真核表達(dá)產(chǎn)物Y3誘導(dǎo)煙草對煙草花葉病毒的抗性研究

張志云，邊葉雨，黃 航，韓瀟瀟，吳 蘭，吳麗萍

（南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/南昌大學(xué)鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330031）

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是單鏈RNA病毒，感染煙草、辣椒等經(jīng)濟(jì)作物[1]，化學(xué)農(nóng)藥作為當(dāng)前控制病害發(fā)生的主要手段，對人體和環(huán)境都有很大的危害。目前，天然活性物質(zhì)因其無公害、無污染、無殘留等優(yōu)點(diǎn)[2]，而成為抗TMV藥物研究熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

蛋白質(zhì)是抗病毒生物活性物質(zhì)之一。例如商陸[3]、多種食用菌（香菇、平菇、茶樹菇和毛頭鬼傘等）的抽提物[4]有鈍化TMV的作用；超敏蛋白[5]、粉紅單端孢菌體[6]中的蛋白激發(fā)子可使植物體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等酶活性增強(qiáng)；激發(fā)子Hrip1[7]、PevD1[8]、BDP-30[9]、GP-1[10]、PeaT1[11]都被證明可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。由此可見，一些蛋白質(zhì)在植物防御機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。但目前商品化的抗病毒蛋白制劑品種少，不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上多品種、大規(guī)模的需求，因此有必要尋找更多具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)類制劑。

誘導(dǎo)子或激發(fā)子激活植物免疫系統(tǒng)，提高植物防御力，植物組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生理生化發(fā)生變化。由細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙的產(chǎn)生木質(zhì)素和胼胝質(zhì)可以避免植物水分及營養(yǎng)的流失而抑制了病原的繁殖[12]；同時也伴隨著活性氧（ROS）、離子通量改變、水楊酸（salicylic acid，SA）積累、植物防御酶、防御基因激活等改變[13]。POD參與木質(zhì)素的合成；PPO參與與酚類物質(zhì)的氧化過程；PAL與SA的生物合成有關(guān)[14]。在SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，NPR1編碼的氧化還原敏感蛋白調(diào)控病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein，PR）的表達(dá)，β-1,3葡聚糖酶是PR家族的一員[15]，最終激發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired，SAR），也是SAR重要調(diào)控因子[16]。

Y3蛋白分離于毛頭鬼傘Coprinuscomatus，分子量約為14.4 kD[16]，濃度為2.0 μg/mL時，對TMV的抑制率為50%[18,19]，其后獲得了Y3cDNA序列及轉(zhuǎn)基因煙草，轉(zhuǎn)基因煙草也表現(xiàn)出一定的抗病毒活性[20]。且Y3能與TMV外殼蛋白（CP）互作[21]。前期研究表明Y3具有抗病毒活性，但在植物體內(nèi)的抗病毒活性及其在植物系統(tǒng)抗性中的潛在作用卻鮮有報道。

為了明確 Y3蛋白是否可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗病性及可能的作用機(jī)制，本研究利用畢赤酵母表達(dá)重組蛋白Y3，通過測定植物防御酶（PAL，POD，PPO，β-1,3葡聚糖酶）活性、防御基因（PR1-a，PR1-b，NPR1，PAL）表達(dá)水平，以探討該蛋白處理后煙草對TMV的抗性，為后續(xù)Y3誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

質(zhì)粒pPIC-9k，畢赤酵母PichiapastorisGS115，大腸桿菌EscherichiacoliDH5α，普通煙Nicotiana tabacumK326種子均保存于本實(shí)驗(yàn)室，TMV保存于普通煙K326葉片，毛頭鬼傘新鮮子實(shí)體購自福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所。

限制性內(nèi)切酶Not I、Bg1 Ⅱ、EcoR I、PrimerSTAR Max Premix購自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit、Ultrapure RNA Kit、HiFiScript cDNA Synthesis Kit、DNA Purification Kit、pClone007 Versatile Simple Vertor Kit、PurePlasmid Maxi Kit均購自康為世紀(jì)有限公司；E.coli Ploly (A) Polymerase購于New England Biolabs，引物合成及測序由上海生工完成。無氨基氮源（YNB），生物素，遺傳霉素（G418）購自索萊寶生物。

