百合病毒檢測技術(shù)研究進展

陳　進

(濰坊工程職業(yè)學院 應(yīng)用化學與生物工程學院，山東 青州　262500)

?

百合病毒檢測技術(shù)研究進展

陳進

(濰坊工程職業(yè)學院 應(yīng)用化學與生物工程學院，山東 青州262500)

摘要：百合病毒病是影響百合切花和種球產(chǎn)量與質(zhì)量的關(guān)鍵問題之一。針對百合病毒檢測技術(shù)的研究有利于及早發(fā)現(xiàn)感染百合植株的病毒，并及時采取相應(yīng)措施。本文對目前較為常用的四種百合病毒檢測方法進行了闡述，并對每種方法的優(yōu)越性和局限性進行了介紹和對比，旨在為后續(xù)的病毒檢測技術(shù)研究工作提供參考。

關(guān)鍵詞：百合；病毒檢測；研究進展

百合(Liliumspp.)為百合科百合屬多年生球根花卉，由于其花姿雅致、寓意美好，深受廣大消費者喜愛，是國際上重要的切花觀賞花卉。但就我國目前的百合生產(chǎn)現(xiàn)狀來看，整個產(chǎn)業(yè)缺乏特有品種，自主化程度較低，百合生產(chǎn)主要依靠國外進口種源。在不斷的引種和擴繁過程中，由于有些種源質(zhì)量不高，種球自繁不規(guī)范，使得百合體內(nèi)的病毒不斷積累。這些病毒主要對百合的鱗莖、葉片、花等構(gòu)成危害，致使染病百合的莖稈、葉片或花出現(xiàn)畸形或斑駁，病情嚴重時導致植株矮小、退化甚至死亡，影響百合的正常生長，嚴重影響了我國百合的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。由于百合病毒病具有較強的傳播性，目前我國百合病毒病的發(fā)病率一般在40%-50%，二代種球的帶病率更是達到90%以上，給我國的百合產(chǎn)業(yè)帶來了巨大損失[2]。因此，為了及早發(fā)現(xiàn)染病植株，防止病毒的進一步傳播和擴散，許多學者對百合病毒的檢測技術(shù)進行了研究篩選，希望能找到一種便捷、快速、準確的病毒檢測技術(shù)。

目前我們國內(nèi)較為常用的病毒檢測方法主要有四種，分別是指示植物法、電鏡檢測法、血清學方法和分子生物學技術(shù)。

1指示植物法

指示植物法是最早應(yīng)用于植物病毒檢測的方法之一。這種方法主要是利用受病毒侵染能產(chǎn)生明顯癥狀的寄主植物進行病毒檢測。染病植物的葉片經(jīng)研磨后得到粗汁液，然后蘸取汁液摩擦指示植物的葉片，經(jīng)清水清洗后，置于室溫條件下觀察是否有病癥顯示。根據(jù)檢測病毒的不同，常用于百合病毒檢測的指示植物有臺灣百合、麝香百合、番茄、菜豆、郁金香等[3]。

當侵染植物的病毒具有可見的癥狀時，運用指示植物法可以直觀地檢測到待檢植株中是否存在這種病毒，操作比較簡單，但也存在很多不足。首先，檢測周期很長，等指示植物表現(xiàn)出癥狀最短需時10-20d，長的則需要1-3個月；其次，靈敏度比較低；第三，受時間限制，由于植物生長會受到季節(jié)變化的影響，因此季節(jié)也是制約這種方法應(yīng)用的因素之一。而有些病毒如煙草環(huán)斑病毒(TRSV)、蠶豆萎蔫病毒(BBWV)和水仙花葉病毒(NMV)，侵染植物后并不表現(xiàn)癥狀，或者癥狀不明顯，這種情況下不適合用指示植物法進行檢測[4]。而且，指示植物園的建設(shè)、維護費用很高，也不利于指示植物法的推廣應(yīng)用。

