金銀花不同提取物抗氧化活性的研究

劉豪，張冬青，劉碩，馬淑紅，張艷玲，董阿力德?tīng)枅D，朝格圖（內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010021）

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金銀花不同提取物抗氧化活性的研究

劉豪，張冬青，劉碩，馬淑紅，張艷玲*，董阿力德?tīng)枅D，朝格圖
（內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010021）

摘要：初步研究金銀花不同提取物的抗氧化活性。將金銀花藥材用石油醚脫脂后，分別用無(wú)水乙醇、95 %乙醇、90 %乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇和50%乙醇提取，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)不同溶劑提取物的綠原酸、總黃酮和總酚含量進(jìn)行分析，并測(cè)試各提取物對(duì)羥基自由基（·OH）和二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除作用以對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較。結(jié)果表明：金銀花95%乙醇提取物綠原酸、總黃酮和總酚含量最高，分別為123.99、242.62和48.76 mg/g；95 %乙醇提取物清除·OH和DPPH·能力也最強(qiáng)，清除率分別為90.69 %和65.64 %。可見(jiàn)，金銀花清除·OH和DPPH·自由基的能力與綠原酸、黃酮和多酚的含量具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：金銀花；抗氧化活性；綠原酸；總黃酮；總酚；羥基自由基（·OH）；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，藥用歷史悠久，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能?，F(xiàn)代藥理研究表明金銀花具有抗病原微生物、抗炎、抗生育、解熱、保肝、止血、降血脂、抗氧化、中樞興奮和免疫調(diào)節(jié)等功效[1-4]。金銀花含有揮發(fā)油、萜類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、無(wú)機(jī)元素及其他等多種化學(xué)成分。2014年，國(guó)家衛(wèi)生部《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄管理辦法》中明確了金銀花既是食品又是藥品，長(zhǎng)期食用無(wú)毒副作用，它具有獨(dú)特的清香，悅鼻清心，滋味醇和，鮮爽回甘，是我國(guó)民間人們歷來(lái)非常喜愛(ài)而且重要的傳統(tǒng)保健飲品[5]。目前普遍認(rèn)為綠原酸等有機(jī)酸類(lèi)和黃酮類(lèi)是金銀花的活性物質(zhì)[6-12]。然而這些成分與抗氧化活性之間的相關(guān)性研究尚不深入。本文利用紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)金銀花不同提取物的綠原酸、總黃酮和總酚含量以及清除羥基自由基（·OH）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）活性進(jìn)行了分析，擬對(duì)金銀花活性成分與抗氧化活性的相關(guān)性進(jìn)行探討，為該藥食同源品種的深入研究提供數(shù)據(jù)參考和試驗(yàn)支撐。

1材料與方法

1.1材料與試劑

金銀花藥材（產(chǎn)地河南）：購(gòu)自亳州市京皖中藥飲片廠，經(jīng)鑒定為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花；石油醚（b.p. 60℃~ 90℃）、乙醇、95 %乙醇、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司，均為分析純；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；DPPH（≥96 %）、焦性沒(méi)食子酸（分析純）、鄰二氮菲：上海晶純生化科技股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

U-3900H紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本日立公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鞏義予華；DZF-6090真空干燥箱：上海一恒；MILLI-Q DIRECT 8超純水器：美國(guó)Millipore；VFD-1000冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康；FA1004分析天平：上海精天；pH計(jì)：上海奧豪斯；DF-101XP集熱式水浴鍋：金壇市正基。

1.3方法

1.3.1金銀花的提取

將干燥金銀花粉碎，各稱(chēng)取25 g，經(jīng)石油醚脫脂后，分別用無(wú)水乙醇、95 %乙醇、90 %乙醇、80 %乙醇、70 %乙醇、60 %乙醇和50 %乙醇超聲輔助提取0.5 h，各3次，將各提取液過(guò)濾、減壓濃縮并冷凍干燥后得到各提取物。

