經(jīng)皮膚暴露四溴雙酚A對Wistar雄性大鼠的毒性效應(yīng)

向明燈，高丹丹，李紅艷，李良忠，于紫玲，汪正東，林必桂，于云江,*

1. 中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所 有機地球化學(xué)國家重點實驗室，廣州 510640 2. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所 國家環(huán)境保護環(huán)境污染健康風(fēng)險評價重點實驗室，廣州 510535

經(jīng)皮膚暴露四溴雙酚A對Wistar雄性大鼠的毒性效應(yīng)

向明燈1,2，高丹丹2，李紅艷2，李良忠2，于紫玲2，汪正東2，林必桂2，于云江1,2,*

1. 中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所 有機地球化學(xué)國家重點實驗室，廣州 510640 2. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所 國家環(huán)境保護環(huán)境污染健康風(fēng)險評價重點實驗室，廣州 510535

塵/土以及含阻燃劑產(chǎn)品的皮膚接觸是四溴雙酚A(TBBPA)重要的人體暴露途徑。為研究TBBPA經(jīng)皮膚亞慢性暴露毒性效應(yīng)，選擇無特定病原菌級別(SPF級)Wistar雄性大鼠作為受試生物，分別設(shè)空白對照組(K)、溶劑對照組(Z)，以及20 mg·kg-1(A)、60 mg·kg-1(B)、200 mg·kg-1(C)、600 mg·kg-1(D)共4個不同劑量的TBBPA暴露組，采用皮膚接觸的方式連續(xù)暴露90 d。暴露期間觀察大鼠狀態(tài)并稱重，于第91天解剖大鼠，分離主要臟器稱重計算臟器系數(shù)，并對暴露皮膚進行組織病理學(xué)檢查。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮膚暴露TBBPA后，90 d暴露期間不同實驗組Wistar大鼠在表觀形態(tài)、行動、進食方面無差異，TBBPA暴露導(dǎo)致大鼠體重略微降低，但各處理組間大鼠體重?zé)o顯著差異；90 d暴露后不同劑量組間大鼠的器官臟器系數(shù)沒有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，不同劑量組大鼠皮膚暴露區(qū)域均有一定程度的炎癥細胞浸潤及部分組織膠原間隙增寬。研究結(jié)果表明，TBBPA 90 d亞慢性皮膚暴露對Wistar大鼠無明顯毒性效應(yīng)。

四溴雙酚A；Wistar雄性大鼠；亞慢性毒性；皮膚暴露；生理損傷

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)是目前世界上使用量最大的溴系阻燃劑之一，廣泛應(yīng)用于電子、塑料、紡織以及建筑等材料和產(chǎn)品中。據(jù)國際溴科學(xué)與環(huán)境論壇(BSEF)統(tǒng)計，2007年全球TBBPA及其衍生物的年消費量在12～15萬t，其中亞洲地區(qū)(中國、日本等)是TBBPA生產(chǎn)和消費的重點區(qū)域，其消費總量占全球80%以上[1]。目前TBBPA在很多國家和地區(qū)的土壤、沉積物、野生動物以及人體等非生物和生物介質(zhì)中被廣泛檢出[2-5]，且中國TBBPA的環(huán)境污染水平遠高于歐美地區(qū)，部分地區(qū)甚至達到其他國家的幾十甚至數(shù)百倍[6]，如浙江省臺州市室內(nèi)外積塵中TBBPA濃度分別高達42.21～46 191 ng·g-1dw和42.45～28 993 ng·g-1dw[7]，而英國伯明翰家庭和辦公場地中濃度僅為n.d.～382 ng·g-1dw和n.d.～140 ng·g-1dw[8]。

TBBPA潛在的人體健康風(fēng)險不容忽視。研究表明，TBBPA具有潛在肝腎、神經(jīng)等毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[9-13]。近期美國國家毒理學(xué)計劃中(National Toxicology Program, NTP)關(guān)于TBBPA的系統(tǒng)研究顯示[14]，TBBPA暴露后的大鼠血清甲狀腺素(T4)降低，500和1 000 mg·kg-1bw劑量的TBBPA暴露會導(dǎo)致大鼠肝臟、腎臟、脾臟重量增加，以及腎臟細胞質(zhì)的空泡形成；為期2年的TBBPA致癌性研究發(fā)現(xiàn)，TBBPA經(jīng)口暴露可能會導(dǎo)致雄性大鼠睪丸細胞腺瘤，并且有明確證據(jù)表明TBBPA暴露會增加雌性大鼠子宮腫瘤發(fā)生率。Wikoff等[15](2015)以基于NTP報告的子宮增生和子宮瘤發(fā)生作為效應(yīng)終點，采用基準(zhǔn)劑量法(BMD)得出TBBPA經(jīng)口暴露的參考劑量(RfD)為0.6 mg·kg-1·d-1，其致癌強度系數(shù)高達3.15 E-3 (mg·kg-1·d-1)-1(高于BDE-209的7.00 E-4 (mg·kg-1·d-1)-1[16])。

