過表達(dá) TRAIL 聯(lián)合特異性沉默 Eag 1 的協(xié)同抗骨肉瘤作用

曾文容 陳志達(dá) 劉慶軍 林斌 吳欣宇 吳進(jìn)

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過表達(dá) TRAIL 聯(lián)合特異性沉默 Eag 1 的協(xié)同抗骨肉瘤作用

曾文容 陳志達(dá) 劉慶軍 林斌 吳欣宇 吳進(jìn)

【摘要】目的 檢測過表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 ( TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 聯(lián)合特異性沉默 Ethergo-go 1 ( Eag 1) 基因?qū)侨饬龅挠绊?。方?分別構(gòu)建名為 Ad5. eGFP、CRAd5. siEag、CRAd5. TRAIL 和 CRAd5. TRAIL / siEag1 的腺病毒載體并檢測其抗骨肉瘤的作用。結(jié)果Ad5. eGFP 對 MG-63 細(xì)胞中的 Eag 1 和 TRAIL 表達(dá)無明顯影響，CRAd5. siEag 僅可抑制 Eag 1 的表達(dá)，CRAd5. TRAIL 僅可過表達(dá) TRAIL，而 CRAd5. TRAIL / siEag1 既能沉默 Eag 1 又能過表達(dá) TRAIL。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CRAd5. TRAIL / siEag1 比 Ad5. eGFP、CRAd5. TRAIL 或 CRAd5. siEag1 能更有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。同時(shí)，對人成骨細(xì)胞 hFOB 1.19 無明顯細(xì)胞毒性。CRAd5. TRAIL / siEag1 組 Caspase-3 / 7 活性為 ( 39693.33±1922.96) RLU，Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1 和 CRAd5. TRAIL 組 Caspase-3 / 7 活性分別為：( 2832.83±375.99)、( 3242.50±329.97) 和 ( 15583.17±698.54) RLU。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示 CRAd5. TRAIL / siEag1 組 Caspase-3 / 7活性明顯高于其它三組 ( P＜0.001)。此外，CRAd5. TRAIL / siEag1 還可有效地誘導(dǎo) MG-63 細(xì)胞中 PARP 裂解物表達(dá)。局部注射第 8 天，CRAd5. TRAIL / siEag1 組裸鼠腫瘤的體積為 ( 231.19±25.96) mm3，Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1 和 CRAd5. TRAIL 組裸鼠腫瘤體積分別為：( 504.68±102.32)、( 365.85±47.60) 和 ( 355.48±35.34) mm3，CRAd5. TRAIL 組裸鼠腫瘤體積與其它三組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05)。第 10、12 和14 天，CRAd5. TRAIL / siEag1 組裸鼠腫瘤的體積分別為：( 367.82±39.52)、( 470.18±60.11) 和 ( 631.52±61.22) mm3，Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1 和 CRAd5. TRAIL 組裸鼠腫瘤體積分別為：( 826.57±130.60)、( 1284.69±243.50) 和 ( 1762.06±180.36) mm3，( 552.12±64.39)、( 721.82±108.20) 和 ( 949.20±124.70) mm3，( 524.03±43.47)、( 653.54±56.22)、( 896.44±93.64) mm3。與其它三組相比，CRAd5. TRAIL / siEag1 可更有效地抑制裸鼠骨肉瘤生長。TUNEL 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CRAd5.TRAIL / siEag1 的凋亡指數(shù)為 ( 27.33±2.07) %，而Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1 和 CRAd5. TRAIL 組的凋亡指數(shù)分別為 ( 2.68±0.64) %，( 8.49±1.06) % 和 ( 15.99±1.94) %，CRAd5. TRAIL / siEag1 組與其它三組相比可有效地促進(jìn)骨肉瘤凋亡 ( P＜0.001)。結(jié)論 過表達(dá) TRAIL聯(lián)合特異性沉默 Eag 1 基因可產(chǎn)生協(xié)同抗骨肉瘤作用，因此 CRAd5. TRAIL / siEag1 腺病毒載體可作為一個(gè)有效的骨肉瘤基因治療工具。