1.3.2綠原酸含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13]，稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，配成1 g/L的溶液。分別準(zhǔn)確吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL于已編號(hào)的10 mL比色管內(nèi)，用60 %乙醇稀釋到刻度。各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5、10、15、20、25、30 mg/L，以60 %乙醇為參比，在波長(zhǎng)為328.5 nm處測(cè)定吸光度。以A為縱坐標(biāo)，c為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)樣品用60 %乙醇配制成50 mg/L溶液后測(cè)定。以60 %乙醇為參比溶液，在328.5 nm處測(cè)定吸光度。 [14-16]，以蘆丁作對(duì)照品，測(cè)定金銀花不同提取物的總黃酮含量。準(zhǔn)確吸取60 %乙醇配置濃度為0.6 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL試管內(nèi)，分別加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的60 %乙醇溶液；再加入5 %亞硝酸鈉溶液0.5 mL搖勻，放置6 min；加入10 %硝酸鋁溶液0.5 mL，放置6 min；加入4 %氫氧化鈉溶液4.0 mL，加60 %乙醇定容到10 mL，搖勻后，放置15min；掃描找到最大吸收波長(zhǎng)為505 nm，在此波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用0.0 mL作為空白，用蘆丁含量的濃度作為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為一定濃度下所對(duì)應(yīng)的吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。金銀花不同提取物分別配制成1 g/L溶液后同法測(cè)定，將其吸光度值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到金銀花不同提取物中黃酮的含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。 [17-18]，以焦性沒(méi)食子酸作對(duì)照品，采用Folin-ciocalteu法測(cè)定金銀花不同提取物的總酚含量。精確吸取濃度為0.020 mg/mL的焦性沒(méi)食子酸溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，分別置于10 mL比色管中，都加入5 mL去離子水、0.5 mL的Folinciocalteu試劑，1 min后加入1.5 mL濃度為75.0 mg/mL 的Na2CO3溶液，去離子水定容至刻度，搖勻，75℃水浴反應(yīng)10 min。在最大吸收波長(zhǎng)767 nm處測(cè)定吸光度。用0.00 mL作為空白，用焦性沒(méi)食子酸含量的濃度作為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)作為一定濃度下所對(duì)應(yīng)的吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。金銀花不同提取物按1.3.3配制后同法測(cè)定，將其吸光度值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到金銀花不同提取物中總酚的含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3總黃酮含量的測(cè)定

1.3.4總酚含量的測(cè)定

1.3.5對(duì)·OH自由基清除作用的測(cè)定

將金銀花不同溶劑提取物用60 %乙醇配成1 g/L的溶液，VC用去離子水配成0.1g/L的溶液。參考文獻(xiàn)[19]的方法，精確移取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液0.5 mL，pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）1 mL和雙蒸水0.5 mL，搖勻，再加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵0.5 mL，搖勻，最后再加入0.01 %過(guò)氧化氫溶液0.5 mL，37℃恒溫水浴60 min，在509.5 nm處測(cè)定其吸光度，記作A損；另一比色管中用0.5 mL雙蒸水代替0.5 mL過(guò)氧化氫，測(cè)定其吸光度，記作A未；再在一比色管中用不同濃度梯度的VC對(duì)照溶液或金銀花不同溶劑提取物樣品溶液代替0.5 mL雙蒸水，以雙蒸水為空白。在509.5nm處測(cè)其吸光度，記作A樣。平行測(cè)定3次，記錄吸光度，計(jì)算不同濃度VC對(duì)照溶液或金銀花不同溶劑提取物樣品溶液對(duì)羥基自由基的清除率。

1.3.6對(duì)DPPH·自由基清除作用的測(cè)定

金銀花不同提取物與VC按1.3.5配制。參考文獻(xiàn)[19-20]的方法，DPPH用60 %乙醇配成65 μmol/L溶液，加樣于具塞比色管中，搖勻反應(yīng)30 min后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于520 nm（DPPH最大吸收波長(zhǎng)）處測(cè)定吸光度（60 %乙醇溶液為參比）。1.5mL65μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL 60 %乙醇溶液的吸光度記為A0，1.5mL65μmol/LDPPH溶液加入1.5mL樣品溶液的吸光度記為Ai，1.5mL60%乙醇溶液加入1.5mL樣品溶液的吸光度記為Aj。取3次試驗(yàn)的平均值計(jì)算清除率。

2結(jié)果與分析

2.1金銀花不同提取物的提取率

金銀花不同提取物的提取率見(jiàn)表1。

表1金銀花不同溶劑提取物的提取率Table 1 Extract yield of the flower buds of Lonicera japonica by different solvents

