DMT1:多種二價金屬離子的轉(zhuǎn)運載體

唐家明，鄒亞學，王秋悅，呂 林，張麗陽，羅緒剛*，李素芬**

(1 河北科技師范學院，河北，秦皇島，066600；2 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所)

DMT1:多種二價金屬離子的轉(zhuǎn)運載體

唐家明1，鄒亞學1，王秋悅1，呂 林2，張麗陽2，羅緒剛2*，李素芬1**

(1 河北科技師范學院，河北，秦皇島，066600；2 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所)

從分子結(jié)構(gòu)與分布、生理功能及其對二價金屬離子吸收的調(diào)控機制等方面對二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進行了綜述。旨在通過對DMT1在微量元素吸收中的作用機制的研究，來提高動物微量元素的吸收效率和利用率。

DMT1；二價金屬離子；轉(zhuǎn)運蛋白

二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)又稱為自然抵抗相關巨噬蛋白2(natural resisitance associated macrophage protein 2,Nramp2),或二價陽離子轉(zhuǎn)運載體1(divalent cation transporter 1,DCT1), 屬于可溶性載體家族成員(solute carrier family 11 member 2, SLC11A2), 是哺乳動物體內(nèi)質(zhì)子偶聯(lián)的跨膜金屬離子轉(zhuǎn)運載體。1995 年，Gruenheid等[1]在篩選小鼠天然抗性的巨噬細胞蛋白1(Nramp1)時，首次發(fā)現(xiàn)了與Nramp1 同源的Nramp2。1997年，F(xiàn)leming[2]和Gunshin[3]兩位科學家?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)DMT1是哺乳動物第一個跨膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白。當它被首次發(fā)現(xiàn)時,由于與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Nramp1基因同源性高達78%,因此被命名為Nramp2。從DMT1發(fā)現(xiàn)以來, 關于它的結(jié)構(gòu)、功能、表達等方面已經(jīng)獲得很多重要發(fā)現(xiàn),對于DMT1的研究已經(jīng)成為鐵元素乃至整個微量元素研究領域的一個熱點問題。

1 DMT1的分子結(jié)構(gòu)和分布

1.1 DMT1的分子結(jié)構(gòu)

Gruenheid等[1]在研究具有天然抗性的巨噬細胞蛋白1(nature resistance-associated macrophage protein 1,Nramp1)的過程中發(fā)現(xiàn)另一種與Nrampl有極高同源性(達78%)和相似的二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(DMT1)。1997年哈佛大學和耶魯大學的兩個研究小組分別鑒別分離出功能基因DMT1，這是迄今為止所克隆的第一個哺乳動物跨膜鐵轉(zhuǎn)運載體[2,4]。生物信息學可知DMT1的結(jié)構(gòu)和Nramp1相似,DMT1分子量為61 456,等電點為6.02,含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域, 在第7和8跨膜結(jié)構(gòu)域之間的天門冬氨酸殘基是一個糖基化位點,其糖基化的細胞外袢狀結(jié)構(gòu)和高度保守的細胞內(nèi)序列都具有高度的疏水性。Moos等[5]研究發(fā)現(xiàn)，第4跨膜結(jié)構(gòu)域是一個重要的功能區(qū),若此域發(fā)生突變將會嚴重影響DMTl功能的正常發(fā)揮。Kishi等[6]研究得出，人的DMT1基因組DNA含有43 999個堿基,包括16個外顯子，其cDNA有4 142個堿基, 所編碼蛋白含561個氨基酸,其羧基端和氨基端均位于細胞胞質(zhì)內(nèi)。DMT1與同家族Nramp1的基因同源性高達78%,氨基酸相似性達到64%, 二者的主要區(qū)別在于氨基端的不同。DMT1有高度的疏水性,它的氨基端和羧基端都嵌入胞漿內(nèi)。Andrews[7]等研究發(fā)現(xiàn)，DMT1的mRNA存在“+IRE”和“-IRE”型2種形式。“+IRE”型的3’非翻譯區(qū)含有1個與運鐵蛋白受體(TfR)mRNA的3’非翻譯區(qū)相似的鐵調(diào)節(jié)元件(iron regulatory element,IRE),“-IRE”型則沒有此元件。“+IRE”和“-IRE”分別編碼561個和568個氨基酸，其中N-端543個氨基酸相同，只有C-端18或25個氨基酸不同。DMT1 mRNA的5’調(diào)控區(qū)無TATA盒子，但包含2個CCAAT盒子，3個SP1的結(jié)合位點，5個金屬反應元件(metal response element,MRE),2個Hif結(jié)合位點和1個γ-干擾素調(diào)節(jié)元件[8]。