培養(yǎng)基配方。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L；YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L；MD培養(yǎng)基：YNB 13.4 g/L、葡萄糖20 g/L、生物素0.4 mg/L、瓊脂15 g/L；MM培養(yǎng)基：YNB 13.4 g/L、甲醇5 mL/L、生物素0.4 mg/L、瓊脂15 g/L。BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、1.0%甘油、YNB 13.4 g/L、磷酸鉀緩沖液100 mL、生物素0.4 mg/L；BMMY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、1.0%甲醇、YNB 13.4 g/L、磷酸鉀緩沖液100 mL、生物素0.4 mg/L。

1.2 Y3 cDNA基因擴(kuò)增

根據(jù)Y3cDNA （Accession：GQ859168）序列及pPIC-9K載體序列，設(shè)計特異性引物并加入酶切位點(diǎn)。Y3正向引物序列加入 EcoR I位點(diǎn)（用下劃線表示）：5′-CCGGAATTC ATGCATCATCACCATCAC CATATGATCTCCACCAAGATTTTCACC-3′，反向引物序列加入 Not I位點(diǎn)：5′-CCGGCGGCCGCTTAGAA GTCGGTGCTACAATCACCAT-3′。按照 Ultrapure RNA Kit說明書提取毛頭鬼傘總 RNA，用 HiFiScript cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 的第一條鏈，反應(yīng)體系：6 μL RNA、2 μL Primer Mix、4 μL dNTP Mix、2 μL DTT、4 μL 5×RT Buffer、1 μL HiFi Script、1 μL RNase-Free Water，42 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。隨后擴(kuò)增Y3cDNA，PCR 反應(yīng)體系：Primer STAR Max Premix (2×) 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。根據(jù)Gel Extraction Kit說明書將PCR產(chǎn)物膠回收，隨后用DNA Purification Kit將膠回收產(chǎn)物進(jìn)行純化，根據(jù)大腸桿菌Ploly (A) Polymerase說明書加A尾，與pUC-T載體連接后形成載體pUC-T-Y3轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素（ampicillin，Amp，50 mg/mL）進(jìn)行篩選，菌液經(jīng)PCR鑒定后送上海生工測序。

1.3 重組表達(dá)載體pPIC-9k-Y3的構(gòu)建及畢赤酵母GS115的轉(zhuǎn)化

根據(jù)PurePlasmid Maxi Kit說明書提取質(zhì)粒pUC-T-Y3，用EcoR I和Not I將pUC-T-Y3質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得攜帶酶切位點(diǎn)的基因Y3后，用T4 DNA連接酶將Y3cDNA與相同酶切處理的pPIC-9k載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，對生長在LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 mg/mL，卡那霉素Kana 50 mg/mL）上的菌落進(jìn)行雙酶切鑒定和測序，用以驗(yàn)證重組質(zhì)粒pPIC-9k-Y3構(gòu)建是否成功。

用Bg1 Ⅱ線性化處理重組質(zhì)粒pPIC-9k-Y3后將其電轉(zhuǎn)化入酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中（1.5 KV，25 μF，200 Ω），同時電轉(zhuǎn)同樣酶切處理的空載體pPIC-9k為陰性對照。細(xì)胞培養(yǎng)1 h （28 ℃、150 r/min） 后，涂布于 MD固體培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng) 2～3 d，挑取單菌落接種到 MM、MD 以及含遺傳霉素 G418（Geneticin）濃度為1、2、3和4 mg/mL的 YPD平板上，篩選甲醇利用高拷貝型轉(zhuǎn)化子。在 4 mg/mL G418-YPD平板上生長良好的菌株為高拷貝型。挑取高拷貝型單菌落接種到含的300 μL YPD液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素100 mg/mL，卡那霉素50 mg/mL）的1.5 mL離心管中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，13000 r/min離心3 min，收集菌體，用0.01 mol/L PBS和蒸餾水洗滌菌體，13000 r/min離心3 min后重懸于0.02 mol/L NaOH，沸水浴5 min，液氮速凍30 s，反復(fù)煮凍3次，最后一次用沸水煮5 min以裂解酵母。以裂解的菌體為PCR反應(yīng)的模板，進(jìn)行PCR鑒定以篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.4 Y3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

