PFOS對(duì)多齒圍沙蠶CYPs、GST基因轉(zhuǎn)錄及酶活性的毒性效應(yīng)

陳西，閻希柱,*，宿麗麗

1. 集美大學(xué)，廈門 361000 2. 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361000

PFOS對(duì)多齒圍沙蠶CYPs、GST基因轉(zhuǎn)錄及酶活性的毒性效應(yīng)

陳西1,2，閻希柱1,2,*，宿麗麗1,2

1. 集美大學(xué)，廈門 361000 2. 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361000

多毛類沙蠶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于海洋環(huán)境污染的生物監(jiān)測(cè)，但其對(duì)新型持久性有機(jī)污染物全氟辛烷磺酰基化合物PFOS的毒理學(xué)研究尚無(wú)報(bào)道。本研究以潮間帶優(yōu)勢(shì)種多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)為研究對(duì)象，以細(xì)胞色素P450(CYP)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的基因和酶作為聯(lián)合指標(biāo)，研究了在PFOS亞致死濃度(4、8、16 mg·L-1)暴露第1、4、7、14天及凈水恢復(fù)5 d后多齒圍沙蠶CYP431A1、CYP424A1基因轉(zhuǎn)錄水平和EROD酶活性、GST omega基因轉(zhuǎn)錄水平和GST酶活性的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，PFOS暴露對(duì)EROD的抑制具有明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；CYP2系成員CYP431A1基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)PFOS的響應(yīng)具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系并在脅迫第14天表現(xiàn)出最高的可誘導(dǎo)性；CYP4系基因CYP424A1的轉(zhuǎn)錄在4、8 mg·L-1處理組中與PFOS暴露時(shí)間正相關(guān)。II相解毒系統(tǒng)成員GST酶活和GST omega基因的響應(yīng)均表現(xiàn)出隨著PFOS脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先下降，后上升的規(guī)律；多齒圍沙蠶在高強(qiáng)度PFOS脅迫下仍可加速新陳代謝，表現(xiàn)出對(duì)PFOS的耐受性；凈水恢復(fù)階段，各指標(biāo)都有向?qū)φ战M水平恢復(fù)的趨勢(shì)。總之，基因和蛋白的響應(yīng)表明CYPs和GST在多齒圍沙蠶PFOS新陳代謝中發(fā)揮重要作用，這些基因和酶具有作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)海洋潮間帶PFOS污染效應(yīng)的潛力。

全氟辛烷磺酸化合物(PFOS)；多齒圍沙蠶；氧化損傷；細(xì)胞色素P450；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶

全氟辛烷磺?；衔?perfluorooctane sulfonate, PFOS)是最主要的全氟化污染物[1]，已經(jīng)造成全球性污染，其環(huán)境效應(yīng)也受到越來(lái)越多的關(guān)注[2]。2009年，PFOS作為新型持久性有機(jī)污染物被正式列入《斯德哥爾摩公約》附件[3]。但是PFOS仍然被制造和應(yīng)用，而且PFOS是多種全氟化合物前體的終端產(chǎn)物，有超過(guò)50類PFOS前體廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[4]，Thibodeaux等[5]指出，人類和環(huán)境仍將長(zhǎng)期處于PFOS的暴露中。PFOS在水體中的污染水平相對(duì)較低，處于納克級(jí)，但PFOS具有生物放大效應(yīng)，通過(guò)食物鏈蓄積于高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物體內(nèi)，可達(dá)毫克級(jí)水平。例如，在采集自德國(guó)海灣的斑海豹組織中含有的18種全氟化合物中，PFOS污染濃度最高，達(dá)到1.7 mgg-1[6]；Tomy等[7]檢驗(yàn)北極東部海域PFOS在食物網(wǎng)中的生物富集程度，PFOS在所有受檢物種中均存在并且污染含量最高，PFOS污染生物放大因子為0.4～9.0，表現(xiàn)出與物種營(yíng)養(yǎng)級(jí)之間顯著的線性關(guān)系。Martin等[8]在北極生物群食物鏈頂端的北極熊體內(nèi)檢測(cè)到，最高濃度達(dá)到4 mgg-1。關(guān)于我國(guó)PFOS在生物體內(nèi)污染的研究中，比較值得關(guān)注的是PFOS在海洋食品中的污染。Gulkowska等[9]以水產(chǎn)市場(chǎng)為檢測(cè)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)PFOS做為最主要的氟化污染物在27類海洋食品樣品包括軟體動(dòng)物、螃蟹、小蝦、牡蠣、蚌和蛤中均被檢出，最高污染濃度達(dá)到1.3 mgg-1。張新等[10]在大連市常見海洋產(chǎn)品如魚、蟹、烏魚中也檢測(cè)到PFOS的普遍污染。此外，因?yàn)镻FOS是眾多全氟化合物的終產(chǎn)物，經(jīng)污水處理廠處理后排放的水中，PFOS含量反而會(huì)升高。李飛等[11]檢測(cè)全氟有機(jī)酸在上海市9座污水處理廠進(jìn)水和出水中的污染情況，結(jié)果表明中等鏈長(zhǎng)(C6～C10)全氟有機(jī)酸會(huì)在污水處理過(guò)程中顯著增加，其中PFOS是主要的全氟污染物之一，濃度為最高為1.027 mgL-1占總?cè)袡C(jī)酸污染物的1%～30%。PFOS因污染持續(xù)性，蓄積性和已造成全球污染的現(xiàn)狀受到廣泛關(guān)注，亟需進(jìn)一步探討PFOS致毒機(jī)理并篩選可行的生物標(biāo)志物。

沙蠶是環(huán)節(jié)動(dòng)物門、多毛綱、沙蠶目、沙蠶科動(dòng)物的通稱，是潮間帶生態(tài)系統(tǒng)中的主要類群，在近岸水域食物網(wǎng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮重要作用。任可欣和閻希柱[12]基于沙蠶的分布廣泛性，養(yǎng)殖易得性，以及已經(jīng)表現(xiàn)出的生境修復(fù)功能將沙蠶列為現(xiàn)階段我國(guó)灘涂修復(fù)優(yōu)勢(shì)種。目前已經(jīng)開展了多毛類沙蠶分子生物標(biāo)志物對(duì)多種重金屬污染和有機(jī)污染指示的研究。研究表明，沙蠶在養(yǎng)殖底泥[13]，蝦池水質(zhì)[14]，河口的泥水界面[15]的生境修復(fù)中發(fā)揮重要作用。尚無(wú)探討潮間帶優(yōu)勢(shì)種多齒圍沙蠶作為PFOS污染指示物種可行性的研究。

