MSCs聯(lián)合PRP對兔前交叉韌帶重建后腱骨愈合的影響

楊軍軍，徐 斌，徐洪港，涂 俊，李 洋

MSCs聯(lián)合PRP對兔前交叉韌帶重建后腱骨愈合的影響

楊軍軍，徐 斌，徐洪港，涂 俊，李 洋

目的探討骨隧道內(nèi)局部應(yīng)用自體間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）聯(lián)合富血小板血漿（PRP）對兔前交叉韌帶重建后腱-骨愈合的影響。方法24只健康的新西蘭大白兔隨機(jī)平均分配為M組、P組、MP組及C組。分別在肌腱骨道內(nèi)注入以生物蛋白膠為媒介的MSCs、PRP、MSCs復(fù)合PRP，C組僅注入生物蛋白膠。于術(shù)后4、8、12周3個時間點(diǎn)取各組兔膝關(guān)節(jié)標(biāo)本切片染色，行組織學(xué)觀察及分析。結(jié)果對于腱骨早期愈合有標(biāo)志性意義的Sharpy樣纖維在術(shù)后第4周MP組即可觀察到，并隨著愈合時間的延長，M組、P組及C組也相繼出現(xiàn)Sharpy樣纖維且Sharpy樣纖維的量是持續(xù)增加的。各組標(biāo)本在3個時間點(diǎn)組織形態(tài)學(xué)Buark評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論聯(lián)合使用MSCs和PRP可促進(jìn)骨道肌腱早期愈合，比二者單獨(dú)使用的作用強(qiáng)。

間充質(zhì)干細(xì)胞；富血小板血漿；前交叉韌帶；腱骨愈合

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）在維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定中起著重要作用。ACL損傷是一種常見的運(yùn)動損傷，目前臨床上治療ACL損傷的主要手術(shù)方式為關(guān)節(jié)鏡下ACL重建術(shù)。ACL重建術(shù)的成功與否很大程度上取決于韌帶移植物與骨隧道之間的愈合狀況［1］，研究證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）及富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）對交叉韌帶重建后的腱骨愈合有明顯的促進(jìn)作用［2-3］。但針對MSCs聯(lián)合PRP對腱-骨愈合的研究報道較少，該實驗利用自體MSCs聯(lián)合PRP凝膠頂端注射的方法注入骨隧道內(nèi)，觀察自體MSCs復(fù)合PRP是否有促進(jìn)腱骨愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康成年的新西蘭大白兔24只，約2.5 kg，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2主要材料及試劑 兔MSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物技術(shù)有限公司）；纖維蛋白酶原、凝血酶、MSCs完全培養(yǎng)基、青鏈霉素（合肥欣樂生物有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SHEL LAB）；Masson三色染色劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.2 方法

1.2.1MSCs的提取、分離及培養(yǎng) 粒細(xì)胞刺激因子刺激各組兔1周后，取兔外周血10 ml，1 200 r/ min離心10 min用5 ml含10%胎牛血清及1%雙抗的L-DMEM液的完全培養(yǎng)液沖洗離心管后接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后予以第1次換液，后每72 h換液1次，待貼壁細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部90%以上后進(jìn)行傳代。取生長活躍的第3代細(xì)胞進(jìn)行實驗，待細(xì)胞傳至第3代后，將各組細(xì)胞消化后臺盼藍(lán)染色并在細(xì)胞計數(shù)儀上測得各兔細(xì)胞活力平均為77.34%。

1.2.2MSCs的鑒定 每日觀察細(xì)胞形態(tài)，用倒置相差顯微鏡每日觀察體外培養(yǎng)的MSCs增殖和形態(tài)特點(diǎn)，并拍照記錄。MSCs的成骨誘導(dǎo)鑒定：取第3代MSCs以105/孔接種于6孔板種，分為實驗組及對照組，待細(xì)胞融合80%后向?qū)嶒灲M加入成骨誘導(dǎo)液（L-DMEM，體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%雙抗，0.2%抗壞血酸，1%甘油磷酸鈉，0.01%地塞米松），對照組加入完全培養(yǎng)液，隔日換液，誘導(dǎo)3周后行茜素紅染色，并在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3PRP及實驗?zāi)z的制備 制備PRP過程嚴(yán)格無菌，造模前30 min，抽取兔外周血5～10 ml，置于含有1 ml枸櫞酸鉀15 ml離心管中，3 000 r/min離心10 min，抽取上清液，轉(zhuǎn)移至另一離心管3 000 r/min離心10 min，可見離心管中有明顯3層結(jié)構(gòu)上層為貧血小板血漿，中層為富血小板血漿，下層為紅細(xì)胞。在肌腱拉入骨道固定完畢后，在1 ml EP管中分別加入纖維蛋白原與凝血酶按4∶1混合，再加入MSCs細(xì)胞懸液、PRP。即刻形成具有固體性質(zhì)的生物蛋白膠。