挑取上述陽性轉(zhuǎn)化子于5 mL YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)12～14 h取1 mL接種于50 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)16～18 h，至OD600為2.0～6.0；4000 r/min離心10 min收集菌體，重懸于10 mL的BMMY液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)至300 mL BMMY液體培養(yǎng)基中28 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng) 5～7 d，每隔 24 h添加 1%甲醇[22]。培養(yǎng) 7 d后收集菌液，取 10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE。抗His標(biāo)簽兔多克隆抗體為一抗，山羊抗兔IgG （H+L）為二抗，進(jìn)行Western-blot分析檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物Y3對煙草的誘導(dǎo)抗病性效果檢測

1.5.1 Y3誘導(dǎo)煙草防御相關(guān)酶活性測定 普通煙K326播種于營養(yǎng)土中，在溫室（25 ℃～30 ℃）中光照16 h，黑暗8 h培養(yǎng)，至8～9葉期時進(jìn)行試驗(yàn)。對照組（H2O+TMV）：噴灑清水；實(shí)驗(yàn)組（EP+TMV）：噴灑濃度為300 μg/mL空質(zhì)粒（pPIC-9k）菌株誘導(dǎo)上清1 mL于煙草葉片；實(shí)驗(yàn)組（EY3+TMV）：噴灑1 mL 300 μg/mL Y3蛋白誘導(dǎo)上清。處理葉片為每株煙草的下位兩片煙葉，在24 h后在處理煙葉上摩擦接種TMV[23]，1 g帶TMV的普通煙K326病葉于10 mL 0.01 moL/L PBS （pH=7.2） 緩沖液中研磨，四層紗布過濾。各處理5株，重復(fù)3次。分別在試驗(yàn)處理后1、3、5、7、9 d[24]，采集處理葉上位葉，液氮速凍后于-80 ℃冷凍保存。

采用BCA （bicinchoninic acid）法測定總蛋白；分別用PPO、PAL、POD試劑盒根據(jù)說明書測定各時期酶活性變化（BCA，酶活試劑盒均購于南京建成生物工程研究所）；PAL在OD290以每毫克蛋白每分鐘變化0.1為一個酶活力單位，PPO在OD420每毫克蛋白變化0.01為一個酶活力單位，POD以每毫克蛋白催化1 μg底物為一個酶活力單位。β-1,3葡聚糖酶活性測定采用趙凱等[25]的方法。每處理3次重復(fù)。

1.5.2 煙草病情調(diào)查 1.5.1相同處理后第 20 d進(jìn)行煙草花葉病調(diào)查，并參照煙草病害分級標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23222）對其病情進(jìn)行分級[26]。

1.5.3 Y3誘導(dǎo)煙草抗病相關(guān)基因分析 按Ultrapure RNA Kit說明書提取煙草總RNA，用HiFiScript cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，以β-actin為內(nèi)參基因，分別以PR1a、PR1b、NPR1、PAL抗病相關(guān)基因特異引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min ；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)。每處理3重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物Table 1 The primers in qRT-PCR

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS25.0單因素ANOVA檢驗(yàn)方差分析，顯著性分析使用最小顯著性差異LSD和沃勒-鄧肯（W）法，用Origin軟件作圖。熒光定量數(shù)據(jù)根據(jù)Ct值計算出相對表達(dá)量，計算公式如下:目的基因相對表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=［（Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因）處理組－（Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因）對照組］。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y3 cDNA克隆與重組表達(dá)載體pPIC-9k-Y3的雙酶切驗(yàn)證