2電鏡檢測法

電鏡檢測法也稱電子顯微技術(shù)，它主要包括四種方法，分別是超薄切片法、負染色法、免疫電鏡法和膠體金法等。負染色法具有直接、簡便、迅速的優(yōu)點，因此被廣泛地運用到百合病毒的檢測和鑒定研究中。超薄切片法可以確定病毒在細胞中的存在狀態(tài)，洪健等[5]在研究中運用超薄切片法判斷百合中是否存在百合斑駁病毒(LMoV)，在他們的診斷中，將百合葉片細胞中有無風輪狀、束狀內(nèi)含物作為重要依據(jù)。隨著免疫技術(shù)的發(fā)展，免疫電鏡技術(shù)(ISEM)誕生了，它是將電鏡技術(shù)與免疫技術(shù)相融合從而產(chǎn)生的新技術(shù)。ISEM技術(shù)的優(yōu)點在于，它不僅使檢測的敏感性得到了很大的提高，而且可以準確地判定出病毒的種類。另外一種較為常用的電鏡檢測技術(shù)是膠體金法，它是以病毒樣品與相應(yīng)免疫球蛋白的特異反應(yīng)為原理。楊佐琦等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，利用蛋白A-膠體金法對百合無癥病毒(LSV)進行檢測，只需在低倍率的電鏡下就可以觀測到病毒的存在，檢測效果遠遠優(yōu)于免疫電鏡法。

電鏡檢測法簡便快捷，并且可以用于大量樣品的檢測。但是電鏡技術(shù)往往需要較高的設(shè)備購置費用和樣品制備費用，這些都使電鏡檢測技術(shù)的推廣應(yīng)用受到了一定的限制。

3血清學方法

血清學方法是目前國內(nèi)外最為常用的一種百合病毒檢測方法，具有特異性強，靈敏度高，結(jié)果易觀察等優(yōu)點。目前用于百合病毒檢測的血清學方法主要有：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、A蛋白夾心—酶聯(lián)免疫吸附法(PAS-ELISA)、雙抗體夾心—酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)、點免疫結(jié)合法(DIBA)、組織印跡法(TBIA)、伏安酶聯(lián)免疫分析法等。

將酶的高效催化特性與抗原抗體的免疫反應(yīng)相結(jié)合，就得到了酶聯(lián)免疫吸附法。運用一定的化學方法，將抗體與酶相結(jié)合成酶標抗體[7]。酶標抗體可直接或間接與待測抗原或抗體特異性結(jié)合，從而檢測病毒的存在。后人在ELISA方法的基礎(chǔ)上又研究出了新的檢測方法。Hawkes等[8]將酶標板替換為硝酸纖維素膜，建立了一種新的方法—DIBA法，使檢測更為快速、簡便、經(jīng)濟。

Niimi[9]在田間取樣，利用ELISA和DIBA兩種方法對所取樣品進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，52.4%的被檢樣品中存在LSV，0.9%的樣品中存在黃瓜花葉病毒(CMV)；2003年徐品三等[10]用ELISA方法對兩個百合品種“卡薩布蘭卡”和“魅力”的脫毒種球進行病毒檢測，分別對CMV，LMoV和LSV三種病毒進行了檢測。但是這兩種方法的檢測靈敏度都比較低，無法檢測納克(ng)水平以下的病毒。

PAS-ELISA是將病毒抗血清用葡萄球菌A蛋白進行包被，然后與抗原識別；DAS-ELISA是用另外一種病毒的抗體與抗原進行識別。DIBA將酶標板替換為硝酸纖維素膜，使病毒檢測更為便捷、經(jīng)濟，便于在百合病毒大規(guī)模檢測方面進行應(yīng)用。組織印跡法(TBIA)是把感病組織做切塊處理后直接固定在硝酸纖維膜上，再利用抗原與抗體反應(yīng)的特異性對植物病毒進行檢測，它是在點免疫結(jié)合法基礎(chǔ)上進行改進得到的一種方法。在對LSV進行檢測的試驗中，組織印跡法的靈敏度比酶聯(lián)免疫吸附法高30倍，組織印跡法與點免疫結(jié)合法相比，操作比較簡單，且靈敏度較高，更適合在大量樣品的檢測中應(yīng)用。Meissner[11]運用伏安酶聯(lián)免疫分析法對煙草環(huán)斑病毒(TRSV)和煙草花葉病毒(TMV)進行檢測，試驗中用到的酶是聯(lián)苯胺—H2O2—辣根過氧化物酶(HRP)，根據(jù)IgG—HRP與植物病毒及其抗血清的免疫反應(yīng)，可以間接測定植物病毒。這種方法的靈敏度高于ELISA顯色光度法，線性范圍也比ELISA顯色光度法要寬，且免疫特異性更強，是血清學檢測法的一大進步。

血清學方法所用設(shè)備的購置費用較低、操作方法也較簡單、結(jié)果準確，較前幾種方法有很大的進步，但它也存在一定的問題。首先，并不是所有的植物病毒都具有外殼蛋白，有些病毒在特殊情況下外殼蛋白是缺失的；其次，類病毒是沒有外殼蛋白的；第三，病毒并不是均勻地分布在被感染植株上的；最后，陽性樣品與陰性樣品的區(qū)分常會受到季節(jié)性變化的影響。這些都制約著這種方法在植物病毒檢測中的應(yīng)用。