由表1可知，金銀花60 %乙醇提取物得率最高，為27.41 %。

2.2金銀花不同提取物的綠原酸、總黃酮、總酚含量

采用吸光值外標(biāo)法計(jì)算出金銀花不同溶劑提取物中的綠原酸、總黃酮、總酚含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2金銀花不同提取物的綠原酸、總黃酮和總酚含量Table 2 Contents of total flavonoids，total phenols and lutein of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與吸光值的回歸方程為：y = 0.073 52x-0.004 5（R2= 0.999 6）。經(jīng)分析比較可知，金銀花各提取物中綠原酸含量的高低順序?yàn)椋?5 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>無(wú)水乙醇提取物>90 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與吸光值的回歸方程為：y = 0.015 77x - 0.011 62（R2= 0.999 7）。經(jīng)分析比較可知，金銀花各提取物中總黃酮含量的高低順序?yàn)椋?5 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>無(wú)水乙醇提取物。

焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與吸光值的回歸方程為：y = 0.151 4x - 0.086 78（R2= 0.990 7）。經(jīng)分析比較可知，金銀花各提取物中總酚含量的高低順序?yàn)椋?5 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>無(wú)水乙醇提取物。

2.3金銀花不同提取物對(duì)·OH的清除作用

金銀花不同提取物和VC對(duì)·OH的清除作用見(jiàn)表3。

表3金銀花不同提取物和VC對(duì)·OH的清除作用Table 3·OH scavenging effects of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica and VC

利用鄰二氮菲法，測(cè)得金銀花不同提取物對(duì)羥基自由基的清除能力由大到小依次為：VC>95 %乙醇提取物>90 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>無(wú)水乙醇提取物>70 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物。其中，除VC外，95 %乙醇提取物的清除能力最強(qiáng)，清除率為90.69 %；而50 %乙醇提取物的清除能力最弱，清除率為30.53 %。

2.4金銀花不同提取物對(duì)DPPH·的清除作用

金銀花不同提取物和VC對(duì)DPPH·的清除作用見(jiàn)表4。

表4金銀花不同提取物和VC對(duì)DPPH·的清除作用Table 4 DPPH·scavenging effects of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica and VC

由表4可知，金銀花不同溶劑提取物對(duì)DPPH·的清除能力依次為：VC>95 %乙醇提取物>無(wú)水乙醇提取物>90 %乙醇提取物>80 %乙醇提取物>60 %乙醇提取物>50 %乙醇提取物>70 %乙醇提取物。其中，除VC外，95 %和無(wú)水乙醇提取物清除DPPH·的能力是最強(qiáng)的，清除率分別為65.64 %和63.90 %；而70 %乙醇提取物的清除能力是最弱的，為38.55 %。

3　結(jié)論

上述研究發(fā)現(xiàn)，金銀花各提取物中綠原酸、黃酮和多酚含量較高的前三位分別依次是95 %乙醇提取物、60 %乙醇提取物、50 %乙醇提取物，而且綠原酸、黃酮和多酚含量的大小順序完全一致；其中，金銀花95 %乙醇提取物的綠原酸、黃酮和多酚含量最高，其清除OH·和DPPH·自由基的能力也最強(qiáng)。可見(jiàn)，金銀花95 %乙醇提取物具有最佳的抗氧化活性。金銀花清除OH·和DPPH·自由基的能力與綠原酸、黃酮和多酚含量具有一定的相關(guān)性，但是并不呈線性的正相關(guān)性。金銀花除含有綠原酸、黃酮和多酚，還含有揮發(fā)油、萜類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、無(wú)機(jī)元素等多種化學(xué)成分，其抗氧化活性是其中所含有多種成分綜合作用的結(jié)果。除綠原酸、黃酮和多酚外，金銀花中可能還含有其他具有抗氧化活性的化學(xué)成分。因此，金銀花95 %乙醇提取物具體都含有哪些抗氧化活性成分，其抗氧化能力有何不同，作用機(jī)理有何區(qū)別，各個(gè)成分之間有無(wú)協(xié)同作用，這些都有待進(jìn)一步深入研究。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:205-206

[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草:第七冊(cè)20卷[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999:529-536

[3]邢蕊.金銀花藥效學(xué)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 2012

[4]張志旭,劉東波,劉鵬,等.金銀花研究進(jìn)展與行業(yè)發(fā)展分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012 (4): 20-22

[5]馬純英,羅忠毅,丁躍成,等.金銀花茶的開(kāi)發(fā)研究[J].茶葉通訊, 2005, 32(1): 11-14

[6]夏遠(yuǎn),李弟灶,裴振昭,等.金銀花化學(xué)成分的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2012, 14(4): 26-32