【關(guān)鍵詞】骨肉瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；基因；TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；Eag 1 基因

骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的骨原發(fā)性惡性腫瘤[1-2]。即使采用手術(shù)聯(lián)合化療的治療方案，患者 5 年生存率也僅為 55%～60%，而并發(fā)肺轉(zhuǎn)移者2 年生存率不到 40%[3]。因此開發(fā)針對骨肉瘤的新型療法迫在眉睫。研究表明，Eag 1 基因不僅參與了多種腫瘤細(xì)胞增殖和周期的過程，還可能成為一個(gè)新興的腫瘤治療靶點(diǎn)[4-5]。Eag 1 基因在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用、機(jī)制及其是否可成為骨肉瘤基因治療靶點(diǎn)，仍需進(jìn)一步研究。TRAIL 是腫瘤壞死因子( tumor necrosis factor，TNF) 家族的成員。近年來，因其可選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并對正常細(xì)胞無明顯副作用而成了一個(gè)新興的腫瘤治療基因[6]。但TRAIL 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性及某些腫瘤細(xì)胞對 TRAIL 抵抗仍是其臨床運(yùn)用的主要障礙[7]。

本研究構(gòu)建了一種新型的重組腺病毒載體并將其命名為 CRAd5. TRAIL / siEag1。該載體可同時(shí)過表達(dá) TRAIL 并沉默 Eag 1，本研究利用其感染骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞并檢測其抗骨肉瘤的作用。

材料與方法

一、原料、試劑和儀器

人骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞 ( CRL-1427)、人胚腎 293 細(xì)胞 ( CRL-1573) 和人成骨細(xì)胞 hFOB 1.19 ( CRL-11372) 購自美國 ATCC 公司；MEM 培養(yǎng)基( 11095-027)、RPMI-1640 培養(yǎng)基 ( 11875-119)、DMEM / F12 培養(yǎng)基 ( 11039-021) 及胎牛血清( 10437-077) 購自美國 Gibco 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板( M5811)、二甲基亞砜 ( DMSO，W387520) 和 MTT 試劑盒 ( M2128) 購自美國 Sigma 公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔 IgG 抗體 ( sc-45101) 和 Eag 1 siRNA ( sc-146362) 購自美國 Santa Cruz 公司；Eag l 單克隆抗體 ( APC-104) 購自以色列 Alomone 公司，Caspase-3 / 7 檢測試劑盒 ( G7792) 購自美國Apo-ONE?公司，TUNEL 工具包 ( C10618) 購自美國Invitrogen 公司。PCR 儀 ( T100) 和 Luminometer 化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀均購自美國 Bio-rad 公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 各種載體質(zhì)粒的構(gòu)建：通過 PCR 擴(kuò)增人 TRAIL 的 cDNA，并將其克隆到 pcDNA 上形成 pcDNA-CMV-TRAIL。根據(jù)序列 5’-AGC CAT CTT GGT CCC TTA TAA-3’ 構(gòu)建 Eag 1 shRNA。將 hU6-shEag1 片段引入 pcDNA-CMV-TRAIL，成為 pcDNA-CMV-TRAIL-hU6-shEag1。再將 CMV-TRAIL-hU6-shEag1 片段亞克隆于 pAdeno-X 骨架上，從而形成合并的 pCRAd5. TRAIL / siEag1 質(zhì)粒。按照上述方法分別構(gòu)建 CRAd5. TRAIL ( 過表達(dá)TRAIL)，CRAd5. siEag1 ( 沉默 Eag 1) 和 Ad5. eGFP ( 對照) 質(zhì)粒。在人胚腎 293 細(xì)胞用 260 nm 吸光度和噬斑試驗(yàn)檢測病毒準(zhǔn)備質(zhì)粒效價(jià)。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)及感染：人骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞株、人胚腎 293 細(xì)胞株和人成骨 hOFB 1.19 細(xì)胞株分別常規(guī)培養(yǎng)于 MEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM / F12 ( 都含 10% 小牛血清和 1% 青霉素－鏈霉素) 培養(yǎng)液中，置于 37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱孵育傳代。感染腺病毒前 1 天將細(xì)胞接種到 24 孔板中，培養(yǎng)后 24 h，細(xì)胞密度達(dá)到 80%～90%。分別感染不同腺病毒，實(shí)驗(yàn)分為：Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1、CRAd5. TRAIL 和 CRAd5. TRAIL / siEag1 組。

