TNF—a對根尖乳頭干細胞與牙周膜干細胞增殖活性影響的比較研究

趙璐 吳佩玲 于莉 袁萍 周春梅

[摘要]目的：體外培養(yǎng)鼠根尖乳頭干細胞和牙周膜干細胞，比較研究腫瘤壞死因子a（TNF-a）對兩者增殖活性的影響，以期得出在炎癥狀態(tài)下兩者用于牙本質(zhì)再生的可能性。方法：取幼鼠根尖尚未發(fā)育完全的健康下頜牙，用酶消化法獲得根尖乳頭干細胞和牙周膜干細胞；免疫熒光法鑒定干細胞表面標志物；將含有TNF-a濃度為O、5、10、50ng/ml的培養(yǎng)液加入兩者的第3代細胞中，使用MTT法檢測以比較其對兩種細胞增殖活性的影響；采用SPSS 11.O軟件包對實驗組和對照組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。結(jié)果：SCAP與PDLSCs均呈長梭形，形似成纖維細胞；SCAP與PDLSCs均表達干細胞特性；SCAP較PDLSCs具有更強的增殖活性；在lOng/ml和50ng/ml濃度時，TNF-a能促進2種細胞的增殖。結(jié)論：與PDLSCs比較，SCAP增殖活性更強，在炎性環(huán)境下亦是如此，根尖乳頭干細胞可能在年輕恒牙根尖周炎癥經(jīng)適當治療后牙根繼續(xù)發(fā)育中起到重要作用。

[關(guān)鍵詞]TNF-a；根尖乳頭細胞；牙周膜細胞：MTT法；增殖；免疫熒光法

[中圖分類號]R781

[文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455 （2016）01-0034-03

許多臨床病例發(fā)現(xiàn)，己發(fā)生根尖周炎的年輕恒牙，通過嚴格的根管清理，刺激根尖區(qū)組織出血，封閉數(shù)月后可觀察根尖部分有新的硬組織形成，根尖孔閉合。但經(jīng)過清理的根管中，不可能有牙髓細胞的存在。自Sonoyam從阻生智齒的根尖乳頭中分離得到根尖乳頭干細胞（stemcells from apicalpapilla，SCAP），其具有的高度增殖能力、自我更新能力和多向分化的潛能迅速使其成為牙本質(zhì)再生及牙根發(fā)育的焦點。有學者將SCAP與HA/TCP復合培養(yǎng)后移植到免疫缺陷的小鼠皮下，觀察到皮下有牙髓牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成。 據(jù)此可以推測，當患有根尖周炎癥的年輕恒牙無牙髓細胞存在時，很有可能是SCAP促使根尖繼續(xù)發(fā)育。但發(fā)育期根尖端組織涉及的干細胞種類眾多，影響因素復雜，故還無法完全確定。本研究選取幼鼠根尖尚未發(fā)育完全的健康下頜牙，分離其根尖乳頭組織和牙周膜組織進行培養(yǎng)，并模擬炎性環(huán)境，用炎性因子TNF-a對根尖乳頭干細胞（SCAP） 和牙周膜干細胞（PDLSCs）進行干預，研究比較炎性因子對兩者增殖活性的影響，以進一步探討SCAP在年輕恒牙發(fā)生根尖周炎時促進牙根發(fā)育的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

a-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、PBS、青霉素/鏈霉素溶液、I型膠原酶、Vit C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉（β-Glycerophosphate Na2 Salt）、鼠腫瘤壞死性因子（TNFa）、0.25胰酶（Trypsin）、噻唑藍（MTT）、多聚甲醛、抗STR0-1多克隆抗體、二甲基亞砜（DMSO）、倒置相差顯微鏡、熒光正置顯微鏡及照相系統(tǒng)、37℃細胞培養(yǎng)孵箱、96孔板、酶標儀、超凈工作臺。

1.2 組織來源

4周齡Wistar大鼠5只，體重（60±5）g，飼養(yǎng)級別為清潔級，口腔牙周牙體狀況良好，遺傳背景清楚明確。

1.3 鼠SCAP和PDLSCs的分離培養(yǎng)和鑒定

參照郭俊等的方法取幼鼠根尖尚未發(fā)育完全的健康下頜牙，用含1%雙抗的PBS反復沖洗，無菌條件下鈍性分離根尖部的牙乳頭組織，再用刮匙刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎后分別置于15ml的離心管中，加入含3mg/ml I型膠原酶，37℃恒溫水浴消化50min，持續(xù)振蕩至完全消化；800rpm/min離心5min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液后，分別均勻接種到10c㎡的培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)，每隔3d換液。觀察細胞接近融合時，消化、傳代。采用免疫熒光法鑒定STRO-I的表達，確定兩者的干細胞特性。

1.4 TNF-a對鼠SCAP和PDLSCs增殖的影響

取第3代的SCAP和PDLSCs消化制成單細胞懸液，分別以200個/孔的濃度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h后，待大部分細胞貼壁伸展，棄孔內(nèi)殘液，更換無血清a-MEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)6h后，棄殘液，分別加入含TNF-a濃度為O、5、10、50ng/ml的培養(yǎng)液于96孔板中，每種濃度4復孔，設(shè)調(diào)零孔，每2d換液，第4天終止培養(yǎng)。避光條件下每孔加入MTT（5mg/ml），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，持續(xù)振蕩lOmin后，于酶聯(lián)免疫儀檢測490nm波長處各孔光密度值。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSSll.0軟件包，對細胞增殖數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），比較各組間樣本均數(shù)的差異，P