研究顯示，塵/土以及含阻燃劑的消費產(chǎn)品的皮膚接觸是TBBPA等溴系阻燃劑的重要人體暴露途徑[8,17-18]。然而，現(xiàn)有TBBPA毒性效應(yīng)評估數(shù)據(jù)主要基于經(jīng)口暴露的動物實驗[9-10,12]或細胞體外實驗[19-20]獲得，關(guān)于TBBPA經(jīng)皮膚暴露毒性效應(yīng)評估的報道尚不多見。因此，本研究通過動物模擬實驗，研究Wistar雄性大鼠90 d亞慢性經(jīng)皮膚暴露TBBPA后的活動狀態(tài)、體重、臟器系數(shù)以及皮膚組織病理學(xué)變化，評估探討TBBPA經(jīng)皮膚亞慢性暴露后的毒性效應(yīng)，為進一步的TBBPA人體暴露健康風(fēng)險評估研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料與主要儀器

實驗動物及飼養(yǎng)條件：實驗選取雄性Wistar大鼠36只(6周，180 g±20 g)，無特定病原體級(SPF級)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(軍)2007-004；實驗大鼠平均分為6組，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院無特殊病原菌級別(SPF級)實驗動物房，動物飼養(yǎng)及實驗操作均嚴(yán)格按照SPF級動物實驗室操作規(guī)程執(zhí)行。飼養(yǎng)室光照12 h，黑暗12 h，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～60%。實驗大鼠置于飼養(yǎng)箱中常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水喂食。大鼠喂養(yǎng)飼料為北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的膨化鼠飼料，飼料合格證號為SCXK(京)2005-0007。大鼠喂養(yǎng)飲水為蒸餾水，每日更換。大鼠所用飼養(yǎng)箱、飼料、飲水瓶及墊料均需每日消毒、及時更換。

主要儀器包括：電子分析天平(瑞士Mettler Toledo，AB204-S)，生物顯微鏡(德國Leica DM500/750)，石蠟包埋機(德國leica EG1150H)，切片機(德國leica RM2235)，一次性無菌注射器(湖北福鑫醫(yī)療器械有限公司)。

主要試劑包括：TBBPA(純度大于98%)，購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，并研磨至直徑約30 μm顆粒以便皮膚吸收；戊巴比妥鈉(優(yōu)級純)，購于國藥試劑公司；甲醛溶液(優(yōu)級純)，購于北京化學(xué)試劑廠；蘇木素-伊紅染液(純度大于98%)，購于美國sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 暴露劑量

為考察TBBPA對生物體亞慢性暴露的生物效應(yīng)，暴露時間設(shè)置為90 d；暴露劑量的設(shè)置是在參考污染物的半致死劑量(LD50)，同時參考實驗動物品系、預(yù)期暴露時間以及相關(guān)文獻等資料[21-22]的基礎(chǔ)上確定的。本研究最終確定TBBPA暴露劑量如表1所示。

1.2.2 皮膚暴露方法

暴露實驗開始前Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，開始暴露后每天染毒6 h，每周7 d，持續(xù)90 d。染毒前24 h，將動物軀干背部染毒區(qū)的被毛剔除(脫毛要求是不損傷脫毛區(qū)的表皮，剃毛頻率依動物毛發(fā)生長情況而定)。皮膚暴露面積一般要求不小于動物體表面積的10%，本實驗選擇確定為6 cm×6 cm，于脫毛24 h后涂抹一定量的TBBPA(用生理鹽水潤濕)，以保證受試物與皮膚有良好的接觸[23-25]。涂抹過程中應(yīng)盡可能地使受試物薄而均勻地涂敷于整個染毒區(qū)域。之后在染毒區(qū)域上依次覆一層玻璃紙，2～4層醫(yī)用紗布，膠布固定好，以保證受試物與皮膚有良好的接觸并防止動物舔食。溶劑對照組給予生理鹽水涂敷，空白對照組無處理。