3. MTT 檢測細(xì)胞增殖：100 μl 細(xì)胞懸液 ( 1× 105/ ml) 均勻分布于 96 孔培養(yǎng)板中，在 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)后 24 h 孔中分別感染不同的腺病毒。繼續(xù)培養(yǎng)后 48 h，加入 20 μl MTT 溶液 ( 5 mg / ml)，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)。棄種植孔內(nèi)清液，每孔加 150 μl DMSO，振蕩 10 min。選擇 490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀 ( 美國 Bio-Rad 公司) 上測定各孔光吸收值。為提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組至少設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔。按照公式：細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組吸光值 / 陽性對照吸光值×100% 計(jì)算增殖率。設(shè)平行對照組，加細(xì)胞、培養(yǎng)基不加抑制劑的組為陽性對照組；只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞的孔設(shè)置為空白對照組，比色時(shí)空白對照組調(diào)零。

4. 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：96 孔板每孔中加入 20 μl 細(xì)胞懸液 ( 1×105/ ml) 并在 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)箱過夜，隨后感染不同的腺病毒，相同量的Apo-ONE Caspase-3 / 7 試劑加入 96 孔板，室溫孵育1 h。每組至少設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，在 Luminometer 化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值。

5. Western Blot 分析 ( WB)：收集 5～6×107個(gè)細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，將 4 ℃ 預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液 ( 10 mmol / L EDTA，10 mmol / L Tris-HCl，150 mmol / L NaCl，0.4% SDS，pH 7.4) 裂解細(xì)胞，在 4 ℃ 下 15 000 轉(zhuǎn) / 分離心約 10 min，吸取上清液，用 BCA 比色法測定蛋白濃度后，把樣品置于沸水浴中 5～8 min，然后進(jìn)行 10% SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( SDS-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE) 在 80 伏特電流下電泳 30 h，120 伏50 min 分離蛋白，用電轉(zhuǎn)膜儀 100 V，230 mA 濕法轉(zhuǎn)膜過夜 ( 轉(zhuǎn)膜前 PVDF 膜用甲醇活化 1 min)。用含5% 脫脂奶粉的 TBST 室溫封閉 1 h，倒掉封閉液，然后在室溫下用兔抗人 Eag 1、PARP 多克隆抗體孵育，置于 4 ℃ 冰箱過夜；用 PBST 洗滌 3 次，每次10 min，加入二抗室溫孵育 1.5 h，1∶1000 稀釋；用PBST 洗滌 3 次，每次 10 min；采用 DAB 顯色法檢測 Eag 1、PARP，內(nèi)參照為 GAPDH，用 Touching 凝膠成像分析軟件分析條帶凈灰度，用各組目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參 GAPDH 的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果為目的蛋白的相對含量，表示目的蛋白的表達(dá)水平。

6. 裸鼠骨肉瘤模型的構(gòu)建：從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院購買 BALB / c 裸鼠 ( 雌性，年齡 6～8 周)。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物處置符合科學(xué)技術(shù)部 2006 年“關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見”的要求。按照文獻(xiàn)的方法構(gòu)建骨肉瘤移植瘤模型[8]：將 150 μl MG-63 細(xì)胞懸液 ( 1.5×106/ ml) 注射裸鼠右側(cè)后腿皮下。模型建成后 1 周，長出肉眼可見的腫瘤。之后將裸鼠隨機(jī)分為 4 組 ( 每組 6 只)，分別每隔 1 天瘤內(nèi)注射 Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1、CRAd5. TRAIL 或 CRAd5. TRAIL / siEag1 ( 1×107pfu / 50 μl)，共注射 7 次。用ab2 / 2 ( a 代表長度和 b 代表寬度) 公式來測定腫瘤體積。

