Stathm in在胰腺癌中的表達(dá)及意義

黃 敏，余 躍，張 旭，丁 飛，高 萌，許 朝，胡 聞

Stathm in在胰腺癌中的表達(dá)及意義

黃 敏1，2，余 躍1，張 旭2，丁 飛1，高 萌1，許 朝1，胡 聞3

目的探討Stathmin在胰腺癌中的表達(dá)水平以及與臨床、病理特征方面的關(guān)系。方法通過免疫組化法和原位雜交技術(shù)分別檢測40例胰腺癌癌組織、27例胰腺癌旁正常組織中Stathmin及其mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果Stathmin在胰腺癌癌組織的陽性率顯著高于胰腺癌旁正常組織（77.5%vs7.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Stathmin mRNA的表達(dá)陽性率也明顯高于癌旁正常組織（80.0%vs 7.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期等方面胰腺癌組織之間的Stathmin表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論Stathmin及其mRNA在胰腺癌組織的高水平表達(dá)，與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，提示Stathmin可能參與了胰腺癌發(fā)生、發(fā)展，Stathmin對胰腺癌的早期診斷及預(yù)后判斷有重要意義。

胰腺癌；Stathmin；免疫組化；原位雜交

胰腺癌為常見消化道惡性腫瘤之一，5年生存率僅6%［1］。Stathmin化學(xué)本質(zhì)是一種微管不穩(wěn)定磷蛋白，在細(xì)胞周期不同階段通過磷酸化和去磷酸化作用來影響細(xì)胞內(nèi)微管系統(tǒng)動力狀態(tài)，從而對細(xì)胞周期的進(jìn)程變化發(fā)揮了至關(guān)重要作用。研究［2］顯示Stathmin在多種人類惡性腫瘤中呈高水平表達(dá)，但在胰腺癌的過表達(dá)現(xiàn)象國內(nèi)外研究卻鮮有報(bào)道。該研究通過采用免疫組化、原位雜交方法分析Stathmin及mRNA在胰腺癌組織高水平表達(dá)情況，探討其與臨床、病理特征方面的關(guān)系，旨在為胰腺癌的早期診斷、預(yù)后判斷提供一種新的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料與組織標(biāo)本選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2009年4月～2014年5月經(jīng)手術(shù)切除治療，臨床資料完整的胰腺癌患者40例，均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)。其中男23例，女17例；年齡41～73（60.52±7.54）歲；腫瘤?2～8 cm；高、中分化組18例，低分化組22例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組19例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組21例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組21例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組19例；TNM分期：Ⅰ期0，Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期21例。術(shù)前所有患者均沒有接受放療、化療等相關(guān)治療。選取了同期手術(shù)的胰腺癌旁正常組織27例作對照。

1.2 主要試劑及探針鼠抗人的Stathmin抗體（英國Abcam公司）；濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Stathmin mRNA的原位雜交試劑盒（武漢博士德公司）；Stathmin基因的寡核苷酸探針序列為：5′-TCTTTCACCTGGATATCAGAAGA AGCCAT-3′。

1.3 方法

1.3.1應(yīng)用原位雜交法檢測 石蠟切片先脫蠟，再脫水；然后用3%H2O2來滅活內(nèi)源性的過氧化物酶，在室溫下處理30 min之后，再用蒸餾水沖洗；用新鮮配制的胃蛋白酶暴露mRNA的核酸片段，37℃消化10～30 min，隨后用PBS沖洗；濕雜交盒準(zhǔn)備：干雜交盒在底部添加20%甘油約20 ml來保持濕度；預(yù)雜交：先滴加些預(yù)雜交液，20μl/片，再放置于42℃的恒溫箱內(nèi)連續(xù)孵育4 h；雜交：先甩去了玻片上的多余液體，再滴加些雜交液，20μl/片，隨后將原位雜交的專用蓋玻片上保護(hù)膜揭開，隨即蓋在切片上面，再放置于42℃的恒溫箱內(nèi)連續(xù)孵育14 h；雜交之后洗滌：先揭開了蓋玻片，再把上述玻片用30～37℃間水溫的2×SSC沖洗2次，每次5 min，之后0.5×SSC沖洗1次，每次15 min，再后0.2× SSC沖洗1次，每次15 min；之后滴加上封閉液，予20μl/片，隨后放置于37℃恒溫箱中30 min；滴加以生物素化鼠抗地高辛：放置于37℃恒溫箱內(nèi)60 min，PBS沖洗；滴加了SABC：放置于37℃恒溫箱內(nèi)20 min，PBS沖洗；滴加了生物素化過氧化物酶：放置于37℃恒溫箱內(nèi)20 min，PBS沖洗；經(jīng)過DAB顯色、之后復(fù)染、隨后脫水，再后透明，最后封片。