1.2.4物模型的建立 12只新西蘭大白兔隨機(jī)分配為4組（n=24）。戊巴比妥麻醉實驗兔（1 ml∶1 kg）后，術(shù)區(qū)備皮，消毒鋪巾，取出趾長屈肌腱，將肌腱對折，對折后其直徑為（2.2±0.2）mm，長度為（15±2）mm，對折后肌腱兩游離端用無菌縫線編織縫合，折疊處用無菌絲線穿過后備用，在距折疊端3 mm處用縫線做好標(biāo)記。再行髕旁內(nèi)側(cè)入路，作長約20 mm的縱行切口，依次鈍性分離皮下筋膜，切開關(guān)節(jié)囊及內(nèi)側(cè)支持帶，將髕骨向外拉開，切除髕后脂肪墊，顯露出前交叉韌帶，切除前交叉韌帶股骨端，保留脛骨端留作標(biāo)記，用和肌腱直徑相匹配的克氏針分別鉆取脛骨及股骨骨道，骨道建立完畢后，測深尺測得股骨道長度（6±1）mm，同時在脛骨及股骨骨道旁用0.5克氏針分別水平鉆取兩骨道至對側(cè)，將編織好的肌腱兩端四線穿過無菌縫針，用縫針穿過脛骨及股骨骨道，且講連接肌腱的絲線用縫針穿過至骨干對側(cè)，將移植物股骨端拉緊至標(biāo)記處到達(dá)股骨道內(nèi)口處，將絲線收緊打結(jié)，屈膝30°將脛骨端收緊打結(jié)。配制MSCs及PRP凝膠，采用頂端注射的方法注入骨道內(nèi)。M組注射MSCs凝膠，P組注射PRP凝膠，MP組周MSCs及PRP凝膠，C組僅注射生物蛋白凝膠。注射后用生物耳膠封閉骨道外口。多次屈伸膝關(guān)節(jié)確保韌帶穩(wěn)定固定牢靠后，逐層縫合切口，無菌輔料包扎，術(shù)后未予以制動，術(shù)后前3 d常規(guī)注射抗生素。

1.2.5動物模型取材及組織學(xué)觀察 于術(shù)后第4、

8和12周3個時間點(diǎn)，分別隨機(jī)處4組實驗兔各2只，取重建韌帶后的膝關(guān)節(jié)，剔除關(guān)節(jié)周圍軟組織，保留重建后的前交叉韌帶，置于EDTA磷酸緩沖鹽種脫鈣6～8周后，脫鈣結(jié)束后按脫水、透明、浸蠟、包埋順序制作蠟塊，將四組關(guān)節(jié)標(biāo)本蠟塊各切片10張（每只兔制作5塊切片），行Masson染色，觀察標(biāo)本出現(xiàn)Sharpy樣纖維的數(shù)量?？梢杂^察到Sharpy樣纖維的切片則記為有。