7. 末端標(biāo)記法 ( TUNEL) 檢測凋亡：瘤內(nèi)注射14 天后處死裸鼠。處理離體的右側(cè)后腿腫瘤，碎塊用 3.7% 甲醛固定。隨后多聚甲醛 ( 4%，pH 7.4) 室溫固定 30 min。4% PBS 室溫清洗 30 min，冰上用0.1% Tritons X-100 in 0.1% 檸檬酸鈉透化重懸。凋亡指數(shù)計(jì)算使用公式：凋亡指數(shù)＝( 凋亡細(xì)胞總數(shù) / 細(xì)胞總數(shù))×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、CRAd5. TRAIL / siEag1 效能的檢測

在人骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞中，為了獲得沉默Eag 1 和過表達(dá) TRAIL 最大轉(zhuǎn)染效率，本研究構(gòu)建了四種腺病毒載體：Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1、CRAd5. TRAIL 和 CRAd5. TRAIL / siEag1。為比較沉默 Eag 1 和過表達(dá) TRAIL 效率，WB 分別檢測了不同腺病毒載體感染后 Eag 1 和 TRAIL 的表達(dá)水平。如圖 1 所示，感染 CRAd5. siEag1 或 CRAd5. TRAIL / siEag1，均可顯著減少 Eag 1 表達(dá)。相比而言，感染Ad5. eGFP 或 CRAd5. TRAIL，Eag 1 表達(dá)水平無明顯變化。另一方面，感染 CRAd5. TRAIL 或 CRAd5. TRAIL / siEag1，TRAIL 表達(dá)水平明顯上升，而感染Ad5. eGFP 或 CRAd5. siEag1 則未見上述情況。結(jié)果顯示 CRAd5. TRAIL / siEag1 既能沉默 Eag 1 又能過表達(dá) TRAIL。

二、CRAd5. TRAIL / siEag1 對骨肉瘤細(xì)胞生長和凋亡的影響

圖1　CRAd5. TRAIL / siEag1 載體效能的檢測 [ MG-63 細(xì)胞分別感染四種腺病毒：Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1、CRAd5. TRAIL 和 CRAd5. TRAIL / siEag1 ( 感染復(fù)數(shù)為 10，單位 pfu / 細(xì)胞個(gè)數(shù))；48 h 后，WB 檢測 Eag 1 和 TRAIL 表達(dá)水平；NC：negative control 即陰性對照組 ( 無病毒感染) ]Fig.1 Characterization of CRAd5. TRAIL / siEag1 adenoviral vector [ MG-63 cells were infected with different adenoviruses Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1, CRAd5. TRAIL or CRAd5. TRAIL / siEag1 at MOI ( multiplicity of infection, calculated as pfu / cell numbers) of 10, respectively. After 48 h, the relative expression levels of Eag 1 and TRAIL were examined by Western blot analysis. NC, negative control ( cells without infection) ]

圖3　CRAd5. TRAIL / siEag1 對人成骨細(xì)胞 hFOB 1.19 增殖無明顯影響 [ hFOB 1.19 細(xì)胞分別感染 1、5、10 MOI 濃度的Ad5. eGFP，CRAd5. siEag1，CRAd5. TRAIL or CRAd5. TRAIL / siEag1，48 h 后行 MTT 檢測細(xì)胞增殖情況 ( n = 6) ]Fig.3 CRAd5. TRAIL / siEag1 had no effects on the proliferation of hFOB 1.19 cells [ hFOB 1.19 cells were infected with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1, CRAd5. TRAIL or CRAd5. TRAIL / siEag1 at MOI of 1, 5, 10, respectively. After 48 h the cells were harvested for MTT assay ( n = 6) ]