4分子生物學技術(shù)

分子生物學技術(shù)將病毒檢測靈敏度提高到了皮克級，相比血清學的納克水平有了很大提高，用特異引物的PCR測定方法則更加靈敏。這種方法特異性強、適應(yīng)范圍廣、檢測速度快，應(yīng)用對象可以是DNA病毒、RNA病毒和類病毒，并可用于大量樣品的檢測。目前常用的分子生物學技術(shù)包括雙鏈RNA(dsRNA)電泳技術(shù)、核酸斑點雜交技術(shù)(NASH)以及反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)。

雙鏈RNA技術(shù)檢測植物病毒的原理是分析植物組織中的雙鏈RNA(dsRNA)。植物病毒的基因組約有90%為單鏈RNA(ssRNA)，當病毒侵入到植物體內(nèi)后，會以ssRNA為模板合成出dsRNA，因此可以通過對植物組織中dsRNA的分析判斷它是否被病毒侵染，并對侵染它的病毒進行診斷研究。

NASH技術(shù)是利用核苷酸探針對病毒進行檢測的一種方法。利用互補核苷酸單鏈能夠相互結(jié)合的原理，將病毒的一段核酸單鏈標記成探針對相應(yīng)病原進行檢測?，F(xiàn)在這種檢測技術(shù)已經(jīng)成為植物病毒檢測最常用的方法之一。

RT-PCR技術(shù)的檢測靈敏性和特異性均優(yōu)于免疫學方法，具有簡便快速、特異靈敏等特點。云南農(nóng)業(yè)大學應(yīng)用DAS-ELISA，RT-PCR和IC-RT-PCR技術(shù)分別對LSV進行檢測，結(jié)果表明：RT-PCR和IC-RT-PCR分別可從2ng和200ng的百合葉片組織中檢測出LSV，其檢測敏感度分別是DAS-ELISA的1000倍和10倍[12]。證實了RT-PCR技術(shù)的高度靈敏性。

RT-PCR技術(shù)在百合病毒檢測方面的研究最早在國外展開。1991年Langeveld運用PCR技術(shù)成功完成了LMoV的檢測。1996年Joung[13]利用RT-PCR技術(shù)檢測到了百合中的LSV。Lee[14]利用RT-PCR技術(shù)對東方百合的CMV、LSV、LMoV三種病毒的發(fā)生情況進行了檢測。2003年Niimi等[9]在檢測侵染百合的LSV時，對ELISA和RT-PCR兩種方法的檢測靈敏度進行了比較，發(fā)現(xiàn)RT-PCR的檢出率明顯高于ELISA，在他們的試驗中，成功利用RT-PCR方法檢測了3個百合品種的CMV、LMoV和LSV病毒。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，后續(xù)的研究人員在傳統(tǒng)RT-PCR的基礎(chǔ)上經(jīng)過改進，發(fā)展出了多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)技術(shù)。多重RT-PCR又被稱為復(fù)合RT-PCR，曾有研究人員利用這種方法對6種植物病毒進行了同時檢測，大大提高了病毒復(fù)合侵染情況下的診斷效率，并且也使試驗成本得到了顯著降低，在實際檢測中具有很高的應(yīng)用價值[15]。王繼華等[1]應(yīng)用多重RT-PCR技術(shù)對LSV和LMoV進行了檢測，靈敏性測定結(jié)果表明，該雙重PCR可從稀釋104組織中檢測出病毒，具有與單一PCR相同的靈敏性。黎昊雁等[16]利用多重RT-PCR方法對LSV、LMoV及百合x病毒進行了同步檢測。徐榕雪等[17]建立了同時檢測CMV、LMoV 和LSV的多重RT-PCR檢測方法，擴增產(chǎn)物測序表明，這三種病毒的地域差異不明顯，外殼蛋白序列高度保守。鄭麗娜等[18]應(yīng)用多重RT-PCR方法對5個百合品種的CMV、LMoV 和LSV病毒進行了同步檢測，并指出應(yīng)用多重RT-PCR每個樣品的直接檢測費用是單一RT-PCR的30%。陳進等[19]利用多重RT-PCR方法對新鐵炮百合雜種系品種“雷山一號”(Liliumformolongi‘Raizan1’)的CMV、LSV 和LMoV三種病毒進行了同步檢測，在引物設(shè)計、擴增條件篩選等方面進行了優(yōu)化，提高了檢測的準確性和效率。但上述研究都是根據(jù)PCR產(chǎn)物中病毒特異性條帶的有無來判斷植株是否帶毒，這就導致了當反應(yīng)體系中有抑制物時，或由于操作不當以及試劑失效等的情況下，有可能出現(xiàn)假陰性的情況，從而影響病毒的正常檢出。