胞色素P450(cytochrome P450, CYP)屬于Ⅰ相解毒系統(tǒng)，在內(nèi)源性基質(zhì)生物轉(zhuǎn)化和催化作用中發(fā)揮重要作用，還可將脂溶性有機(jī)異生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為水溶性、易排泄的代謝產(chǎn)物，幾乎存在于生物體內(nèi)的所有組織[16]，由于CYPs可對(duì)低劑量的外源污染物產(chǎn)生響應(yīng)，這使得利用CYPs酶活性或基因表達(dá)量指示低劑量PFOS生態(tài)毒理診斷成為可能[17-18]。7-乙氧基異吩惡唑-O-脫乙基酶(EROD)的活性可以用來(lái)表示對(duì)CYP1A1亞型的誘導(dǎo)作用[19]。目前以EROD酶為代表的CYPs作為生物標(biāo)志物反映污染脅迫效應(yīng)在不同生物中得到驗(yàn)證。Oost等[20]因EROD在肝臟中表現(xiàn)出的敏感性而將其列為最有價(jià)值的魚類生物標(biāo)志物。目前已經(jīng)開展EROD酶作為多種持久性有機(jī)污染物如二噁英[21]、多氯聯(lián)苯[22]、苯并(a)芘[23]等的生物標(biāo)志物的研究。但是在復(fù)雜的污染海域，如果僅僅應(yīng)用EROD活性這一個(gè)生物標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)和評(píng)估海洋環(huán)境污染及其效應(yīng)狀況將具有一定的局限性，有可能出現(xiàn)指標(biāo)與環(huán)境污染程度不完全一致的情況[19]。CYPs蛋白與基因水平的聯(lián)合指示對(duì)野外生境污染物的監(jiān)測(cè)更具有實(shí)際意義。然而與脊椎動(dòng)物不同，無(wú)脊椎動(dòng)物尚未克隆得到CYP1A序列，至今只鑒定得到十幾條多毛綱動(dòng)物的CYPs基因[24-25]。CYP431A1由Won等[26]克隆，屬于CYP2系成員，與脊椎動(dòng)物CYP1家族屬于同一系，該研究探究了多齒圍沙蠶CYPs基因作為多環(huán)芳烴(PAHs)生物指示物的可行性，結(jié)果顯示CYP431A1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比上調(diào)800倍，并具有良好的劑量效應(yīng)。推斷多齒圍沙蠶CYP2系基因CYP431A1在代謝親水性PAHs毒性中發(fā)揮顯著作用，提供了環(huán)境監(jiān)測(cè)評(píng)估的可能性，但多齒圍沙蠶CYP431A1外源性物質(zhì)新陳代謝中各種生化功能仍不清楚，需要更多沙蠶CYP2系基因的研究。CYP424A1基因由Zheng等[27]克隆，歸類于新的CYPs家族但屬于CYP4系成員。研究發(fā)現(xiàn)該基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)PAHs脅迫表現(xiàn)出了最高的可誘導(dǎo)性(12倍)并指出CYP424A1可能在外源性物質(zhì)解毒過(guò)程中扮演著較為活躍的角色。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)是廣泛分布于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)的一組多功能同工酶，屬于Ⅱ相解毒酶。GST能催化過(guò)氧化物的還原反應(yīng)，促進(jìn)GSH的巰基(-SH)與毒素結(jié)合形成親電子試劑[28]從而減輕污染物毒性。廈門島周圍F個(gè)采樣點(diǎn)僧帽牡蠣消化腺和鰓中GST的活性與整個(gè)組織石油碳?xì)浠衔锏暮坑泻芎玫南嚓P(guān)性[29]。Cairr?o等[30]的一項(xiàng)研究認(rèn)為用墨角藻GST活性作為環(huán)境生物標(biāo)志物進(jìn)行沿海地區(qū)和港灣污染監(jiān)測(cè)是可行的。GST基因含有多個(gè)成員，GST omega基因在多齒圍沙蠶對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)中具有高的敏感性和劑量-效應(yīng)關(guān)系，被認(rèn)為是多齒圍沙蠶最具有潛力的分子生物標(biāo)志物之一[31]。

本文首次研究了潮間帶這一重要生態(tài)系統(tǒng)中多齒圍沙蠶CYPs及GST在PFOS脅迫下基因(CYP431A1、CYP424A1、GST omega)，酶活性(EROD、GST)的聯(lián)合響應(yīng)，以期建立量效關(guān)系，為評(píng)價(jià)PFOS污染效應(yīng)提供依據(jù)，探究二者在PFOS新陳代謝中可能的功能和解毒機(jī)理。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和儀器

主要試劑包括全氟辛烷磺酸鉀(C8F17KO3S)，純度AR級(jí)(Tokyo公司)。蛋白定量試劑盒，GST酶活性試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，7-乙氧基異吩噁唑酮(ERF)，異吩噁唑酮(RF)均購(gòu)自sigma公司。Trizol，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，回收試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒均購(gòu)自Takara公司。助溶劑二甲基亞砜(DMSO)及其他試劑為市售AR級(jí)分析純。使用的主要儀器包括熒光分光光度計(jì)(Cary Eclipse，美國(guó)Varian)；酶標(biāo)儀(Synergy HT，美國(guó)BioTek)；熒光定量PCR儀(Fast step one，美國(guó)ABI)。

1.2 暴露實(shí)驗(yàn)

受試動(dòng)物多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)購(gòu)自福建省福清沙蠶養(yǎng)殖場(chǎng)。健康成體沙蠶在潔凈海水(鹽度30‰；溫度(22±1) °C；pH 7.8；DO (6.5±0.5) mg·L-1)中暫養(yǎng)7 d，海水取自集美大學(xué)海水養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)4層紗布過(guò)濾并煮沸冷卻后用于試驗(yàn)，期間不斷曝氣。餌料為凡納濱對(duì)蝦餌料，顆粒粒徑粉碎為60目后投喂，每日喂食2次及時(shí)清理死亡個(gè)體。24 h饑餓處理后挑取規(guī)格一致的沙蠶(0.45 g±0.05 g)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)期間停止喂食。