CRAd5. TRAIL / siEag1 比 Ad5. eGFP、CRAd5. TRAIL 或 CRAd5. siEag1 能更有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖 ( 圖 2)。同時(shí)，對人成骨細(xì)胞 hFOB 1.19 無明顯細(xì)胞毒性 ( 圖 3)。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CRAd5. TRAIL / siEag1 組中 Caspase-3 / 7 值明顯高于其它組 ( 圖 4)。聚腺苷二磷酸－核糖聚合酶 [ poly ( ADP-ribose) polymerase，PARP ] 在細(xì)胞凋亡時(shí)期被Caspase 分割成大小為 89 kDa 和 24 kDa 的碎片，因此PARP 裂解物 ( Cleaved PARP) 被認(rèn)定是一種 Caspase依賴凋亡的經(jīng)典特征。WB 示，CRAd5. TRAIL / siEag1 可有效誘導(dǎo) Cleaved PARP 表達(dá) ( 圖 5)。上述結(jié)果提示，沉默 Eag 1 聯(lián)合過表達(dá) TRAIL 能有效的抑制 MG-63 細(xì)胞生長抑制并誘導(dǎo)凋亡。

圖2　CRAd5. TRAIL / siEag1 能有效抑制 MG-63 細(xì)胞增殖[ MG-63 細(xì)胞分別感染 1、5、10 MOI 濃度的 Ad5. eGFP，CRAd5. siEag1，CRAd5. TRAIL or CRAd5. TRAIL / siEag1，48 h后行 MTT 檢測細(xì)胞增殖情況 ( n = 6) ]Fig.2 Strong induction of cell growth arrest of MG-63 by CRAd5. TRAIL / siEag1 [ MG-63 cells were infected with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1, CRAd5. TRAIL or CRAd5. TRAIL / siEag1 at MOI of 1, 5, 10, respectively. After 48 h the cells were harvested for MTT assay ( n = 6) ]

圖4　CRAd5. TRAIL / siEag1 能顯著誘導(dǎo) Caspase-3 / 7 活性( CRAd5. TRAIL / siEag1 組中 Caspase-3 / 7 的活性明顯高于其它載體感染組。aP < 0.001，n = 6)Fig.4 Higher Caspase-3 / 7 activity induced by CRAd5. TRAIL / siEag1 ( The level of activated Caspase-3 / 7 was higher in CRAd5. TRAIL / siEag1 infected cells than in other adenoviral vectors infected cells.aP < 0.001, compared with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1 or CRAd5. TRAIL n = 6)

圖5　CRAd5. TRAIL / siEag1 可有效誘導(dǎo) Cleaved PARP 表達(dá)( CRAd5. TRAIL / siEag1 感染組中 PARP 裂解產(chǎn)物表達(dá)水平明顯高于其它組)Fig.5 The higher expression of cleaved PARP induced by CRAd5. TRAIL / siEag1 ( The level of cleaved PARP was higher in CRAd5. TRAIL / siEag1 infected cells than in other adenoviral vectors infected cells)

三、CRAd5. TRAIL / siEag1 對裸鼠骨肉瘤生長和凋亡的影響

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比注射 Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1 或 CRAd5. TRAIL，注射 CRAd5. TRAIL / siEag1 的裸鼠腫瘤體積顯著減小 ( 圖 5，6)，顯示 CRAd5. TRAIL / siEag1 在活體水平可有效抑制腫瘤生長。TUNEL 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CRAd5. TRAIL / siEag1 的凋亡指數(shù)為 ( 27.33±2.07) % ( 凋亡指數(shù)，即從 6 個(gè)隨機(jī)視野 TUNEL 陽性細(xì)胞平均百分比)，明顯高于其它組。Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1 和 CRAd5. TRAIL 組的凋亡指數(shù)分別為 ( 2.68±0.64) %，( 8.49±1.06) % 和 ( 15.99±1.94) % ( 圖 7)。