1.3.2應(yīng)用免疫組化法染色 先脫蠟、之后水化其組織切片，再抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水孵育，來阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶，之后加Stathmin一抗（1∶100）放置在37℃恒溫箱內(nèi)持續(xù)孵育2 h，再用PBS沖洗，再滴加通用型的IgG抗體-HRP多聚體，放置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育15 min，PBS沖洗。DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對照試驗(yàn)：使用PBS替代一抗。其余同上所述的操作步驟。

1.3.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Stathmin mRNA以及Smthmin蛋白的陽性表達(dá)都位于細(xì)胞的胞質(zhì)，其著色呈棕黃色，在高倍顯微鏡下觀察時(shí)隨機(jī)地選取5個(gè)視野（觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)/每個(gè)視野），按照細(xì)胞的著色深淺程度、陽性細(xì)胞所占百分率兩方面結(jié)合來進(jìn)行結(jié)果判定［3］。①按照細(xì)胞著色深淺的程度評分：0分，細(xì)胞無顯色；1分，呈淡黃色；2分，呈棕黃色；3分，呈棕褐色。②按陽性細(xì)胞數(shù)所占百分率，＜5%視為0分，5%～25%視為1分，26%～50%視為2分，51%～75%視為3分，＞75%視為4分。取①②兩項(xiàng)的評分乘積值作為總積分，總積分0分判為陰性（-），1～4分判為弱陽性（+），5～8分判為陽性（），9～12分判為強(qiáng)陽性（）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。采用了四格表資料χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本率比較。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌StathminmRNA表達(dá)Stathmin mRNA原位雜交表達(dá)陽性的顯色，位于胞質(zhì)，顯示棕黃色顆粒（圖1）。在胰腺癌癌組織、癌旁正常組織呈不同水平表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為80.0%、7.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=33.985，P＜0.05）。

2.2 胰腺癌的Stathmin蛋白表達(dá)Stathmin蛋白陽性表達(dá)，位于胞質(zhì)，顯示棕黃色顆粒（圖2）。在胰腺癌癌組織、癌旁正常組織呈不同水平表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為77.5%、7.4%。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.685，P＜0.05）。

2.3 Stathmin蛋白的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系對免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)一步分析顯示Stathmin蛋白的表達(dá)水平與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期存在密切相關(guān)性，即分化程度越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，TNM分期越晚者Stathmin蛋白表達(dá)的陽性率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中胰腺癌低分化組的Stathmin蛋白陽性表達(dá)率95.5%，顯著高于高、中分化組55.6%（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率為95.2%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組57.9%（P＜0.05）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組陽性率94.7%，顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組61.9%（P＜0.05）；臨床分期Ⅲ+Ⅳ期組陽性率為95.2%，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期組57.9%（P＜0.05）。但是Stathmin蛋白胰腺癌的表達(dá)，與年齡、性別及病理類型均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3 討論

眾多研究報(bào)道Stathmin在多種惡性腫瘤中如口腔鱗癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤等表達(dá)增高。研究［4］顯示人類乳腺癌中含有突變型的p53基因細(xì)胞系的Stathmin增強(qiáng)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)其中由于野生型p53的基因突變或缺失，從而使野生型p53的基因介導(dǎo)Stathmin的蛋白表達(dá)負(fù)性調(diào)節(jié)作用明顯減弱，這很可能是多種惡性腫瘤Stathmin高水平表達(dá)方式的主要機(jī)制之一。研究［5］通過觀察在肝癌細(xì)胞中表達(dá)Stathmin，發(fā)現(xiàn)了其中p27通過抑制其Stathmin阻止與微管分離作用，干擾了細(xì)胞間期的微管功能，若上調(diào)p27肝癌細(xì)胞中表達(dá)，可能抑制了Stathmin蛋白的促肝癌細(xì)胞的分裂、增殖功能，從而降低分裂、增殖能力。本研究顯示Stathmin mRNA和蛋白在胰腺癌的組織中均呈現(xiàn)高水平表達(dá)，與胰腺癌旁正常組織表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。提示Stathmin可能與胰腺癌發(fā)生相關(guān)連，這與國外文獻(xiàn)報(bào)道Stathmin在其他多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為上是一致的。Jiang etal［6］發(fā)現(xiàn)Stathmin過表達(dá)能阻止轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)早期基因1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長抑制，靶向Stathmin的小干擾RNA能抑制胰腺癌細(xì)胞生長。

本研究還觀察到低分化組胰腺癌組織陽性表達(dá)率明顯高于高、中分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Stathmin呈彌漫性分布，且腫瘤細(xì)胞分化程度越低，則Stathmin表達(dá)越增強(qiáng)。因此，表明了Stathmin表達(dá)與其細(xì)胞的分化程度相關(guān)。Stathmin的表達(dá)很可能是胰腺癌的分化程度標(biāo)志之一。