暴露6 h結(jié)束后，將大鼠染毒區(qū)域朝下，先用軟毛刷將殘留的TBBPA刷除，然后依次用中性肥皂水、清水清洗受試皮膚表面、紙巾擦干。暴露期間每天觀察大鼠狀態(tài)(皮膚和被毛改變、眼和結(jié)膜變化、運動和行為改變)并記錄，分別于實驗第0、1天，10～90 d(每隔10天)稱量并記錄大鼠體重，大鼠處死前禁食12 h，自由飲水。

1.2.3 大鼠組織樣本的獲取及組織病理學(xué)檢查

實驗第91天，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(30 mg·kg-1)麻醉大鼠后，通過腹部主動脈采得全血。采血后頸椎離斷處死大鼠，迅速解剖，立即分離主要臟器(心臟、肺、胸腺、肝臟、腎臟、脾臟、睪丸及腦)，冷生理鹽水清洗殘留血液，濾紙吸干表面液體后稱取組織濕重。臟器系數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體重(g)×100%。

表1 四溴雙酚A(TBBPA)皮膚暴露劑量Table 1 The dermal exposure dose of tetrabromobisphenol A (TBBPA)

無菌條件下取染毒部位皮膚，去除皮下結(jié)締組織，并置于4%福爾馬林溶液中固定；皮膚脫水后石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封固后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；采用One way ANOVA分析TBBPA暴露組與對照組之間的差異，P < 0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 大鼠的行為變化

本實驗Wistar大鼠持續(xù)暴露90 d，實驗前大鼠表觀形態(tài)無差異，體毛柔軟、毛色白、有光澤；實驗開始后，各組大鼠毛色微黃，光澤度降低。由于紗布的包裹以及飼養(yǎng)籠空間較小，大鼠行動受到限制，實驗初期大鼠反應(yīng)強烈，出現(xiàn)極度煩躁，撕咬紗布、頻繁洗臉、舔毛等現(xiàn)象；隨著暴露時間的持續(xù)，大鼠逐漸適應(yīng)，這一情況有所改善；實驗初期大鼠進食量和飲水量較少，中期及后期飲食逐漸正常。K、Z、A、B、C、D各組間大鼠無明顯差異。

2.2 大鼠體重的變化

90 d亞慢性暴露期間，K、Z、A、B、C、D各劑量組Wistar雄鼠體重隨時間的變化如圖1所示?？梢钥闯觯?0 d暴露期間，空白組(K)大鼠體重及體重增長量均略高于其他處理組。經(jīng)單因素方差分析(One way ANOVA)可知，TBBPA暴露組(A、B、C、D)與空白對照組(K)和溶劑對照組(Z)相比，均無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 TBBPA亞慢性經(jīng)皮膚暴露不同時間各劑量組大鼠體重變化趨勢Fig. 1 The body weight of male Wistar rats in different groups following sub-chronic dermal exposure to TBBPA

2.3 經(jīng)皮膚TBBPA暴露對大鼠臟器系數(shù)的影響

大鼠經(jīng)皮膚亞慢性暴露TBBPA 90 d后，K、Z、A、B、C、D各劑量組Wistar雄鼠8種主要組織器官(胸腺、心、肺、肝、腎、脾臟、睪丸、腦)的臟器系數(shù)見表2。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，K、Z、A、B、C、D各劑量組間的器官臟器系數(shù)沒有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P>0.05)。

2.4 暴露皮膚組織病理學(xué)檢查

組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，對照組K、Z和暴露組A、B、C、D染毒區(qū)域皮膚均有一定程度的炎癥細胞浸潤和組織膠原間隙增寬(圖2)，病變發(fā)生率如表3所示。可以看出，TBBPA暴露組(A、B、C、D)與空白對照組(K)和溶劑對照組(Z)相比，炎癥細胞浸潤發(fā)生率略高，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；組織膠原間隙增寬發(fā)生率無顯著差異(P>0.05)。

圖2 大鼠TBBPA暴露區(qū)域皮膚切片病理圖(×200倍)注：炎癥細胞浸潤，如黑色箭頭所示；組織膠原間隙增寬，如黃色箭頭所示。Fig. 2 Skin pathological section of TBBPA exposure area in male rats (×200)Note: black arrow indicates inflammatory cell infiltration, and yellow arrow indicates tissue collagen gap widened.