討 論

1969 年，Kaplan 等[9]在 Genetics 雜志上首次報(bào)道了一種可以使成年雄性黑腹果蠅腿部在麻醉狀態(tài)下發(fā)生緩慢而規(guī)律運(yùn)動(dòng)的基因，人們將其命名為Ethergo-go ( Eag)，其性質(zhì)為一種電壓門控性鉀離子通道。之后的研究證實(shí) Eag 亞族包括兩個(gè)成員：Eag 1 和 Eag 2。1999 年，Pardo 等[10]在 EMBO J 雜志上發(fā)表了里程碑式的文章，首次證實(shí)了 Eag 1 與腫瘤密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明 Eag 1 在多種人類腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中高表達(dá)，而在相應(yīng)來源的正常細(xì)胞和組織中不表達(dá)或低表達(dá) ( 主要表達(dá)于腦組織，短暫性表達(dá)于胎盤和肌原細(xì)胞)[5]。一些致癌因素，如 HPV 感染、雌激素和致癌物等均可誘導(dǎo)其高表達(dá)，提示 Eag 1 具有致癌潛能并可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物[10]。應(yīng)用 Eag 1 非特異性阻滯劑如丙咪嗪( 一種抗抑郁藥物) 和阿司咪唑 ( 一種抗過敏藥物)或特異性阻滯劑小干擾 RNA ( small interfering，siRNA) 和抗體均可達(dá)到抑制 Eag 1 活性和腫瘤增殖的效果[11-12]，提示 Eag 1 可作為一個(gè)有效的腫瘤治療靶點(diǎn)。但針對 Eag 1 的治療是否會(huì)損傷正常組織尤其是腦組織？盡管丙咪嗪和阿司咪唑在臨床上已廣泛運(yùn)用且對腦組織的功能無明顯影響，但仍缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)消除上述顧慮。近期一項(xiàng)的研究結(jié)果從一定程度上消除了上述顧慮：敲除小鼠腦組織內(nèi)正常表達(dá)的 Eag 1 對小鼠的認(rèn)知、行為和生命并無明顯影響[13]，這也進(jìn)一步證實(shí)了 Eag 1 作為腫瘤有效治療靶點(diǎn)的潛能。此外，已有研究破解了小鼠Eag 1 依賴于電壓的鉀通道的兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)域的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)，證實(shí)了上述結(jié)構(gòu)域通過直接相互作用來發(fā)揮調(diào)控作用[14]，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

圖6　CRAd5. TRAIL / siEag1 可有效抑制裸鼠骨肉瘤生長 ( 在14 天的觀察期中，瘤內(nèi)注射 CRAd5. TRAIL / siEag1 可有效抑制裸鼠骨肉瘤的生長。分別與 Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1 和CRAd5. TRAIL 組相比，aP < 0.05、bP < 0.01、cP < 0.001，n = 6)Fig.6 CRAd5. TRAIL / siEag1 significantly inhibited the growth of MG-63 cells in nude mice ( Intra-tumor injection of CRAd5. TRAIL / siEag1 significantly reduced the size of MG-63 derived tumor implanted subcutaneously in nude mice during the 14-day follow-up period.aP < 0.05,bP < 0.01 andcP < 0.001, compared with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1 or CRAd5. TRAIL, respectively n = 6)

圖7　CRAd5. TRAIL / siEag1 可有效誘導(dǎo)裸鼠骨肉瘤凋亡( a～e：TUNEL 法分別檢測 Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1、CRAd5. TRAIL 和 CRAd5. TRAIL / siEag1 組的凋亡指數(shù)。表示凋亡的細(xì)胞?！?00，分別與 Ad5. eGFP、CRAd5. siEag1、CRAd5. TRAIL組相比，aP < 0.001，n = 6)Fig.7 CRAd5. TRAIL / siEag1 significantly induced the apoptosis of MG-63 cells in nude mice [ a - e: Apoptosis index of MG-63 xenograft tumors in nude mice treated with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1, CRAd5. TRAIL or CRAd5. TRAIL / siEag1 was calculated based on TUNEL assay ( n = 6). The apoptotic cells were indicated by arrows (). Original magnification, × 400.aP < 0.001, compared with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1 or CRAd5. TRAIL, respectively ]