1.2.64組標(biāo)本組織形態(tài)學(xué)Buark評分 參照Buark評分標(biāo)準(zhǔn)，用目鏡測微尺測量各組標(biāo)本切片腱-骨界面所含Sharpy樣纖維的比例。Buark評分標(biāo)準(zhǔn)為：GradeⅠ缺乏組織結(jié)構(gòu)的疏松纖維血管組織界面；GradeⅡ已機(jī)化的纖維血管組織伴有膠原纖維產(chǎn)生，占有的界面長度＜30%；GradeⅢ成熟的纖維組織，細(xì)胞和血管減少，占有的界面長度30%～60%；GradeⅣ纖維血管組織機(jī)化成致密結(jié)締組織，垂直的骨道方向的Sharpey纖維占有的界面長度＞60%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗及Wilcoxon秩和檢驗。設(shè)定α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的生長及個代的形態(tài)特點(diǎn)原代細(xì)胞培養(yǎng)開始階段，細(xì)胞未貼壁，不易與其他細(xì)胞辨認(rèn)，培養(yǎng)24 h后，可觀察到培養(yǎng)瓶底部有部分貼壁的、透亮的、長梭形的細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)瓶底部貼壁細(xì)胞增多，且增殖較快，培養(yǎng)5 d后，貼壁細(xì)胞鋪滿瓶底，排列較整齊，少部分呈集落生長。細(xì)胞傳代后，第一代及第二代細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞呈多形性，部分貼壁細(xì)胞周圍伸出偽足，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞排列紊亂，第三代細(xì)胞增殖更加迅速，可見明顯集落形成，細(xì)胞呈長梭形，形態(tài)均一，排列整齊，生長旺盛。MSCs成骨誘導(dǎo)分化染色后可見散落在培養(yǎng)皿底部被茜素紅染成紅色的骨細(xì)胞。見圖1。

2.2 組織學(xué)觀察及切片數(shù)量統(tǒng)計M、P及MP組在術(shù)后第4周觀察可見，腱骨連接緊密，界線模糊，可見少量未成熟的軟骨樣細(xì)胞，排列較紊亂，在MP組可見部分成熟的軟骨樣細(xì)胞散在地分布于腱骨界面，并有2張切片中可觀察到Sharpy樣纖維形成，P組、M組未發(fā)現(xiàn)有Sharpy樣纖維形成。術(shù)后8周MP、P、M組均可見Sharpy樣纖維成分且MP組Sharpy樣纖維的含量較4周有增多的趨勢，并出現(xiàn)成熟的軟骨細(xì)胞，并可見軟骨化骨的過程，新生的骨質(zhì)長入移植肌腱內(nèi)，肌腱側(cè)大部分為成熟的成纖維細(xì)胞，而靠近骨隧道側(cè)則大部分由不成熟的成軟骨細(xì)胞構(gòu)成，部分區(qū)域可見軟骨移行帶，其中MP組中成熟的軟骨樣細(xì)胞明顯多于其它兩組。術(shù)后12周，實驗組3組可見大量Sharpy樣纖維形成，纖維軟骨與鈣化軟骨增多，纖維軟骨與鈣化軟骨間有潮線相隔，形成直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)；C組在術(shù)后第4周切片觀察可見大量壞死組織，腱骨間主要由血管肉芽組織連接且連接較松散，第8周腱骨界面連接較前緊密，腱骨界面多為成纖維細(xì)胞，可見少量不成熟的軟骨細(xì)胞，術(shù)后12周可見腱界面連接緊密，腱骨界面出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞且膠原纖維排列整齊，然而可見Sharpy樣纖維的切片數(shù)量僅有1張。MP組含Sharpy樣纖維切片數(shù)量與其余3組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、3。

2.3 Buark評分結(jié)果MP組在術(shù)后12周內(nèi)評分為GradeⅠ的切片數(shù)量有15張，GradeⅡ有5張，GradeⅢ有3張，GradeⅣ有7張與其余3組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3 討論

關(guān)于腱骨愈合的研究報道已有很多，本研究顯示肌腱移植物移植入骨道后，短期內(nèi)肉芽組織大量增生，術(shù)后約8周腱骨界面可見Sharpy樣纖維形成，被認(rèn)為是腱-骨愈合的早期征象［4］。ACL直接止點(diǎn)有典型的4層結(jié)構(gòu)：纖維組織、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨組織。纖維軟骨與鈣化軟骨之間有“潮線”結(jié)構(gòu)［5］，此結(jié)構(gòu)在傳遞緩沖應(yīng)力中起著重要作用。間接止點(diǎn)的特征性結(jié)構(gòu)為Sharpy樣纖維，Sharpy樣纖維是連接肌腱與骨之間的纖維結(jié)構(gòu)［6］。較為理想的腱骨愈合為直接止點(diǎn)愈合。本實驗中，實驗組在術(shù)后第8周組織切片染色后即可觀察到Sharpy樣纖維，術(shù)后12周Sharpy樣纖維明顯增多，并可見直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)。對照組術(shù)后12周組織切片染色后才可觀察到Sharpy樣纖維。說明自體MSCs聯(lián)合PRP可以促進(jìn)腱-骨愈合。