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增獲得Y3cDNA約400 bp （圖1A）；重組質(zhì)粒pUC-T-Y3的菌液PCR約400 bp （圖1B）。測序結(jié)果與NCBI上已提交的Y3蛋白序列（Accession：AEE87275）進(jìn)行BLAST比對，同源性為96%，表明Y3cDNA已成功插入pUC-T載體中，pUC-T-Y3與pPIC-9K質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，獲得2個片段分別為400和9300 bp，其中400 bp為Y3cDNA，9300 bp與pPIC9K質(zhì)粒大小一致（圖2），表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPIC-9k-Y3。

圖1 Y3基因擴(kuò)增與鑒定Fig.1 Amplification and identification of Y3 gene

圖2 重組質(zhì)粒pPIC-9k-Y3雙酶切Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid pPIC-9k-Y3

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western-blot檢測

取誘導(dǎo)5、6、7 d的空質(zhì)粒pPIC9K和重組蛋白菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖3A）。泳道1～3在約16 kD處均有單一條帶，且第6 d時效果較好。取甲醇誘導(dǎo)第6 d培養(yǎng)液上清，經(jīng)SDS-PAGE后進(jìn)行Western-blot檢測，在16 kD處有單一條帶（圖3B）表明Y3重組蛋白已經(jīng)成功表達(dá)。

圖3 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE及Western-blot分析Fig.3 SDS-PAGE and Western-blot analysis of recombinant protein expression product

2.3 重組蛋白Y3抗TMV效果分析

2.3.1 Y3誘導(dǎo)煙草抗性相關(guān)酶活性 重組蛋白Y3對煙草抗病相關(guān)酶的影響表明，β-1,3葡聚糖酶活性逐漸下降，在1～5 d內(nèi)Y3處理組始終顯著低于清水處理組（P＜0.05）；對PPO、PAL有升高作用，但差異不顯著（P＞0.05）。噴施重組蛋白Y3 1 d后接種TMV，PPO和PAL活性分別在24 h、3 d達(dá)到最大，隨后保持相對穩(wěn)定；POD酶活性在1 d內(nèi)達(dá)到最大（圖4）。

圖4 Y3誘導(dǎo)煙草抗性相關(guān)酶活性結(jié)果Fig.4 Activity changes of resistance-related enzyme in tobacco treated with Y3

2.3.2 Y3提高煙草抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 對5個基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一且與預(yù)期相符（圖5），符合qRT-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 瓊脂糖凝膠電泳檢測引物特異性Fig.5 Gel-lectrophoresis of primers

蛋白Y3誘導(dǎo)煙草葉片抗性相關(guān)基因表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，NPR1表達(dá)量總體下降，但高于對照組的表達(dá)量。PAL基因在第3 d時驟增，PAL基因與SA的合成相關(guān)，表明SA合成。PR1-a在Y3處理1 d后誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)量與對照組相差不大。對照組中PR1-b表達(dá)量逐漸降低，而噴施蛋白Y3后第1 d時，表達(dá)量達(dá)到最高，同時含空質(zhì)粒 pPIC-9k酵母菌也會誘導(dǎo)PR1-a、PR1-b基因的表達(dá)量升高。Y3處理后與對照相比，PAL和NPR1表達(dá)量差異顯著（P＜0.05），PR1-b除第3 d外，表達(dá)量始終顯著高于清水處理組（P＜0.05），而PR1-a差異不顯著（P＞0.05）。Y3對PR1-a的誘導(dǎo)升高作用不明顯，但能顯著誘導(dǎo)NPR1、PAL、PR1-b表達(dá)量升高（圖6）。

圖6 Y3誘導(dǎo)煙草抗性相關(guān)基因qRT-PCR結(jié)果Fig.6 The result of resistance-releated genes induced Y3 in tobacco