實(shí)驗(yàn)在500 mL燒杯中進(jìn)行，鋪2 cm經(jīng)450 ℃灼燒6 h的細(xì)沙。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以PFOS對(duì)多齒圍沙蠶96 h-LC50(64 mgL-1)的1/4，1/8，1/16為暴露濃度(DMSO助溶，終濃度0.01%)，以DMSO(終濃度0.01%)海水組和空白海水組做對(duì)照，脅迫14 d后，各處理組轉(zhuǎn)入潔凈海水中進(jìn)行凈水恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，每天換液一次并晝夜曝氣。每個(gè)處理取3個(gè)平行樣，各放入10條沙蠶，加溶液20 mL。于暴露實(shí)驗(yàn)的第1、4、7、14天以及凈水恢復(fù)的第5天(圖中用r5表示)活體取樣。暴露期間，沙蠶出現(xiàn)行動(dòng)遲緩等癥狀，但存活狀況良好未發(fā)現(xiàn)該脅迫強(qiáng)度下有死亡個(gè)體。

1.3 酶活性的測(cè)定

稱取沙蠶除頭部以外的組織樣品(30 mg±1.5 mg)加1.5 mL預(yù)冷的勻漿液(磷酸緩沖液，pH 7.6)，在冰浴中每勻漿15 s，暫停30 s，循環(huán)3次，立即冷凍離心(-4 ℃，10 000 r·min-1，20 min)，取上清液立即測(cè)EROD酶活和總蛋白質(zhì)含量。根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]的方法稍加改進(jìn)，測(cè)EROD酶活性。反應(yīng)溫度為室溫20 ℃，反應(yīng)總體系中含磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.6)3 mL，待測(cè)酶樣200 μL，ERF(0.40 mmol·L-1)20 μL。反應(yīng)通過(guò)加入NADPH(0.25 mmol·L-1)20 μL啟動(dòng)。激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm，反應(yīng)開始后每隔30 s記錄產(chǎn)物RF熒光值至5 min。繪制RF標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所測(cè)得的數(shù)據(jù)作線性回歸，求其產(chǎn)物每分鐘的變化情況，經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)歸一化處理后，即可計(jì)算出其活性，酶活單位為pmol·min-1·mg prot-1。GST酶活性和總蛋白含量的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒，GST酶活性數(shù)據(jù)來(lái)自實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表的成果，所有暴露實(shí)驗(yàn)條件及方法與本研究一致。

1.4 基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

取沙蠶除頭部以外的組織樣品(100 mg±5 mg)于液氮中研磨，每個(gè)處理取3個(gè)平行樣，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取樣品總RNA，并根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳以及樣品A260/280比值判斷總RNA質(zhì)量與完整度，測(cè)定RNA濃度，以1 000 ng的總RNA為初始模板合成cDNA。

多齒圍沙蠶內(nèi)參基因18S rRNA，CYPs基因CYP431A1、CYP424A1、GST基因GST omega通過(guò)Primer primer 5.0設(shè)計(jì)并由華大基因合成，引物序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢驗(yàn)引物是否可以單一特異性擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行梯度稀釋，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值檢驗(yàn)引物的擴(kuò)增效率。

熒光定量PCR反應(yīng)體系包括模板cDNA 1 μL，SYBR Premix EX Taq 10 μL，PCR上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX Dye 0.4 μL，雙蒸水7 μL，配制20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)生物學(xué)平行做3個(gè)復(fù)孔。

表1 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR中檢測(cè)CYPs和GST mRNAs的引物序列Table 1 Primer sequences for CYPs and GST mRNAs in RT-real time PCRs

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果最終確定反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行LSD多重分析，“*”、“**”表示處理組與對(duì)照組差異顯著，顯著性水平為P<0.05、P<0.01。實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果(Results)

通過(guò)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)助溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組中的多齒圍沙蠶各指標(biāo)的響應(yīng)無(wú)顯著差異，表明0.01%的DMSO對(duì)指標(biāo)的變化沒有影響。以下分析PFOS對(duì)多齒圍沙蠶CYPs、GST酶活性和基因表達(dá)的影響時(shí)選取助溶劑對(duì)照組作為參照。對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊性的要求。

圖1 PFOS對(duì)多齒圍沙蠶EROD酶活性的影響注：r5表示凈水恢復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5 d。*、**表示與二甲基亞砜(DMSO)溶劑對(duì)照相比，差異顯著，P<0.05、P<0.01。下同。Fig. 1 The response of EROD activity of P. nuntia exposed to PFOSNote: r5 means the 5-day recovery period. *, ** mean the statistical difference from control (DMSO) group at P<0.05 and P<0.01 respectively. Similarly hereinafter.

2.1 PFOS對(duì)多齒圍沙蠶EROD酶活性和CYPs基因相對(duì)表達(dá)的影響

本研究測(cè)定的RF濃度與熒光強(qiáng)度F值(x)具有良好的線性關(guān)系，y=0.00094x+0.13391，R2=0.997。PFOS脅迫下多齒圍沙蠶EROD酶活性變化如圖1。與對(duì)照組相比，EROD酶活性總體處于被抑制的狀態(tài)，脅迫第1天時(shí)EROD活性被顯著抑制(P<0.01)，第4天時(shí)有所上升但仍低于對(duì)照水平。在7～14 d脅迫階段，不同處理組EROD酶活性均表現(xiàn)出線性下降趨勢(shì)，隨著脅迫時(shí)間增加PFOS對(duì)EROD酶活性的抑制程度逐步上升。脅迫過(guò)程中EROD酶活性普遍在低濃度4 mg·L-1處理組中具有更高的抑制率。凈水處理階段EROD的酶活性有所恢復(fù)，各處理組分別為脅迫第14天的1.98、2.70、1.63倍。

利用RT-real time PCRs檢測(cè)多齒圍沙蠶暴露于不同濃度PFOS在不同時(shí)間CYP431A1、CYP424A1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的變化情況(圖2)。結(jié)果顯示，CYP431A1基因的表達(dá)(圖2A)具有一定的劑量效應(yīng)，相同脅迫時(shí)間內(nèi)，基因表達(dá)量隨脅迫濃度的增加呈遞增趨勢(shì)。在脅迫初期第1天基因CYP431A1表達(dá)量顯著(P<0.01)上升且在16 mg·L-1濃度處理組表現(xiàn)更加明顯，達(dá)到對(duì)照組的12倍，在4、7 d的脅迫中，在各劑量組中該基因的表達(dá)受到了一定的抑制，但與相應(yīng)的對(duì)照組比較，高劑量處理組中該基因上調(diào)表達(dá)仍然呈現(xiàn)出顯著差異(P<0.01)。脅迫第14天各處理組表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著(P<0.01)上調(diào)，3個(gè)處理組CYP431A1表達(dá)量分別達(dá)到對(duì)照組的45、51、80倍。凈水恢復(fù)5 d后基因表達(dá)量明顯下降。