1.2 DMT1的體內(nèi)分布

DMT1在哺乳動物各組織中廣泛表達，尤其在十二指腸和腎的表達最高，在胸腺和腦有中等程度的表達，而在睪丸、肝、結(jié)腸、心臟、脾、骨骼肌、肺、骨髓的含量相對較低[3，9]。DMT1在小腸上皮細胞中的表達主要定位在腸細胞絨毛膜刷狀緣上，但Trinder等[10]通過共聚焦免疫熒光顯微鏡觀察小腸絨毛細胞發(fā)現(xiàn)，不僅在細胞膜上有DMT1定位，在絨毛頂端胞漿中也可觀察到DMT1表達，提示DMT1可能在這些位點之間循環(huán)轉(zhuǎn)運。DMT1在腎臟中主要存在于腎臟皮質(zhì)，且從近端小管和集合管發(fā)散出，存在位置既不是頂膜，也不是基底外側(cè)膜，而是晚期胞內(nèi)體和溶酶體內(nèi)[11]。

2 DMT1的生理功能

2.1 DMT1介導小腸鐵吸收和轉(zhuǎn)運

鐵在小腸的吸收包括兩個轉(zhuǎn)運過程，即粘膜吸收過程(鐵吸收進入腸上皮細胞)和粘膜轉(zhuǎn)運過程(鐵從腸上皮細胞的基底側(cè)轉(zhuǎn)運到血液循環(huán))，其中粘膜吸收過程是機體維持鐵平衡的最關鍵一步。Fleming等[2]研究發(fā)現(xiàn)，腸腔內(nèi)鐵主要是以二價形式經(jīng)小腸上皮頂膜上的DMT1介導由腸腔進入上皮細胞內(nèi)，然后再經(jīng)基底膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(Ferroprtin1,FPN1)介導由腸細胞進入血液循環(huán)。Gunshin等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DMT1介導的二價鐵離子的轉(zhuǎn)運是H﹢依賴的主動轉(zhuǎn)運過程。在患有嚴重缺鐵性貧血小鼠和Begeade大鼠都存在相同的DMT1基因G185R位點突變，表明DMT1表達障礙嚴重影響小腸鐵吸收，導致鐵缺乏性小細胞、低色素性貧血[2,12,13]。

運鐵蛋白(Transferrin，Tf)和運鐵蛋白受體(Transferrin receptor,TfR)途徑是細胞攝取鐵的主要生理途徑[14]。在這一過程中，內(nèi)吞小體酸化使三價鐵從Tf上釋放并變?yōu)槎r鐵。然后，二價鐵穿過內(nèi)吞小體膜進入胞漿。Fleming等[15]發(fā)現(xiàn)，正是內(nèi)吞小體膜上的DMT1負責將二價鐵轉(zhuǎn)移入胞漿。Begrade大鼠能夠正常地通過Tf和TfR將鐵吸收，并在細胞內(nèi)形成內(nèi)吞小體，但隨后內(nèi)吞小體內(nèi)的鐵卻無法轉(zhuǎn)運入胞漿。最終內(nèi)吞小體的鐵又全部返回到細胞表面，釋放回血液中[15]。研究也已證實，DMT1與TfR在內(nèi)吞小體上共同存在[13]。DMT1在鐵“移位”中的重要作用，證明Tf-TfR不依賴的鐵轉(zhuǎn)運機制是細胞生理鐵攝取所必需的。正是Tf-TfR依賴的和Tf-TfR不依賴的鐵轉(zhuǎn)運機制共同作用，才能最終完成細胞生理鐵攝取的全過程。

2.2 DMT1介導其他金屬離子轉(zhuǎn)運

DMT1能夠轉(zhuǎn)運的金屬離子達8種之多，除了Fe2+以外，還可以轉(zhuǎn)運Mn2+，Cu2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+。研究表明，DMT1與轉(zhuǎn)運金屬的親和力由大到小的順序為Mn2+，Cd2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，CO2+，Ni2+，Zn2+。DMT1是動物腸道中發(fā)現(xiàn)的唯一二價錳轉(zhuǎn)運載體[3，6]，在哺乳動物腸道錳的吸收過程中起重要作用[10]，從胃部排出的可溶性二價錳，通過腸微絨毛DMT1的轉(zhuǎn)運才能被機體吸收[10，12，24]。已經(jīng)證實，DMT1參與大鼠[10]、豬[16]和雞[17]腸上皮細胞對錳的攝取。DMT1突變Belgrade大鼠細胞攝取錳的能力也降低[10]。