2.3.3 重組蛋白Y3對 TMV的防治效果 重組蛋白Y3噴施煙草葉片1 d后，摩擦接種TMV。各處理組在第20 d時進(jìn)行病情調(diào)查（圖7），清水處理組花葉癥狀明顯，EP處理組還出現(xiàn)葉片黃化，Y3蛋白處理組癥狀明顯減輕，表明Y3可以作為防治TMV的候選肽。

圖7 煙草感染TMV后癥狀Fig.7 The symptom of tobacco after infect with TMV

3 討論

化學(xué)農(nóng)藥的長期使用嚴(yán)重地破壞生態(tài)環(huán)境，而植物源農(nóng)藥與環(huán)境相容性好，易降解，且植物病原不易對其產(chǎn)生抗性[27]，為研制抗病毒制劑開辟了新的方向。植物抗病毒蛋白一般與靶蛋白結(jié)合[28]，觸發(fā)植物免疫反應(yīng)。PevD1通過與Nbnrp1蛋白互作，引起煙草體內(nèi)PPO、PAL等酶活性增強(qiáng)，植物產(chǎn)生抗病性[29]；PeaT1可上調(diào)PR-1a和PR-1b的轉(zhuǎn)錄，同時識別位于煙草質(zhì)膜上的DREPP蛋白[11]；苦瓜素α-MMC可激活煙草的抗氧化系統(tǒng)，并使POD酶活性增強(qiáng)[23]。通過RT-PCR克隆了Y3cDNA，并構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC-9k-Y3，在畢赤酵母GS115中以28 ℃、250 r/min、1.0%甲醇誘導(dǎo)6 d表達(dá)量最佳。Y3重組蛋白誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)結(jié)果表明 PPO、PAL的酶活性升高，其中 PAL是水楊酸合成的關(guān)鍵酶[30]。另外，PR1b、NPR1基因的表達(dá)量在1 d內(nèi)顯著上調(diào)。在植物抗病毒過程中，SA積累誘導(dǎo)SAR的發(fā)生，同時細(xì)胞內(nèi)外氧化還原狀態(tài)改變，NPR1蛋白磷酸化并與TGA轉(zhuǎn)錄因子的互作促進(jìn)PR基因轉(zhuǎn)錄[31]，因此NPR1基因在SAR中起關(guān)鍵作用。有研究表明，煙草感染TMV后，SA積累和病程相關(guān)蛋白（PRs）表達(dá)[32]，表明Y3蛋白可能通過SA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激發(fā)SAR，提高煙草的抗病毒活性。激發(fā)子PevD1對PAL的影響在第6 d達(dá)到峰值，PPO和POD在第5 d達(dá)到峰值[8]；Hrip1處理煙草3 d后PR1基因顯著表達(dá)[7]，而Y3處理1 d后PR1b基因表達(dá)，表明Y3可以更有效地激活煙草的防御系統(tǒng)。GP-1處理煙草后TMV CP積累減少，且破壞TMV粒子結(jié)構(gòu)，表明GP-1可與TMV直接互作，同時也可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[10]。前期研究表明Y3蛋白與TMV衣殼蛋白結(jié)合，阻止了TMV的復(fù)制[21]。由此可見，Y3可通過直接與TMV作用和激活SAR兩個方面提高煙草的抗病性。

本研究噴施重組蛋白Y3后煙草花葉病癥狀明顯減輕，表明Y3可以誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性。吳麗萍等[17]的研究表明Y3濃度為12.5 μg/mL時對TMV的侵染率達(dá)83.0%，另外有學(xué)者將Y3 cDNA轉(zhuǎn)化入煙草NC89，感病后癥狀出現(xiàn)時間晚且較輕[20]。本研究為Y3在煙草抗TMV的功能進(jìn)一步奠定基礎(chǔ)。

蛋白Y3在煙草抗TMV的過程中，可誘導(dǎo)防御相關(guān)酶活性和抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化。然而，是否還有其他信號分子參與了Y3誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性，以及Y3的純化條件還需要進(jìn)一步的研究。本研究為探討Y3在植物對TMV感染的系統(tǒng)抗性反應(yīng)中的作用提供了依據(jù)。