圖2B中，同一濃度下隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組CYP424A1基因相對(duì)表達(dá)量總體上出現(xiàn)上調(diào)，呈現(xiàn)出該基因表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高的趨勢(shì)。其中，4 mg·L-1處理組在脅迫1～4 d與對(duì)照組無(wú)顯著差異，在脅迫第7、14天分別達(dá)到對(duì)照組的2倍、5倍；8 mg·L-1處理組在脅迫1～7 d與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但在第14天與對(duì)照組差異顯著(P<0.01)并達(dá)到對(duì)照組的3倍；16 mg·L-1處理組基因表達(dá)量在脅迫1～7 d也出現(xiàn)線性增長(zhǎng)，在脅迫第14天被抑制。CYP431A1基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。但PFOS脅迫與該基因表達(dá)含量之間并未出現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，普遍結(jié)果表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的升高基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)，凈水恢復(fù)5 d后該基因表達(dá)量有所下降。

2.2 PFOS脅迫對(duì)多齒圍沙蠶GST酶活性和GST基因相對(duì)表達(dá)量的影響

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)，GST酶活性在PFOS脅迫第1天的低濃度4 mg·L-1處理組中被顯著抑制(P<0.05)，抑制率為50%；在中濃度8 mg·L-1處理組也被顯著抑制(P<0.01)，抑制率為70%；但在高濃度16 mg·L-1處理下活性有所上升。該特征也體現(xiàn)在時(shí)間-效應(yīng)中，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)GST酶活性被抑制，但在脅迫后期14 d時(shí)各處理組均有所上升，雖然8 mg·L-1濃度處理組GST酶活性仍低于對(duì)照，但相較于脅迫第7天上升了1.3倍，14 d時(shí)已基本回到對(duì)照水平(P>0.05)，而14 d時(shí)4、16 mg·L-1濃度處理組則顯著高于對(duì)照水平(P<0.05)。在凈水恢復(fù)后5 d，除中濃度處理組外，GST酶活性有恢復(fù)正常表達(dá)的趨勢(shì)。

除脅迫第1天，4 mg·L-1處理組以外，各脅迫情況下GST基因相對(duì)表達(dá)量(圖4)始終高于對(duì)照組，表明GST基因參與到了PFOS的外源性物質(zhì)代謝中。GST基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)，總體表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的升高而升高。8 mg·L-1和16 mg·L-1處理組出現(xiàn)了相似的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，均在脅迫1～4 d有所上升，在脅迫第7天被抑制，在脅迫后期第14天出現(xiàn)了顯著的上升(P<0.01)；而低濃度4 mg·L-1處理下，GST基因相對(duì)表達(dá)量在1～4 d期間顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，7～15 d期間表達(dá)量持續(xù)上調(diào)與對(duì)照組差異顯著(P<0.01)。不同處理組GST表達(dá)量均在第14天顯著上調(diào)并達(dá)到最高值，分別為對(duì)照組的6、8、7倍。凈水恢復(fù)后5 d，GST表達(dá)量有所下降，其中4、8 mg·L-1處理組下降到對(duì)照水平，16 mg·L-1處理組仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 PFOS對(duì)多齒圍沙蠶CYPs基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 2 The response of CYPs mRNA relative expression of P. nuntia exposed to PFOS

圖3 PFOS對(duì)多齒圍沙蠶GST酶活性的影響Fig. 3 The response of GST activity of P. nuntia exposed to PFOS

圖4 PFOS對(duì)多齒圍沙蠶GST基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 4 The response of GST mRNA relative expression of P. nuntia exposed to PFOS

3 討論(Discussion)

本研究中，EROD活性與對(duì)照組相比總體處于被抑制的狀態(tài)，脅迫第1天各處理組酶活性與對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異(P<0.01)，但隨著PFOS脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)EROD活性反而有所恢復(fù)，第4天時(shí)已恢復(fù)到正常水平，酶活性恢復(fù)到一定程度后隨著脅迫時(shí)間的延續(xù)而降低。同一濃度組的EROD酶活性隨時(shí)間均呈現(xiàn)出先上升后下降的鐘形曲線，這種趨勢(shì)反映PFOS暴露初期可以對(duì)EROD酶活性產(chǎn)生抑制，機(jī)體可以通過(guò)恢復(fù)CYP1A1酶活性并與PFOS結(jié)合，增加外源性物質(zhì)極性。但隨著代謝產(chǎn)物的增加，仍對(duì)CYP1A1酶活性產(chǎn)生抑制，這種抑制趨勢(shì)可以在凈水恢復(fù)階段得到緩解。在PFOS對(duì)赤子愛勝蚯蚓脅迫的研究中，細(xì)胞色素450含量與其他抗氧化防御系統(tǒng)酶如過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)相比也表現(xiàn)出更強(qiáng)的敏感性[32]。值得注意的是，在4～14 d的后期脅迫中各處理組EROD酶活性均呈下調(diào)趨勢(shì)，酶活性與脅迫時(shí)間具有良好的線性關(guān)系，R2值分別為0.85(4 mgL-1)、0.96(8 mgL-1)、0.91(16 mgL-1)。結(jié)果表明PFOS脅迫強(qiáng)度與多齒圍沙蠶EROD酶活性的抑制之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系，因此，多齒圍沙蠶EROD酶活性的抑制程度有作為環(huán)境污染指標(biāo)的潛力。一些研究已經(jīng)表明PFOS暴露無(wú)法誘導(dǎo)動(dòng)物CYP1A[33-34]。Hu(2003)等[34]通過(guò)測(cè)定EROD酶活性發(fā)現(xiàn)PFOS單獨(dú)脅迫無(wú)法誘導(dǎo)CYP1A1的表達(dá)。本研究EROD活性始終處于被抑制狀態(tài)與之結(jié)果相似。以EROD酶抑制率作為高強(qiáng)度脅迫下污染等級(jí)的評(píng)價(jià)指標(biāo)還需要更深入的統(tǒng)計(jì)。