運用RT-PCR技術(shù)檢測百合病毒的靈敏度較高，能夠檢測到飛克(fg) 數(shù)量級的植物病毒，并且這種方法沒有放射性危險，比較安全可靠，還可以應(yīng)用到大規(guī)模的病毒檢測當中。因此，分子生物學技術(shù)，尤其是RT-PCR技術(shù)在百合病毒檢測中的應(yīng)用具有很高的研究價值和推廣應(yīng)用價值。

參考文獻：

[1] 王繼華.應(yīng)用多重RT-PCR檢測百合無癥病毒和百合斑駁病毒[J].園藝學報,2005,32(2):284-287.

[2] 沈淑琳. 百合病毒病及其檢驗[J]. 植物檢疫, 1996,10(4):223- 226.

[3] 王麗花,王繼華,瞿素萍,楊秀梅,吳學尉.百合病毒脫毒及檢測技術(shù)研究進展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2007,38(6):673-677.

[4] 白松,丁元明.百合病毒病及其檢測防治方法[J]. 植物醫(yī)生, 1996, 9(1):4-7.

[5] 洪健,陳集雙,周雪平,李德葆. 植物病毒的電鏡診斷(續(xù)篇)——新增植物病毒科和屬及其形態(tài)學和細胞病理學特征[J]. 電子顯微學報,2001,20(6):772-779.

[6] 楊佐琦,林俊義.百合潛無性病毒病害之鑒定及診斷[J].植物保護學會會刊,1993,35(2):95-103.

[7] Clark M F,Adams A N.Characteristics of the Microplate Method of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Plant Viruses[J].Journal of general Virology,1977,34:475-483.

[8] Hawkes R, Niday E, Gordon J.A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies[J]. Analytical Biochemistry,1982,119(1):142-147.

[9] Niimi Y, Dong SH, Shiro M. Detection of cucumber mosaic virus ,lily symptomless virus and lily mottle virus in Lilium species by RT-PCR technique[J]. Scientia Horticulture,2003,97(1):57-63.

[10] 徐品三,欒雨時,劉紀.百合不定芽培養(yǎng)脫毒種球生產(chǎn)的研究[J].植物學通報,2003,20(3):301-318.

[11] Meissner PE, Resende RD,Lima MI,et al. Patchouli virus X, a new potexvirus from Pogostemon clabin[J]. Annals of applied biology, 2005,141(3):267-274.

[12] 王繼華, 瞿素萍, 孔寶華, 等. 百合無癥病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR檢測[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報,2004,19(2):148-150.

[13] Joung YH, Jeon JH, Choi KH, et al. Detection of lily symptomless virus using RT-PCR technique[J]. Korean Journal of Plant Pathology ( Korea Republic),1996,12(2):187-190.

[14] Lee JS ,Nou HS ,Hong DK,et al. Detection of viral diseases in Lilium-oriental plants using RT-PCR technique[J].RDA Journal of Crop Protection,1998,40(1):50-56.

[15] Bertolini,E, Olmos,A, Martinez,MC, et al. Single-step multiplex RT-PCR for simultaneous and colourimetric detection of six RNA viruses in olive trees[J]. Journal of Virological Methods, 2001, 96(1):33-41.

[16] 黎昊雁，吳姍，張曉峰，等.復(fù)合RT-PCR方法同步檢測百合X病毒、百合無癥病毒及百合斑駁病毒[J].植物保護，2006，32(6):42-45.

[17] 徐榕雪,明軍,穆鼎,等.百合三種病毒的多重RT-PCR檢測[J].園藝學報，2007,34(2):443-448.

[18] 鄭麗娜.百合種球病毒檢測與脫除技術(shù)研究[D]. 北京:北京林業(yè)大學，2009.

[19] 陳進,李曉昕,袁雪,等.百合三種主要病毒的RT-PCR檢測及脫毒技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2013, 21(4): 489-497.

(責任編輯：劉小林)

doi：10.3969/j.issn.1009-2080.2016.03.027

收稿日期：2016-04-08

作者簡介：陳進(1988-)，女，山東青州人，濰坊工程職業(yè)學院應(yīng)用化學與生物工程學院教師。

中圖分類號：S685.99

文獻標志碼：A

文章編號：1009-2080(2016)03-0102-04