2 結(jié)果

2.1 鼠SCAP和PDLSCs的生長及形態(tài)觀察

原代培養(yǎng)3d后，倒置顯微鏡下可觀察到SCAP向組織周圍游離生長出來。細胞形態(tài)多數(shù)呈長梭形，少數(shù)為多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較小（圖1），每3d全量換液，6-8d后傳代，傳代后細胞整體呈漩渦狀排列。加入TNF-a后，SCAP細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，但細胞密度明顯增加。

原代PDLSCs形態(tài)與SCAP形態(tài)相似，呈成纖維細胞樣的梭形結(jié)構(gòu)，但體積較SCAP短?。▓D2），傳代后呈漩渦狀生長。加入TNF-a后，PDLSCs細胞形態(tài)亦未發(fā)生明顯改變。

2.2 干細胞特征的鑒定

免疫熒光法鑒定，鼠SCAP和PDLSCs均呈STRO-1強陽性表達（圖3、圖4），符合間充質(zhì)來源的干細胞的特性。

2.3 TNF-a對鼠SCAP和PDLSCs增殖的影響

TNF-a作用兩種細胞4d后，TNF-a對SCAP和PDLSCs增殖活性的影響結(jié)果見表1。在lOng/ml和50ng/ml濃度時，TNF-a能明顯促進SCAP和PDLSCs的增殖，與對照組O濃度相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而每種細胞在lOng/ml和50ng/ml濃度時，TNF-a的2種濃度組的組間比較，無顯著差別（P>0.05）。在未加入TNF-a時，SCAP較PDLSCs具有較強的增殖活性（P<0.05）。

3 討論

眾所周知，臨床上患有根尖周炎的恒牙，在經(jīng)過徹底清理，系統(tǒng)的根管治療后，根管中是不可能存在牙髓細胞的。而通常在臨床上遇到患有根尖周炎癥的年輕恒牙時，醫(yī)師們一般使用氫氧化鈣以達到根尖誘導的目的。此方法在不同病例上獲得的效果不一。研究發(fā)現(xiàn)年齡小、病史較短的患牙的治療效果較好，究其原因可能是病史較長的患牙根尖部形成硬組織的細胞受到破壞。但近年來許多病例發(fā)現(xiàn)：患有根尖周炎的年輕恒牙，在經(jīng)過根管治療后，牙根持續(xù)發(fā)育成形，且部分病例牙髓活力測試有反應。據(jù)此，有學者提出了“血管重建假說”，他們認為之所以年輕恒牙發(fā)生炎癥后牙根仍能夠繼續(xù)發(fā)育是因為其擁有寬大的管腔，當發(fā)生根尖周疾病時，由于通暢的血液循環(huán)，根尖處也許仍存在部分干細胞，可發(fā)生牙髓再生及根尖成形。據(jù)此可推測發(fā)育期牙根的根端組織可能作為牙根發(fā)育的生長和調(diào)控中心，并長期存在于發(fā)育期牙根的根端。SCAP的問世正好證實了這一假說。與牙髓干細胞（DPSCs）相比，其增殖能力、端粒酶活性及細胞遷移能力均強于DPSCs。但由于根端組織涉及的干細胞非常多，如上皮根鞘細胞、根尖乳頭干細胞、牙囊干細胞、牙周膜干細胞等，故還無法完全確定。同時，患有根尖周炎癥的年輕恒牙，根端組織暴露于炎癥環(huán)境下，故了解根端組織的干細胞在炎癥環(huán)境下的生物學特性尤為重要。本研究模擬體內(nèi)炎癥環(huán)境，用炎性因子TNF-a對根尖乳頭干細胞和牙周膜干細胞進行干預，對比研究TNF-a對兩者增殖影響。

腫瘤壞死因子a（TNF-a）是一種由激活的巨噬細胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，在發(fā)生齲病、牙髓炎及根尖周炎的組織中高表達，而健康組織幾乎不表達，是參與炎癥發(fā)生發(fā)展十分重要的一種細胞因子。Yang H等發(fā)現(xiàn)TNF-a可促進SCAP細胞增殖。本研究結(jié)果顯示在lOng/ml和50ng/ml兩種濃度的TNF-a對SCAP和PDLSCs的增殖均有明顯的促進作用，但對同一細胞的兩種濃度間差異無統(tǒng)計學意義。這一特點為牙組織工程學優(yōu)良種子細胞的篩選提供了廣闊的前景；對年輕恒牙根尖周炎癥的治療帶來了新的希望。但由于本實驗涉及的實驗對象為Wistar大鼠，無法確定TNF-a對于人的牙齒與鼠的影響是否具有差異，故在炎癥條件下根尖乳頭干細胞促使人牙本質(zhì)再生的效果，還需進一步進行大量的實驗研究和臨床試驗。