CYP2系基因CYP431A1 mRNA在PFOS脅迫初期就表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)，最高濃度組(16 mgL-1)達(dá)到對(duì)照的12倍，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的表達(dá)逐漸恢復(fù)初始水平，在脅迫后期第14天，最高濃度組達(dá)到對(duì)照組的80倍表現(xiàn)出顯著的可誘導(dǎo)性(P<0.01)。這表明CYP431A1可能參與機(jī)體在損傷初期的氧化應(yīng)激保護(hù)和損傷后期的外源性物質(zhì)代謝。在脊椎動(dòng)物和一些昆蟲中，CYP2系(如CYP1、CYP2家族)包含大量功能的酶可在不同藥物和外源性物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[35]。本研究與Won等[26]的研究結(jié)果相似，顯著上調(diào)的CYP431A1表明多齒圍沙蠶CYP2系對(duì)PFOS所引起的損傷最為敏感。Rewitz等[36]的研究表明海濱螃蟹(Carcinus maenas)CYP2系CYP330A1基因可被苯巴比妥和苯并芘(BaP)誘導(dǎo)并指出CYP2系在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中有相似功能的酶。Brinkworth和Hodson[37]報(bào)道了虹鱒魚CYP2系酶可能參與低分子量外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。CYP431A1與脊椎動(dòng)物CYP1家族屬于同一系[26]，PFOS對(duì)真鯛CYP1A1誘導(dǎo)結(jié)果表明[38]，CYP1A1參與PFOS代謝是由多環(huán)芳烴受體AhR所介導(dǎo)的，這與大部分研究結(jié)果相似，真鯛CYP1A1基因在高濃度PFOS脅迫(2 mgL-1)和長(zhǎng)時(shí)間(7 d )脅迫下均呈現(xiàn)被抑制的趨勢(shì)，CYP1A1在PFOS低強(qiáng)度脅迫下的表達(dá)更為活躍。PFOS對(duì)斑馬魚肝臟內(nèi)CYP1A基因的誘導(dǎo)也呈現(xiàn)隨濃度升高先上升后回落的趨勢(shì)[39]。本研究中，CYP431A1在PFOS前7 d脅迫下表達(dá)水平也表現(xiàn)為先顯著上升后下降，與魚類CYP1A參與PFOS代謝的表達(dá)趨勢(shì)部分吻合，暗示CYP431A1可能在多齒圍沙蠶外源物質(zhì)代謝中發(fā)揮著與脊椎動(dòng)物CYP1A相似的作用。

與CYP431A1相比，PFOS脅迫下多齒圍沙蠶CYP4系基因CYP424A1并沒有特別突出的誘導(dǎo)量，但是該基因表達(dá)具有一定的時(shí)間效應(yīng)，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，不同濃度組總體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。哺乳動(dòng)物中，CYP4酶催化脂肪酸末端羥基化并且活躍多類有毒物質(zhì)新陳代謝，昆蟲CYP4基因參與外源性物質(zhì)的新陳代謝，并且可能參與了對(duì)殺蟲劑的抵抗[27]。與Li等[24]在小頭蟲(Capitella capitata)，趙歡等[40]在雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)上的研究結(jié)果相似，CYP4在多毛綱的表達(dá)誘導(dǎo)程度較低，但鑒于CYP424A1表達(dá)的持續(xù)上調(diào)，推斷該基因在PFOS代謝中仍處于較活躍的位置。CYP424A1構(gòu)型和脊椎動(dòng)物CYP3A基因非常相似[27]，CYP3A酶同樣在魚腸道外源性食物的首過(guò)代謝中扮演著重要角色[41]。多齒圍沙蠶CYP424A1表達(dá)量在PFOS脅迫后期(14 d)對(duì)低濃度脅迫更為敏感，而高濃度脅迫使其表達(dá)量下降到與對(duì)照組無(wú)顯著差異的水平。推測(cè)多齒圍沙蠶CYP4系CYP424A1基因在高強(qiáng)度脅迫下甚至?xí)霈F(xiàn)被抑制的可能，當(dāng)然這需要更寬PFOS濃度的脅迫來(lái)證實(shí)它的轉(zhuǎn)錄抑制性。結(jié)果表明多齒圍沙蠶CYP424A1更適合做為低劑量長(zhǎng)期PFOS暴露下的參選標(biāo)記。

EROD酶活性以及CYPs基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)PFOS的響應(yīng)表明多齒圍沙蠶CYP1A1亞族、CYP2系以及CYP4系成員是可對(duì)外源性物質(zhì)的脅迫產(chǎn)生響應(yīng)的。這三者分屬于CYPs不同家族，響應(yīng)模式的差異可能受以下2個(gè)方面的影響：(1)與CYPs不同成員自身與基質(zhì)親和力差異有關(guān)。例如，Kurt和Kathleen[42]的研究表明CYP2系(CYP2E)和CYP3系(CYP3A4)酶分別與人類小分子親水性化合物和親脂性的化合物具有更高的親和力。(2)Skupinska等[43]指出CYPs超家族不同成員的響應(yīng)可能受不同受體通路的誘導(dǎo)。該差異也說(shuō)明，以EROD作為單一指標(biāo)進(jìn)行污染物監(jiān)測(cè)的結(jié)果可能無(wú)法概括生物體受污染狀態(tài)的全貌。從EROD反映的結(jié)果來(lái)看，在本研究的濃度范圍內(nèi)PFOS脅迫下機(jī)體解毒酶處于被抑制狀態(tài)，但從CYP2系基因的高表達(dá)和CYP4系基因表達(dá)量的持續(xù)上調(diào)來(lái)看沙蠶此時(shí)仍處于積極防御狀態(tài)。結(jié)果表明沙蠶CYPs參與到了PFOS的解毒代謝中，其中CYP2系基因扮演的角色尤為活躍，與Won等結(jié)果一致[26]。

本研究以II相解毒酶的代表GST為研究對(duì)象，探究PFOS代謝過(guò)程中II相解毒酶的響應(yīng)情況。GST基因含有多個(gè)成員，多齒圍沙蠶GST omega基因在鎘、銅污染指示中均表現(xiàn)出良好的可行性[44]，是多齒圍沙蠶極具潛力的分子生物標(biāo)志物之一[31]。本研究GST酶活性總體上處于被抑制或無(wú)顯著變化水平，而GST omega基因則受到誘導(dǎo)，與對(duì)照組產(chǎn)生顯著變化(P<0.01)。但GST酶活性的抑制趨勢(shì)在脅迫第14天得到恢復(fù)，其中4、16 mg·L-1濃度組均顯著高于對(duì)照水平，而8 mg·L-1濃度處理組也從顯著抑制狀態(tài)恢復(fù)到對(duì)照水平，這種上調(diào)趨勢(shì)與基因GST omega轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)出現(xiàn)較為一致的趨勢(shì)，在脅迫后期7～14 d顯著上升。PFOS暴露后期，GST酶活性和GST omega基因的上調(diào)表明PFOS誘導(dǎo)的Ⅱ相解毒是由CYPs基因及酶進(jìn)行I相解毒反應(yīng)所誘導(dǎo)，并且在本研究的濃度范圍內(nèi)PFOS脅迫仍可以加速多齒圍沙蠶體內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)形成的親電子劑的代謝解毒，清除體內(nèi)形成的氧化還原產(chǎn)物和氧自由基[45]。