表2 TBBPA不同劑量組雄鼠各器官臟器系數(shù)Table 2 Organ coefficient of male rats in different TBBPA groups

注：臟器系數(shù) (%)=臟器濕重/體重×100%；與空白對照組(K組)比較，* P<0.05，n = 6；與溶劑對照組(Z組)比較，#P<0.05，n = 6。

Note: Organ coefficient (%) = organ wet weight/final body weight×100%; compared with blank control, * P<0.05, n = 6; compared with vehicle control,#P <0.05, n = 6.

表3 各TBBPA劑量組大鼠染毒區(qū)域皮膚病變發(fā)生率Table 3 The incidence of skin lesions of TBBPA exposure area in male rats

注：分?jǐn)?shù)表示病變發(fā)生率(皮膚病變大鼠數(shù)/受試大鼠總數(shù))。

Note: Fraction represent incidence of lesions (The numbers of rats with skin lesions/The total numbers of experimental rats).

3 討論(Discussion)

歐盟2006年關(guān)于TBBPA的調(diào)查表明，TBBPA的環(huán)境和人體健康風(fēng)險可忽略[22]，但該結(jié)論一直存在爭議，大量學(xué)者針對TBBPA的毒性效應(yīng)和人體暴露風(fēng)險進行了研究[13]。然而，現(xiàn)有研究對于TBBPA經(jīng)皮膚接觸、兒童塵/土手-口接觸等這些被認(rèn)為是阻燃劑暴露的關(guān)鍵途徑卻少有涉及，其中經(jīng)皮膚暴露的慢性或亞慢性毒性效應(yīng)參數(shù)的缺乏，在一定程度上制約了TBBPA健康風(fēng)險評價的開展并影響了評估的準(zhǔn)確性[17]。本研究采用Wistar雄性大鼠為受試動物，初步評估了TBBPA經(jīng)皮膚90 d亞慢性暴露的毒性效應(yīng)，為后期進一步的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

整個實驗過程中對大鼠行為狀態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，由于對Z、A、B、C和D組實施紗布包裹以及飼養(yǎng)籠空間較小，大鼠的活動受到限制，造成大鼠一定程度的煩躁及撕咬紗布現(xiàn)象，但隨著暴露時間的增加，大鼠逐漸適應(yīng)了暴露環(huán)境，體重變化及精神狀態(tài)趨于平穩(wěn)[25]。體重是衡量實驗動物健康的重要指標(biāo)[25]，90 d暴露期間，不同劑量暴露對大鼠體重的影響無顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明TBBPA暴露沒有造成大鼠嚴(yán)重消瘦。Tada等[9]給予懷孕ICR小鼠飼喂分別含有0.01%、0.1%和1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))TBBPA的食物，并持續(xù)到子代小鼠斷奶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量組母鼠間體重?zé)o明顯差異，不同劑量組子代體重呈下降趨勢，但統(tǒng)計差異不顯著。這與本實驗結(jié)果一致，說明亞慢性TBBPA暴露不會對哺乳動物體重產(chǎn)生較大的毒性作用。

實驗動物的臟器系數(shù)是藥品或化學(xué)品長期毒性試驗中必須檢測的項目，能較好地反映化學(xué)物質(zhì)對臟器的毒性綜合情況，亦可旁證病理組織學(xué)改變的可能性，并可作為尋找毒物作用靶器官的重要線索[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴露組(A、B、C、D)和對照組(K、Z)各劑量組間的器官臟器系數(shù)沒有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這與經(jīng)口或經(jīng)呼吸暴露的結(jié)果存在一定差異。經(jīng)呼吸暴露研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)亞慢性呼吸暴露TBBPA后，實驗大鼠的腎臟和脾臟臟器系數(shù)有一定程度上的下降[27]；經(jīng)口途徑暴露研究發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠在90 d的亞慢性經(jīng)口暴露后，高劑量組大鼠腎臟組織有微弱的損傷[28]。這可能與TBBPA經(jīng)皮膚暴露途徑中，外暴露TBBPA經(jīng)皮膚吸收進入體內(nèi)的量較小，約為3.31%～11.21%，并且TBBPA具有較快的代謝速率，能很快經(jīng)糞便排出體外有關(guān)[29]，因此經(jīng)皮膚暴露TBBPA對受試動物臟器系數(shù)影響較小。

