)象。

2.6.3支原體檢測結(jié)果

實驗采用Hoechst 33342 DNA 熒光染色法，未檢查到撒壩豬成纖維細(xì)胞被支原體污染。實驗組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，僅細(xì)胞核顯色，細(xì)胞表面及細(xì)胞周圍干凈、清晰，無熒光小點(diǎn)。如圖5 A所示。陽性對照組經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，可見細(xì)胞核與細(xì)胞膜及其周圍均可見散在的藍(lán)色熒光顆粒所圖5 B所示。證明我實驗室建立的撒壩豬成纖維細(xì)胞系支原體檢測呈陰性。

圖5　撒壩豬成纖維細(xì)胞支原體檢測

3討論

據(jù)張利娟等[8]報道，豬的染色體數(shù)目為2n=38。我們的實驗結(jié)果表明撒壩豬的染色體數(shù)目為2n=38，與上述結(jié)論一致。撒壩豬成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)中，隨著傳代次數(shù)的增加，生長速度會變慢。此外，細(xì)胞的二倍體染色體數(shù)目正常的比例呈逐步下降的趨勢，細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性有所改變?？赡苁怯捎诩?xì)胞本身端粒酶長度的縮短[9]或者體外培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞的 DNA 造成的損傷[10]。而本實驗要求培養(yǎng)的細(xì)胞始終維持二倍體生物學(xué)性狀，保持與體內(nèi)細(xì)胞相似性較大，因此不能傳代太多，傳2～3代細(xì)胞不用于實驗就立即低溫凍存。對原代細(xì)胞以及復(fù)蘇后細(xì)胞中染色體眾數(shù)進(jìn)行檢測，2n=38 的占90 %以上，染色體沒有異常表現(xiàn)，說明該細(xì)胞系為穩(wěn)定二倍體細(xì)胞系。

核型制備過程中，固定和滴片是核型分散成功的保證[11]，適當(dāng)?shù)牡纹叨纫彩侨旧w分散良好的重要條件[12]。撒壩豬成纖維細(xì)胞核型制備時，用0.25 μg /mL 終濃度的秋水仙胺處理細(xì)胞2.5 h，低滲40 min，1.5 m 滴片，能夠得到分散度好、數(shù)量多的細(xì)胞中期染色體。撒壩豬染色體長度的測定計算中，實驗對多個中期染色體分裂相進(jìn)行了觀察、分析、比對。實驗結(jié)果表明，撒壩豬的染色體 2n=38，與其它豬的染色體相似[8]。

本研究從撒壩豬耳緣組織中分離、培養(yǎng)并建立了成纖維細(xì)胞系。通過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果看，細(xì)胞為長梭形，絕大多數(shù)是成纖維細(xì)胞，其中含有少量其他類型的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞。由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶耐受性不同[13，14]。因此，利用此差別，通過幾次傳代后，就可得到純化的成纖維細(xì)胞。

低溫保存技術(shù)是生物科學(xué)的一門分支學(xué)科，是指將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定冷凍速率(或不同溫度梯度應(yīng)用不同的冷凍速率，并且有一定的保持時間)降至零下某一溫度(一般是低于-70 ℃的超低溫)，此溫度能夠維持生物樣本活性暫停，進(jìn)而可以長期保存[15]。細(xì)胞保存過程中，需要盡可能降低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而保持解凍后細(xì)胞活性、黏附能力及代謝活性[16]。本試驗采用10%DMSO加培養(yǎng)液來凍存細(xì)胞，凍存前細(xì)胞活率為94.16%，復(fù)蘇后的細(xì)胞活率91.12%，細(xì)胞復(fù)蘇后10～15 h 可見細(xì)胞貼壁；復(fù)蘇后第2天更換培養(yǎng)液，2～3 d 長滿培養(yǎng)瓶。說明凍存的各項條件對細(xì)胞損傷不大，撒壩豬成纖維細(xì)胞可在液氮凍存，解凍后細(xì)胞可繼續(xù)傳代培養(yǎng)，活率與凍存前相比相差不大?？梢杂迷摲ū４嫒鰤呜i這種優(yōu)良的動物遺傳資源。

綜上所述，本研究建立的撒壩豬耳緣組織成纖維細(xì)胞系增殖快，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定。該細(xì)胞系的建立，使撒壩豬這一國家重要遺傳資源在細(xì)胞水平上得以保存下來，并為相關(guān)遺傳學(xué)研究提供了有效的理論依據(jù)和理想的生物材料。同時對于開展其他動物成纖維細(xì)胞系的建立也有一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)意義。

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Establishment and the Biological Characteristics of Fibroblast Cell Line in Saba Pig

LV Chun-rong1，QUAN Guo-bo1，WU Guo-quan1，HONG Qiong-hua*

(Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224，China)

Abstract：In this study，the fibroblasts cell line derived from ear marginal tissue of saba pig was successfully established using the primary explants technique and cryopreservation technology.The morphology，cell survival rate and karyotypes of the cultured cells after different passages were analyzed，The tissue cells of the ear were observed by transmission electron microscopy.The results showed that the population doubling time(PDT)of the cells was 48 h；The growth curve of the cultured cells appeared“S”shape；The frequency of cell chromosome number to be 2n=38 was 92.56 %；Tests for the contamination from bacteria，fungi or mycoplasma were negative；Transmission electron microscopy showed that fibroblast cells were long shuttle type.

Key words：saba pig；fibroblast cell line；biological characteristics

通訊作者：洪瓊花(1968-)，女，白族，碩士，研究員，主要從事綿羊、山羊的育種和高效繁殖新技術(shù)研究。E-mail：yxh7168@126.com

作者簡介：呂春榮(1982-)，女，云南人，碩士，助理研究員，研究方向動物細(xì)胞分子生物學(xué)。E-mail：chunronglv228@163.com

收稿日期：2015-12-23

中圖分類號：S828；S814.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-2739(2016)02-0009-05