PFOS作為外源性物質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中，多齒圍沙蠶I相解毒系統(tǒng)CYP450，II相解毒系統(tǒng)GST的酶和基因在抗氧化防御機(jī)制中扮演重要角色。雖然脊椎動(dòng)物CYPs的多環(huán)芳烴受體AhR同系物在無(wú)脊椎動(dòng)物如果蠅和線蟲中被鑒定，它們和脊椎動(dòng)物有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域，但它們?nèi)鄙俚湫偷奶囟ǜ哂H和性芳烴受體(AhRs)配體粘合物[46]。Yadetie等[47]也指出被囊類動(dòng)物CYPs基因參與苯并a芘代謝是受其他核受體的誘導(dǎo)，Zheng等[48]則探究了多毛類以孕烷X受體PXR，核受體CAR為核受體的可能性。PFOS通過(guò)干擾多齒圍沙蠶CYPs通路受體對(duì)機(jī)體I相解毒反應(yīng)系統(tǒng)的觸發(fā)，以及EROD酶活及2類CYPs基因在誘導(dǎo)初期的快速應(yīng)答均反映了多齒圍沙蠶CYP450參與了PFOS初級(jí)代謝，降低PFOS的親脂性，增加水溶性。隨后受到CYPs代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)，II相解毒酶GST也參與了PFOS的代謝，催化極性基團(tuán)與之共價(jià)結(jié)合，增加代謝物疏水性以促進(jìn)PFOS的代謝。目前，仍需探索PFOS脅迫下多齒圍沙蠶的核受體。此外，CYPs單氧酶經(jīng)常催化外源性物質(zhì)分解成更多的有毒代謝物，這需要聯(lián)合其他抗氧化機(jī)制研究PFOS的致毒機(jī)理，并進(jìn)一步探究多齒圍沙蠶對(duì)PFOS的代謝機(jī)制。

綜上所述，本研究探究了多齒圍沙蠶I相，II相解毒系統(tǒng)在PFOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化損傷中發(fā)揮的保護(hù)作用。研究結(jié)果為PFOS污染預(yù)警提供了可參考的標(biāo)志物，并且為PFOS暴露下CYPs和抗氧化酶及基因所參與的機(jī)制研究依提供了依據(jù)。

致謝：感謝國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“封閉海灣典型生境物理修復(fù)和生物修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)研究與集成示范”子課題封閉海灣灘涂多毛類修復(fù)集成技術(shù)研究與示范(201205009-4)對(duì)本研究給予的經(jīng)費(fèi)支持。

[1] Houde M, Czub G, Small J M, et al. Fractionation and bioaccumulation of perfluorooctane sulfonate (PFOS) isomers in a Lake Ontario food web [J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42(24): 9397-9403

[2] Lindstrom A B, Strynar M J, Libelo E L. Polyfluorinated compounds: Past, present, and future [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(19): 7954-7961

[3] 武曄, 海熱提. PFOS的禁用及其處理處置技術(shù)[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2011(S1): 352-357

Wu Y, Hai R T. The disabled PFOS and its disposal technology [J]. Environmental Science & Technology, 2011(S1): 352-357 (in Chinese)

[4] Pelley J. Canada moves to eliminate PFOS stain repellents [J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(23): 452A

[5] Thibodeaux J R, Hanson R G, Rogers J M, et al. Exposure to perfluorooctane sulfonate during pregnancy in rat and mouse. I: Maternal and prenatal evaluations [J]. Toxicological Sciences, 2003, 74(2): 382-392

[6] Ahrens L, Siebert U, Ebinghaus R. Temporal trends of polyfluoroalkyl compounds in harbor seals (Phoca vitulina) from the German Bight, 1999-2008 [J]. Chemosphere, 2009, 76(2): 151-158

[7] Tomy G T, Budakowski W, Halldorson T, et al. Fluorinated organic compounds in an eastern Arctic marine food web [J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(24): 6475-6481

[8] Martin J W, Smithwick M M, Braune B M, et al. Identification of long-chain perfluorinated acids in biota from the Canadian Arctic [J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(2): 373-380

[9] Gulkowska A, Jiang Q, So M K, et al. Persistent perfluorinated acids in seafood collected from two cities of China [J]. Environmental Science & Technology, 2006, 40(12): 3736-3741

[10] 張新, 劉薇, 金一和. 大連沿海常見海產(chǎn)品PFOS和PFOA的暴露水平調(diào)查[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2012(8): 104-106

Zhang X, Liu W, Jin Y H. Investigation of exposure level of PFOS and PFOA in the body of marine animals in Dalian coastal waters [J]. Environmental Science & Technology, 2012(8): 104-106 (in Chinese)

[11] 李飛, 曾慶玲, 沈春花, 等. 上海市市政污水中全氟有機(jī)酸污染特征[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2012, 32(9): 1602-1612

Li F, Zeng Q L, Shen C H, et al. Pollution profiles of perfluorinaed acids in municipal sewage in Shanghai, China [J]. China Environmenal Science, 2012, 39(9): 1602-1612 (in Chinese)

[12] 任可欣, 閻希柱. 沙蠶在海洋灘涂生境修復(fù)中的應(yīng)用與展望[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2013, 26(2): 63-68

Ren K X, Yan X Z. Application and prospect of environmental bioremediation at marine tideflat with nereis [J]. Chinese Journal of Fisheries, 2013, 26(2): 63-68 (in Chinese)

[13] 江小桃, 譚燁輝, 柯志新, 等. 投放雙齒圍沙蠶和馬尾藻對(duì)養(yǎng)殖底泥上覆水氮、磷含量的影響[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào), 2012, 31(4): 129-134

Jiang X T, Tan Y H, Ke Z X, et al. Effects of introduction of Perinereis aibuhitensis and Sargassum hemiphyllum on nitrogen and phosphorus in overlying water [J]. Journal of Tropical Oceanography, 2012, 31(4): 129-134 (in Chinese)

[14] Rainbow P S. Biomonitoring of heavy metal availability in the marine environment [J]. Environmental Pollution, 1995, 31(4-12): 183-192