本研究進(jìn)一步觀察到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，臨床分期較晚的Ⅲ+Ⅳ期組顯著高于較早的Ⅰ+Ⅱ期組。表明Stathmin異常高水平表達(dá)，與胰腺癌生物學(xué)行為間有密切相關(guān)。王峰等［7］研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌的細(xì)胞系的Stathmin mRNA及其蛋白均出現(xiàn)高表達(dá)水平。其與食管鱗癌分化的程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、腫瘤的浸潤深度以及TNM分期等方面顯著相關(guān)，食管鱗癌的組織中Stathmin mRNA及蛋白陽性表達(dá)率較癌旁組織以及正常的食管黏膜組織相比明顯增高。Jeon et al［8］也發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白過表達(dá)現(xiàn)象可能與胃癌分化的程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、癌瘤浸潤深度等方面以及TNM分期有關(guān)；胃癌Stathmin的蛋白陽性表達(dá)患者其無復(fù)發(fā)的中位生存期明顯小于Stathmin的蛋白陰性表達(dá)的患者。使用siRNA技術(shù)把SNV16胃癌的細(xì)胞系Stathmin敲除后，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞增殖、移行以及浸潤等方面惡性的生物學(xué)行為上受到了明顯抑制。

綜上所述，Stathmin及其mRNA在胰腺癌組織中表達(dá)明顯增高。Stathmin高水平表達(dá)與胰腺癌患者的年齡、性別及病理類型方面無關(guān)，而與其分化的程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期等生物學(xué)行為密切相關(guān)。

［1］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A，et al.Cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2013，63（1）：11-30.

［2］ Belletti，Baldassarre，Stathmin：a protein with many tasks.New biomarker and potential target in cancer［J］.Expert Opin Ther Targets，2011，15（11）：1250-65.

［3］ Gfroerer S，Metzger R，F(xiàn)iegel H，etal.Differential changes in intrinsic innervation and interstitial cellsof Cajal in small bowel atresia in newborns［J］.World JGastroenterol，2010，16（45）：5716 -21.

［4］ Afli E，Bash Bnhula J，Yang JM，etal.Effectof stathmin on the sensitivity to antimicrotubule drugs in human breast cancer［J］. Cancer Res，2002，62（23）：6864-9.

［5］ Wang X Q，Lui E L，CaiQ，etal.p27Kip1 promotesmigration of metastatic hepatocellular carcinoma cells［J］.Tumour Biol，2008，29（4）：217-23.

［6］ Jiang L，Chen Y，Chan C Y，etal.Down-regulation of stathmin is required for TGF-beta inducible early gene 1-induced growth inhibition of pancreatic cancer cells［J］.Cancer Lett，2009，274（1）：101-8.

［7］ 王 峰，王留興，何偉，等.Stathmin基因在食管鱗癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（7）：1552-7.

［8］ Jeon T Y，Han M E，Lee YW，etal.Overexpression of stathmin1 in the diffuse type ofgastric cancer and its roles in proliferation and migration of gastric cancer cells［J］.Br JCancer，2010，102（4）：710-8.

Clinical significance of expression of stathm in in pancreatic cancer

Huang Min1，2，Yu Yue1，Zhang Xu2，et al
（1Division of Gastroenterology，Affiliated Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001；2Division of Gastroenterology，The Third Hospital of Bengbu City，Bengbu 233000；3Division of Pathology，Affiliated Provincial Hospital，AnhuiMedical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the relationship between the clinicopathological features and Stathmin expression in pancreatic cancer.MethodsExpressions of Stathmin and Stathmin mRNA were detected in 40 pancreatic cancer samples，27 adjacent normal samples of pancreatic cancer by immunohistochemistry and in situ hybridization，respectively.ResultsStathmin positive rate in pancreatic cancer sampleswas significantly higher than that of adjacent normal samples of pancreatic cancer（77.5%vs 7.4%，P＜0.05）；the positive rate of Stathmin mRNA expression was also higher than thatof adjacentnormal samples of pancreatic cancer（80.0%vs7.4%，P＜0.05）. Stathmin expression levelswere signifecantly correlated to the differentiation degree，lymph nodemetastasis，distantmetastasis and TNM staging for pancreatic cancer（P＜0.05）.ConclusionHigher expression of Stathmin and mRNA in pancreatic cancerwere closely related to the differentiation degree for pancreatic cancer，lymph node metastasis，distantmetastasis and TNM staging，suggesting Stathmin may be involved in oncogenesis of pancreatic cancer.Stathmin may play important roles in early diagnosis and prognosis of pancreatic cancer.

pancreatic cancer；Stathmin；immunohistochemistry；in situ hybridization

R 735.9

A

1000-1492（2016）03-0446-04

時(shí)間：2016/1/28 14：23：11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.062.html

2016-01-07接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1508085SQH224）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230001

2安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，蚌埠 233000

3安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科，合肥 230001

黃 敏，碩士研究生；

余 躍，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yuyuemd@hotmail.com