MSCs是一類存在于外周血，骨髓及臍帶血中含有多向分化潛能的干細(xì)胞，被認(rèn)為是理想的“種子細(xì)胞”。研究［7-9］證明MCSs對腱骨愈合有顯著的促進(jìn)作用。實驗中采取自體的MSCs及PRP，避免了異體抗原排斥反應(yīng)，增加了實驗的安全性。，其中含有與創(chuàng)傷愈合和骨再生相關(guān)的多種生長因子，如血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β-1，2、胰島素樣生長因子、表皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等，這些生長因子的濃度約為全血中的17倍，其活性可持續(xù)約一周［10］。多數(shù)學(xué)者［11］認(rèn)為PRP的作用源于這些因子可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂及分化從而可加速損傷組織的修復(fù)。研究［3，12］證明PRP在ACL重建后使得韌帶修復(fù)時間縮短48%。實驗結(jié)果也提示兩個獨(dú)立因素是可以促進(jìn)腱骨愈合的。

通過本次實驗的組織形態(tài)學(xué)觀察及Buark評分的統(tǒng)計學(xué)分析，MSCs及PRP對腱骨愈合都有著促進(jìn)作用。此次試驗結(jié)果顯示二者聯(lián)合作用是要高于獨(dú)立作用的。其機(jī)制可能與PRP加速了MSCs的分裂分化有關(guān)。MSCs在特殊條件下可以分化為多種細(xì)胞，其中PRP也有著對間充質(zhì)干細(xì)胞促分化作用，研究［12］證明PRP有促進(jìn)MSCs向肌腱細(xì)胞分化及加速其分裂繁殖的作用。其機(jī)制可能與PRP所含的細(xì)胞因子有關(guān)，研究［13］證明PRP中的PDGF可以促進(jìn)MSCs的分泌增加細(xì)胞外基質(zhì)，同時刺激其有絲分裂促進(jìn)其增殖，同時表皮生長因子可協(xié)同TGF促進(jìn)MSCs的分化及增殖，PRP的促分裂分化作用使得MSCs早期在骨道內(nèi)得到了大量的增殖及分化加速了腱骨愈合的過程。本實驗仍存在著部分問題例如PRP是否對MSCs僅有促分化分裂作用而無拮抗作用，目前針對PPR對MSCs促分化作用仍有爭議，不同濃度的PRP對MSCs的分裂分化作用是否有著差異。此觀點(diǎn)會在今后的實驗中繼續(xù)探究。實驗中只觀察了腱-骨愈合的形態(tài)學(xué)，對于MSCs聯(lián)合PRP對腱-骨愈合的作用，仍需要在增加樣本量的同時深入對組織學(xué)、生物力學(xué)以及生物化學(xué)的研究，從而可以使其對腱-骨愈合的影響更具有說服力。實驗顯示，聯(lián)合使用MSCs和PRP可促進(jìn)骨道肌腱早期愈合且比二者單獨(dú)使用的作用強(qiáng)。PRP是一種來源比較簡單且和血液中個細(xì)胞因子比例最貼近的細(xì)胞因子復(fù)合物，這些因子因子通過協(xié)同作用有效的促進(jìn)了MSCs的早期分裂。實驗中PRP及MSCs均來自于自體，無異體抗原排斥反應(yīng)，提取方法簡單可行，有很強(qiáng)的臨床應(yīng)用前景。

［1］ Weiler A，Peine R，Pashmineh-Azar A.Tendon healing in a bone tunnel.Part I：Biomechanical results after biodegradable interference fit fixation in amodel of anterior cruciate ligament reconstruction in sheep［J］.Arthroscopy，2002，18（2）：113-23.