[15] Bergstr?m M, Muhr C, Jossan S, et al. Preliminary data on the bioturbation activity of Hediste diversicolor (Polychaeta, Nereididae) from the Loire Estuary, France [J]. Open Marine Biology Journal, 2012, 6(6): 53-56

[16] 蔡文超, 黃韌, 李建軍, 等. 生物標(biāo)志物在海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用及特點(diǎn)[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 33(2): 137-146

Cai W C, Huang R, Li J J, et al. Applications and characteristics of biomarkers on monitoring of marine environmental pollution [J]. Journal of Hydroecology, 2012, 33(2): 137-146 (in Chinese)

[17] Binelli A, Ricciardi F, Riva C, et al. New evidences for old biomarkers: Effects of several xenobiotics on EROD and AChE activities in zebra mussel (Dreissena polymorpha) [J]. Chemosphere, 2006, 62(4): 510-519

[18] 王磊, 宋玉芳, 張薇, 等. 蚯蚓(Eisenia fetida)細(xì)胞色素P450及抗氧化酶系對(duì)環(huán)境濃度苯并(a)芘的響應(yīng)[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 28(2): 337-342

Wang L, Song Y F, Zhang W, et al. Influence of benzo(a) pyrene on cytochrome P450 and antioxidant enzyme in earthworms (Eisenia fetida) [J]. Journal of Agro-environment Science, 2009, 28(2): 337-342 (in Chinese)

[19] 張玉生, 鄭榕輝, 陳清福. 褐菖鲉肝CYP 1A作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)廈門海域石油污染狀況[J]. 2011, 31(19): 5851-5859

Zhang Y S, Zheng R H, Chen F Q. A study on application of hepatic microsomal CYP1A biomarkers from Sebastiscus marmoratus to monitoring oil pollution in Xiamen waters [J]. Actaecologica Sinica, 2011, 31(19): 5851-5859 (in Chinese)

[20] Oost R V D, Beyer J, Vermeulen N P E. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review [J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2003, 13(2): 57-149

[21] 黎雯, 徐盈, 吳文忠, 等. 魚肝EROD酶活力誘導(dǎo)作為二噁英的水生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)[J]. 2000, 24(3): 201-207

Li W, Xu Y, Wu W Z, et al. Introduction of EROD activity in fish liver as a bioindicator for dioxin-link compounds in aquatic system [J]. Actaecologica Hydrobiologica Sinica, 2000, 24(3): 201-207 (in Chinese)

[22] 任加云, 李樹峰. 多氯聯(lián)苯(PCB-1254)對(duì)櫛孔扇貝消化盲囊和鰓絲EROD、GST酶活力的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2008, 15(2): 342-346

Ren J Y, Li S F. Effects of polychlorinated biphenyls 1254 (PCB-1254) on two enzyme activity of biotransformation in digestive gland and gills of scallop Chlamys ferrari [J]. Journal of Fishery Science, 2008, 15(2): 342-346 (in Chinese)

[23] 穆景利, 王新紅, 王淑紅, 等. 苯并(a)芘影響黑鯛肝臟EROD活性變化的動(dòng)力學(xué)研究[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(1): 68-71

Mu J L, Wang X H, Wang S H, et al. Study on the kinetics of hepatic EROD activities in black porgy (Sparusmacro cephalus) exposed to benzo(a)pyrene [J]. Marine Science, 2009, 33(1): 68-71 (in Chinese)

[24] Li B, Bisgaard H C, Forbes V E. Identification and expression of two novel cytochrome P450 genes, belonging to CYP4 and a new CYP331 family, in the polychaete Capitella capitata sp.I [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2004, 325(2): 510-517

[25] J?rgensen A, Rasmussen L J, Andersen O. Characterisation of two novel CYP4 genes from the marine polychaete Nereis virens and their involvement in pyrene hydroxylase activity [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2005, 336(3): 890-897

[26] Won E J, Rhee J S, Shin K H, et al. Expression of three novel cytochrome P450 (CYP) and antioxidative genes from the polychaete,Perinereis nuntia exposed to water accommodated fraction (WAF) of Iranian crude oil and benzo[α]pyrene [J]. Marine Environmental Research, 2013, 90(106): 211-223

[27] Zheng S, Chen B, Qiu X, et al. Three novel cytochrome P450 genes identified in the marine polychaete Perinereis nuntia and their transcriptional response to xenobiotics [J]. Aquatic Toxicology, 2013, 134-135C(12): 11-22

[28] 程煒軒, 梁旭方, 李觀貴, 等. 鱖魚兩種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因cDNA的克隆與分析[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4(4): 537-543

Cheng W X, Liang X F, Li G G, et al. Molecular cloning and sequence analysis of alpha- and Rho-classes of glutathione S-transterases in Chinese Perch (Siniperca chuatsi) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2009, 4(4): 537-543 (in Chinese)

[29] Chen R, Zheng W Y, Yu Q, et al. Effect of oil pollution on gluthione and relative enzyme in oyster (Saccostrea cuculiata) [J]. Acta Oceanologica Sinica, 2003, 22(1): 145-150

[30] Cairr?o E, Couderchet M, Soares A M V M, et al. Glutathione- S -transferase activity of Fucus spp. as a biomarker of environmental contamination [J]. Aquatic Toxicology, 2004, 70(4): 277-286

[31] Won E J, Kim R O, Rhee J S, et al. Response of glutathione S -transferase (GST) genes to cadmium exposure in the marine pollution indicator worm, Perinereis nuntia [J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part C Toxicology & Pharmacology, 2011, 154(2): 82-92

[32] 姚洪偉, 沈根祥, 朱江, 等. 全氟辛烷磺酸對(duì)蚯蚓體內(nèi)4種酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2013(4): 5-8

Yao H W, Shen G X, Zhu J, et al. Activity of antioxidant enzymes of PFOS pollution on Eisenia foetida [J]. Environmental Science and Technology, 2013(4): 5-8 (in Chinese)

[33] Hu W, Jones P D, Celius T, et al. Identification of genes responsive to PFOS using gene expression profiling [J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2005, 19(1): 57-70

[34] Hu W Y, Jones P D, Decoen W, et al. Alterations in cell membrane properties caused by perfluorinated compounds [J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part C Toxicology & Pharmacology, 2003, 135(1): 77-88

[35] Nebert D W, David W. Clinical importance of the cytochromes P450 [J]. Lancet, 2002, 360(9340): 1155-1162