TRAIL 能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常組織無明顯副作用。因此，TRAIL 也可作為一個(gè)有效的腫瘤治療靶點(diǎn)。然而，TRAIL 如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全明確。TRAIL 包含兩種死亡受體：死亡受體 4 ( DR4，TRAIL-R1) 和死亡受體 5 ( DR5，TRAIL-R2)[15]。DR4 和 DR5 受體能與 FAS死亡相關(guān)結(jié)構(gòu)域結(jié)合從激活 Caspase 依賴的凋亡信號(hào)通路。然而，一些腫瘤細(xì)胞對于 TRAIL 具有抵抗作用是其臨床運(yùn)用的主要障礙。近年來，TRAIL與其它因子聯(lián)合治療給腫瘤治療帶來新的模式。Hartung 等[16]設(shè)計(jì)出一種新型抗 Eag 1 聯(lián)合 TRAIL單鏈抗體，它可誘導(dǎo) Eag 1 陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞凋亡并對 Eag 1 陰性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生旁觀效應(yīng)，提示 Eag 1 和 TRAIL 聯(lián)合具有協(xié)同抗腫瘤作用。目前，關(guān)于腫瘤細(xì)胞對 TRAIL 抵抗的可能機(jī)制尚無明確的結(jié)論。一些基因，如 cFLIP 等[17]均可能參與了腫瘤細(xì)胞對 TRAIL 抵抗的過程。本研究探討了過表達(dá) TRAIL 聯(lián)合特異性沉默 Eag 1 的協(xié)同抗骨肉瘤作用。體外研究顯示 CRAd5. TRAIL / siEag1 腺病毒介導(dǎo)的 siRNA 能有效沉默 Eag 1 的表達(dá)和并誘導(dǎo) TRAIL 表達(dá)且對于人成骨細(xì)胞 hFOB 1.19 細(xì)胞無明顯毒性。之后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示 CRAd5. TRAIL / siEag1 比單純 CRAd5. siEag1 或 CRAd5. TRAIL 能更有效地抑制骨肉瘤生長，同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡?？赡艿臋C(jī)制為：CRAd5. TRAIL / siEag1 介導(dǎo)的 Eag 1 沉默可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對 TRAIL 的敏感性并激活信號(hào)通路。而筆者前期的研究已證實(shí)了 Eag 1 在骨肉瘤中的異常高表達(dá)[8]。因此，本研究的結(jié)果為針對 TRAIL的骨肉瘤基因治療提供了一個(gè)新思路。

綜上所述，過表達(dá) TRAIL 聯(lián)合特異性沉默 Eag 1基因可產(chǎn)生協(xié)同抗骨肉瘤作用，而 CRAd5. TRAIL / siEag1 則能成為一個(gè)有效的骨肉瘤基因治療工具。

參 考 文 獻(xiàn)

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( 本文編輯：李貴存)

. 論著 Original article .

Synergistic anti-osteosarcoma effects of TRAIL overexpression in combination with Ether à go-go 1 silence ZENG Wen-rong, CHEN Zhi-da, LIU Qing-jun, LIN Bin, WU Xin-yu, WU Jin. Department of Orthopaedics, the Affiliated Southeast Hospital of Xiamen University, Zhangzhou, Fujian, 363000, PRC