[7]吳新安,秦峰,都模勤.金銀花揮發(fā)油成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 27(6): 519-520

[8]王如峰,劉瑞凝,賡迪.金銀花的揮發(fā)性成分研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2011, 22(6): 1382-1383

[9] SONG W X, LI S, WANG S J, et al. Pyridinium Alkaloid-Coupled Secoiridoids from the Flower Buds of Lonicera japonica[J]. J Nat Prod, 2008, 71(5): 922-925

[10] YU Y, JIANG ZB, SONG W X, et al. Glucosylated caffeoylquinic acid derivatives from the flower buds of Lonicera japonica[J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2015, 5(3): 210-214

[11] YU Y, SONG W X, ZHU C G, et al. Homosecoiridoids from the Flower Buds of Lonicera japonica[J]. J Nat Prod, 2011, 74(10): 2151-2160

[12] YU Y, ZHU C G, WANG S J, et al. Homosecoiridoid Alkaloids withAmino Acid Units fromthe Flower Buds of Lonicera japonica[J]. J Nat Prod, 2013, 76(12): 2226-2233

[13]郝鳳霞,楊敏麗.金銀花中綠原酸和黃酮的同時(shí)提取分離工藝研究[J].食品科學(xué), 2009, 30(20): 211-214

[14]李楠,葉春華,呂艷蓓.金蓮花中黃酮類(lèi)化合物抗氧化能力的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā), 2010, 31(11): 77-79

[15]趙二勞,趙小花,范建鳳.金蓮花黃酮微波輔助提取及其抗氧化性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2009, 28(1): 81-85

[16]申海進(jìn),郭巧生,房海靈.野菊花60 %乙醇提取物的酚類(lèi)成分組成及其清除自由基和防霉變能力分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2010, 19(1): 20-25

[17]趙二勞,姚宇霞,史淑美,等.秦皮不同溶劑提取物總酚含量及抗氧化活性[J].中國(guó)食品添加劑, 2012(3): 116-119

[18]曹艷萍,代宏哲,曹煒,等. Folin-Ciocaileu比色法測(cè)定紅棗總酚[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(4): 1299, 1302

[19]羅磊,郭曉園.金銀花提取液抗氧化活性研究[J].食品科學(xué), 2009, 30(21): 63-65

[20]魏紅,豐帆,陳旭丹,等. 4種中藥黃酮提取物清除自由基活性的研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 28(2): 14-17

Study on the Antioxidant Activity of Different Extracts of the Flower Buds of Lonicera japonica

LIU Hao，ZHANG Dong-qing，LIU Shuo，MA Shu-hong，ZHANG Yan-ling*，DONG Alideertu，Tsogt
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Inner Mongolia University，Hohhot 010021，Inner Mongolia，China）

Abstract：The antioxidant bioactivity of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica was studied preliminarily in this paper. After extraction by petroleum ether，100 % ethanol，95 % ethanol，90 % ethanol，80 % ethanol，70 % ethanol，60 % ethanol and 50 % ethanol was used to extract the flower buds of Lonicera japonica. The ultraviolet-visible spectrophotometry was applied to test the contents of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols. To compare the antioxidant bioactivity of different extracts of the flower buds of Lonicera japonica，·OH and DPPH·free radical scavenging ability were measured as well. The results showed that 95 % ethanol extract had highest content of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols，that was 123.99 mg/g，242.62 mg/g and 48.76 mg/g；95 % ethanol extract had the strongest·OH and DPPH·radical scavenging ability with scavenging ratio of 90.69 % and 65.64 %. Thus，·OH and DPPH·scavenging capacity presented probably positive relatively with concentration of chlorogeinc acid，total flavonoids and total polyphenols.

Key words：the flower buds of Lonicera japonica；antioxidant bioactivity；chlorogenic acid；total flavonoids；total polyphenols；hydroxyl radical（·OH）；diphenyl picryl hydrazinyl radical（DPPH·）

收稿日期：2015-09-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.013

*通信作者

作者簡(jiǎn)介：劉豪（1995—），男（漢），本科生，研究方向：分析化學(xué)。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目（31160332）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（NJZZ13015）；內(nèi)蒙古大學(xué)高層次人才引進(jìn)科研啟動(dòng)項(xiàng)目（Z20100108）