[36] Rewitz K, Styrishave B, Andersen O. CYP330A1 and CYP4C39 enzymes in the shore crab Carcinus maenas: Sequence and expression regulation by ecdysteroids and xenobiotics [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2003, 310(2): 252-260

[37] Brinkworth L C, Hodson P V. CYP1A induction and blue SAC disease in early developmental stages of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to retene [J]. Journal of Toxicology & Environmental Health Part A, 2003, 66(7): 627-646

[38] 王賀威. 全氟辛烷磺酸對(duì)翡翠貽貝和真鯛抗氧化系統(tǒng)、基因表達(dá)以及組織損傷的影響[D]. 上海: 上海海洋大學(xué), 2012: 32

Wang H W. Effects of perfluorooctane sulfonate on antioxidant system, tissues injury and genes expression ofPerna viridis and Pagrosomus major [D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2012: 32 (in Chinese)

[39] 胡芹. 全氟辛烷磺酸(PFOS)對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育及成魚的毒性效應(yīng)研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009: 58-62

Hu Q. Embryo developmental and maternal toxicity of perfluorooctane sulfonate (PFOS) in the zebrafish [D]. Wuhan: Central China Agricultural University, 2009: 58-62 (in Chinese)

[40] 趙歡, 趙新達(dá), 岳宗豪, 等. 苯并(a)芘對(duì)雙齒圍沙蠶抗氧化酶活性和細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的影響[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2014(4): 342-346

Zhao H, Zhao X D, Yue Z H, et al. Effects of B(a)P exposure on antioxidant enzyme activity and CYP450 gene expression in sandworm Perinereis aibuhitensis [J]. Journal of Dalian Ocean University, 2014(4): 342-346 (in Chinese)

[41] James M O, Lou Z, Rowland-Faux L, et al. Properties and regional expression of a CYP3A-like protein in channel catfish intestine [J]. Aquatic Toxicology, 2005, 72(4): 361-371

[42] Kurt C K, Kathleen A D. Goldfrank’s Toxicologic Emergencies [M]. McGraw-Hill Medical Publishers, 2010: 173

[43] Skupinska K, Misiewicz I, Kasprzycka-Guttman T. A comparison of the concentration-effect relationships of PAHs on CYP1A induction in HepG2 and Mcf7 cells [J]. Archive Für Toxikologie, 2007, 81(3): 137-149

[44] Won E J, Lee J S, Lee Y M. Combined effects of cadmium and copper on the expression of antioxidant enzyme-coding genes in the polychaete, Perinereis nuntia [J]. Toxicology & Environmental Health Sciences, 2013, 5(1): 26-33

[45] 楊秀芬, 鐘正賢, 廖梅春, 等. 蛇葡萄素與苯并芘合用對(duì)大鼠肺組織內(nèi)CYP和GST基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2010, 25(1):135-136

Yang X F, Zhong Z X, Liao M C, et al. The research development of inflammatory signal pathway of atherosclerosis [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2010, 25(1):135-136 (in Chinese)

[46] Butler R A, Kelley M L, Powell W H, et al. An aryl hydrocarbon receptor (AHR) homologue from the soft-shell clam, Mya arenaria: Evidence that invertebrate AHR homologues lack 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and beta-naphthoflavone binding [J]. Gene, 2001, 278(1-2): 223-234

[47] Yadetie F, Butcher S, F?rde H E, et al. Conservation and divergence of chemical defense system in the tunicate Oikopleura dioica revealed by genome wide response to two xenobiotics [J]. BMC Genomics, 2012, 13(2): 151-157

[48] Zheng S, Qiu X, Chen B, et al. Toxicity evaluation of benzo[a]pyrene on the polychaete Perinereis nuntia using subtractive cDNA libraries [J]. Aquatic Toxicology, 2011, 105(3-4): 279-291

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Effects of PFOS on the Genes Transcription and Enzymes Activity of CYPs, GST in PolychaetePerinereisnuntia

Chen Xi1,2, Yan Xizhu1,2,*, Su Lili1,2

1. Jimei University, Xiamen 361021, China 2. Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture, P. R. China, Xiamen 361021, China

Received 13 April 2016 accepted 18 May 2016

Polychaete has been widely used to monitor the environmental pollution. Perfluorooctane sulfonate (PFOS) is an emerging persistent organic pollutant that has global distribution. However, the effect of PFOS on the dominant species of polychaete, nereis, has received little attention. To research its potential biomarkers for PFOS pollution, this paper studied the combine response of genes transcription and enzymes activity of cytochrome P450 (CYP), glutathione S-transferase (GST) in nereis, Perinereis nuntia. The sandworms were exposed to sublethal concentrations of PFOS (4, 8, 16 mg·L-1) for 1, 4, 7, 14 days and recovered for 5 days, respectively. The PFOS-induced inhibition of EROD showed a time-dependent relationship clearly. The P. nuntia CYP431A1 (CYP2 clan) mRNA was sensitively expressed to PFOS exposure with a clear dose-dependent relationship and showed the highest inducibility on day 14. The transcription levels of CYP424A1, a CYP4 clan gene, in 4 and 8 mg·L-1treatments were all positively correlated with the PFOS exposure time. As one of phase II detoxification enzymes, the GST enzyme and GST omega gene both decreased first and upregulated then with the extension of PFOS exposure. P. nuntia could still accelerate metabolism under the serious exposure and showed its tolerance for PFOS. During recovery period, all the observed indexes showed a tendency to recover to the control level. In conclusion, the response of gene transcription and enzyme activity showed that CYPs and GST of P. nuntia played important roles in the PFOS detoxification and these indexes of P. nuntia would have great potentials as biomarkers to detect the PFOS pollution in marine intertidal zone.

PFOS; Perinereis nuntia; oxidative stress; cytochrome P450; glutathione S-transferase

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201205009-4)

陳西(1991-)，女，碩士，研究方向?yàn)樗蛏鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: 1361158525@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xzyan@jmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160413001

2016-04-13 錄用日期：2016-05-18

1673-5897(2016)6-102-10

X171.5

A

閻希柱(1965-)，男，博士，教授，主要研究方向水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)。

陳西, 閻希柱, 宿麗麗. PFOS對(duì)多齒圍沙蠶CYPs、GST基因轉(zhuǎn)錄及酶活性的毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(6): 102-111

Chen X, Yan X Z, Su L L. Effects of PFOS on the genes transcription and enzymes activity of CYPs, GST in polychaete Perinereis nuntia [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 102-111 (in Chinese)