【Abstract】Objective To evaluate effects of TNF-related apoptosis-inducing ligand ( TRAIL) overexpression in combination with Ether à go-go 1 ( Eag 1) silence on osteosarcoma. Methods Several adenoviral vectors named Ad5. eGFP, CRAd5. siEag, CRAd5. TRAIL and CRAd5. TRAIL / siEag1 were generated and their anti-tumor effects on osteosarcoma were investigated. Results Ad5. eGFP had no effects on the expression of Eag 1 and TRAIL in MG-63 cells, while CRAd5. siEag knocked down the expression of Eag 1, CRAd5. TRAIL over expressed the TRAIL expression and CRAd5. TRAIL / siEag1 permitted simultaneous overexpression of TRAIL and knockdown of Eag 1.book=124,ebook=49Results of cell proliferation showed that CRAd5. TRAIL / siEag1 induced growth arrest in a more efficient manner than CRAd5. TRAIL or CRAd5. siEag1, and had no effects on human osteoblastic hFOB 1.19 cells. The amount of activated Caspase-3 / 7 was ( 39693.33 ±1922.96), ( 2832.83 ±375.99), ( 3242.50 ±329.97) and ( 15583.17 ±698.54) RLU in CRAd5. TRAIL / siEag1, Ad5. eGFP, CRAd5. siEag and CRAd5. TRAIL group respectively. Results showed that the amount of activated Caspase-3 / 7 was significantly higher in CRAd5. TRAIL / siEag1 infected cells than in other adenoviral vectors infected cells ( P < 0.001). Moreover, the amount of cleaved PARP was also significantly higher in CRAd5. TRAIL / siEag1 infected cells than in other adenoviral vectors infected cells. At 8 day after local injection, the tumor volume in CRAd5. TRAIL / siEag1 was ( 231.19 ±25.96) mm3, which was significantly smaller than the volumes in Ad5. eGFP ( 504.68 ±102.32) mm3, CRAd5. siEag ( 365.85 ±47.60) mm3or CRAd5. TRAIL ( 355.48 ±35.34) mm3group ( P < 0.05). At 10 th, 12 th and 14 th day after local injection, the tumor volumes in CRAd5. TRAIL / siEag1 group were ( 367.82 ±39.52), ( 470.18 ±60.11) and ( 631.52 ±61.22) mm3, while the tumor volumes in Ad5. eGFP group were ( 826.57 ±130.60), ( 1284.69 ±243.50) and ( 1762.06 ±180.36) mm3, in CRAd5. siEag group were ( 552.12 ±64.39), ( 721.82 ±108.20) and ( 949.20 ±124.70) mm3and in CRAd5. TRAIL group were ( 524.03 ±43.47), ( 653.54 ±56.22) and ( 896.44 ±93.64) mm3. Results showed that the tumor volume was significantly smaller in CRAd5. TRAIL / siEag1 injected animals compared with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1 or CRAd5. TRAIL injected animals. The tumors from the mice injected with CRAd5. TRAIL / siEag1 demonstrated extensive apoptosis ( 27.33 ±2.07) %, compared with the group treated with Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1 or CRAd5. TRAIL. The apoptotic index were ( 2.68 ±0.64) %, ( 8.49 ±1.06) % and ( 15.99 ±1.94) % in Ad5. eGFP, CRAd5. siEag1 and CRAd5. TRAIL, respectively. The differences were significant ( P < 0.001). Conclusions CRAd5. TRAIL / siEag1 can represent an effective strategy for osteosarcoma gene therapy due to the synergistic anti-tumor effects of Eag 1 knockdown and TRAIL overexpression.

【Key words】Osteosarcoma; Cell proliferation; Apoptosis; Genes; Tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand; Ether à go-go1

( 收稿日期：2015-05-23)

Corresponding author:WU Jin, Email: wu215@iupui.edu

通信作者：吳進(jìn)，Email: wu215@iupui.edu

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 ( 81402217)
作者單位：363000 福建，漳州市廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院骨科 ( 曾文容、陳志達(dá)、劉慶軍、林斌、吳進(jìn))，神經(jīng)內(nèi)科 ( 吳欣宇)

DOI:10.3969/j.issn.2095-252X.2016.02.011

中圖分類號(hào)：R738.1