［2］ Scranton PE Jr，LanzerW L，etal.Ferguson M S.Mechanismsof anterior cruciate ligament neovascularization and ligamentization［J］.Arthroscopy，1998，14（7）：702-16.

［3］ 呂汝舉，劉美靜.富血小板血漿（RPR）治療技術(shù)及應(yīng)用［J］.中國醫(yī)療器械信息，2013，10（15）：50-5.

［4］ Benjamin M，Kumai T，Milz S，et al.The skeletal attachment of tendons-tendon“entheses”［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physio，2002，133（4）：931-45.

［5］ NebelungW，Becker R，Urbach D，etal.Histological findings of tendon-bone healing following anterior cruciate ligament reconstruction with hamstring grafts［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2003，123（4）：158-63.

［6］ Fran?ois R J，Braun J，Khan M A，etal.Enthesesand enthesitis：a histopathologic review and relevance to spondyloarthritides［J］. Curr Opin Rheumatol，2001，13（4）：255-64.

［7］ 鄔曉勇，劉玉杰，石 斌.自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)交叉韌帶重建后腱骨愈合的研究［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報，2010，31（10）：954-6.

［8］ Tian F，Ji X L，Xiao W A，et al.CXCL13 promotes the effect of bonemarrow mesenchymal stem cells（MSCs）on tendon-bone healing in rats and in C3HIOT1/2 cells［J］.Int JMol Sci，2015，16（2）：3178-87.

［9］ Kanazawa T，Soejima T，Noguchi K，et al.Tendon-to-bone healing using autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in ACL reconstruction without a tibial bone tunnel-A histological study［J］.Muscles Ligaments Tendons J，2014，4（2）：201-6.

［10］Li Y G，Wei JN，Lu J，et al.Labeling and tracing of bonemarrow mesenchymal stem cells for tendon-to-bone tunnel healing［J］. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2011，19（12）：2153-8.

［11］Okuda K，Kawase T，Momose M，et al.Platelet-rich plasma contains high levels of platelet-derived growth factor and transforming growth factor-beta and modulates the proliferation of periodontally related cells in vitro［J］.JPeriodontol，2003，74（6）：849-57.

［12］Radice F，Yánez R，Gutiérrez V，et al.Comparison ofmagnetic resonance imaging findings in anterior cruciate ligament graftswith and without autologous platelet-derived growth factors［J］.Arthroscopy，2010，26（1）：50-7.

［13］Street J，Bao M，de Guzman L，et al.Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2002，99（15）：9656-61.

Effect of MSCs in combination w ith PRP on tendon-bone healing of ACL reconstuction

Yang Junjun，Xu Bin，Xu Honggang，et al
（Dept of Sports Injury Arthroscopic Surgery，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the effectof autologousmesenchymal stem cell（MSC）in combination with platelet rich plasma（PRP）transplantation on tendon-bone healing after anterior cruciate ligament（ACL）reconstruction.MethodsPeripheral blood the harvested from rabbits to obtain MSCs.24 adult New Zealand rabbitswere randomly divided into M，P，PM and C group（n=24）.Rabbits in M group were injected with MSCs via thrombin rabbits in P group were injected with PRP via thrombin，rabbits in MP group were injected with amixture of MSCs，PRP via thrombin，while rabbits in C group were injected with only sodium hyaluronate.Four rabbitswere killed 4，8 and 12 weeks after operaton and samples were collected for histological observation of tendon-bone healing.ResultsScar tissue with some Sharpey′s-like fiber components on the tendon-bone interface and a close tendon-bone conjugation were observed 4 weeks in MP group.As the extension of healing time after operation，Sharpy's like fiber could be observed in group M，group P，group C successively and the amount of Sharpy's like fiberwas increasing. Differences of the histomorphology Buark score of each group were significant（P＜0.05）ConclusionMSCs in combination with PRP can promote tendon-to-bone healing，and more effective than that of single factor.

mesenchymal stem cells；platelet rich plasma；anterior cruciate ligament；tendon bone healing

R 686

A

1000-1492（2016）03-0368-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.026.html

2015-12-08接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1208085MH157）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動創(chuàng)傷與關(guān)節(jié)鏡外科，合肥230022

楊軍軍，男，碩士研究生；

徐 斌，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：youchen100@126.com