組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，對照組K、Z和暴露組A、B、C、D染毒區(qū)域皮膚均有一定程度的炎癥細胞浸潤和組織膠原間隙增寬。筆者分析，這可能與TBBPA皮膚暴露操作有關(guān)，由于染毒區(qū)域除涂敷用生理鹽水潤濕的TBBPA外，還需用多層紗布及醫(yī)用膠帶固定，易造成染毒區(qū)域皮膚空氣流通不暢，且TBBPA粉末以及紗布會對染毒皮膚造成一定的摩擦，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)輕微紅斑和水腫。關(guān)于TBBPA的皮膚毒性，歐盟2006年的TBBPA風(fēng)險評估報告顯示，對10只新西蘭兔子以2 000 mg·kg-1的TBBPA劑量進行皮膚急性毒性試驗，暴露24 h之后，只有一只皮膚出現(xiàn)輕微的紅斑和水腫，在2周的觀察期未發(fā)現(xiàn)動物死亡和其他中毒現(xiàn)象；另外一項研究對10只雌性兔子背部(去毛)敷以200 mg·kg-1的TBBPA，暴露24 h之后，所有受試動物均出現(xiàn)一定程度的紅斑，但48 h之后，受試動物皮膚表面均恢復(fù)正常[22]，最終歐盟TBBPA風(fēng)險評估報告認(rèn)為，TBBPA急性暴露不具有皮膚致敏性或刺激性。

綜上，本實驗采用Wistar雄性大鼠為受試動物，探索TBBPA經(jīng)90 d亞慢性皮膚暴露的毒性效應(yīng)。研究結(jié)果顯示，Wistar大鼠經(jīng)皮膚亞慢性暴露TBBPA后，不同實驗組大鼠90 d暴露期間在表觀形態(tài)、行動、進食方面無差異，TBBPA暴露導(dǎo)致大鼠體重略微降低，但各處理組間大鼠體重?zé)o顯著差異；90 d暴露后，不同劑量組間大鼠的器官臟器系數(shù)沒有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，不同劑量組(包括空白對照組和溶劑對照組)的大鼠皮膚暴露區(qū)域均有一定程度的炎癥細胞浸潤及部分組織膠原間隙增寬。研究結(jié)果表明，TBBPA 90 d亞慢性皮膚暴露對Wistar大鼠無明顯毒性效應(yīng)。本研究可為TBBPA經(jīng)皮膚長期暴露的毒性參數(shù)研究和健康風(fēng)險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Toxicity Effects of Tetrabromobisphenol A in Male Wistar Rats Following Dermal Exposure

Xiang Mingdeng1,2, Gao Dandan2, Li Hongyan2, Li Liangzhong2, Yu Ziling2, Wang Zhengdong2, Lin Bigui2, Yu Yunjiang1,2,*

1. State Key Laboratory of Organic Geochemistry, Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China 2. State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Pollution Health Risk Assessment, South China Institute of Environmental Sciences. MEP, Guangzhou 510535, China

Received 15 November 2016 accepted 20 December 2016

Dermal contact for dust and consumer products has been identified as the major exposure pathways to tetrabromobisphenol A (TBBPA). In order to reveal the subchronic toxic effects, the male Wistar rats were exposed for 90 days to TBBPA dosage varying at 20, 60, 200 and 600 mg·kg-1body weight, and the similar experiments were also conducted in blank control group and solvent control group. The results showed that within the 90-d dermal contact with TBBPA, the significant difference concerning animal growth, behaviour and feeding among all groups was not clearly observed (P>0.05), including the organ coefficients of thymus, heart, lung, liver, kidneys, spleen, ovary, and brain between treatment groups and the control or vehicle group, although a slight change in body weight and a certain degree of inflammatory cell infiltration and collagen gap widened was observed. It is indicated that the subchronic dermal exposure to TBBPA could not cause significantly toxicological effects.

tetrabromobisphenol A; male wistar rats; subchronic toxicity; dermal exposure; physiological damage

國家自然科學(xué)基金項目(21377045，U1401233，21607048)

向明燈(1982-)，男，博士研究生，研究方向為環(huán)境與健康，E-mail: xiangmingdeng@scies.org

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yuyunjiang@ scies.org

10.7524/AJE.1673-5897.20161115001

2016-11-15 錄用日期：2016-12-20

1673-5897(2016)6-338-07

X171.5

A

于云江(1964-)，男，博士，研究員，主要研究方向為環(huán)境與健康，發(fā)表學(xué)術(shù)論文130余篇。

向明燈, 高丹丹, 李紅艷, 等. 經(jīng)皮膚暴露四溴雙酚A對Wistar雄性大鼠的毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(6): 338-344

Xiang M D, Gao D D, Li H Y, et al. Toxicity effects of tetrabromobisphenol A in male wistar rats following dermal exposure [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 338-344 (in Chinese)