DMT1是否參與銅的轉(zhuǎn)運還不清楚。用Coca-2細胞模型研究表明，在小腸細胞中DMT1的生理功能與Cu1+的轉(zhuǎn)運有關，且鐵和銅在小腸中的吸收存在拮抗關系[18]。Arredondo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，DMT1-IRE亞基可以轉(zhuǎn)運銅，但是以Cu+的形式被轉(zhuǎn)運。Espinoza等[20]采用shRNA技術使DMT1蛋白表達沉默后，Caco-2細胞攝取和轉(zhuǎn)運鐵、銅和鋅的量分別減少51%，25.8%和23.1%，說明DMT1不同程度地參與鐵、銅和鋅的轉(zhuǎn)運。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)，DMT1的-IRE亞基能夠轉(zhuǎn)運Ni2+。Garrick等[9]研究表明，DMT1轉(zhuǎn)運Cd2+可能與鎘的毒性有關。Desmond等[22]的研究表明，Cd2+和Mn2+能抑制鐵的運輸，Zn2+和Pb2+卻不能，這為DMT1在Caco-2細胞直接參與攝取鐵和鎘提供了證據(jù)，其結(jié)果解釋了鐵缺乏是鎘中毒的危險因素。pH依賴的Co2+運輸也已經(jīng)被證明，但是其生理學意義尚不清楚[23]。

3 DMT1的二價金屬離子吸收依賴調(diào)控機制

3.1 Fe對DMT1表達的影響

飼糧鐵對DMT1基因表達的調(diào)控具有組織和細胞特異性。Gunshin 等[24]報道，只有DMT1(+IRE)對鐵反應敏感，DMT1 mRNA在缺鐵大鼠十二指腸內(nèi)表達量提高50～100倍，而在其他器官如肝、腎、心和腦中表達量僅上調(diào)1.5～3倍。Dupic等[25]報道，斷奶大鼠飼喂無鐵飼糧或添加2%羧酸鐵的高鐵飼糧2周，無鐵飼糧組十二指腸中與鐵吸收轉(zhuǎn)運相關基因Dcytb，DMT1，F(xiàn)PN1和TfR1的mRNA水平均提高，而高鐵飼糧組上述基因mRNA水平則明顯降低。Hansen等[16]在21日齡斷奶仔豬脫脂奶粉-酪蛋白-玉米半純合飼糧中，以硫酸亞鐵形式添加100 mg/kg或500 mg/kg鐵飼喂32 d后，加鐵組十二指腸粘膜DMT1 mRNA水平隨鐵水平降低而降低，DMT1和FPN1蛋白水平也有降低的趨勢。Hansen等[26]在21日齡斷奶仔豬含鐵97 mg/kg玉米-豆粕-乳清粉飼糧中，以硫酸亞鐵形式添加700 mg/kg鐵，飼喂21，42或63 d后，盡管基因表達水平在不同日齡有變化，加鐵組十二指腸粘膜DMT1 mRNA水平僅為不加鐵組的10%。Tako等[27]在肉雞飼糧中以硫酸亞鐵形式添加100 mg/kg鐵，十二指腸中DMT1 mRNA水平降低。但Hansen等[28]在8周齡斷奶犢牛飼糧中以硫酸亞鐵形式添加750 mg/kg鐵飼喂56 d后，發(fā)現(xiàn)高鐵組十二指腸粘膜DMT1 mRNA和蛋白都表現(xiàn)出降低趨勢。

Gambling等[29]報道，飼喂含鐵7.5 mg/kg飼糧21 d的妊娠大鼠比飼喂含鐵50 mg/kg妊娠大鼠胎盤中DMT1(+IRE)mRNA和蛋白水平均增加1.5～2倍左右；體外培養(yǎng)胎盤細胞模型BeWo細胞也表現(xiàn)出類似情況。Canonne-Hergaux和Gros[30]報道，飼喂低鐵飼糧大鼠比飼喂添加3%磷酸亞鐵飼糧大鼠腎中DMT1蛋白表達量增加約2倍。Nam等[31]用斷奶大鼠飼喂鐵缺乏(含鐵10 mg/kg)、適宜(含鐵50 mg/kg)或過量(含鐵18 916 mg/kg)飼糧3周，鐵缺乏組DMT1蛋白表達量比適宜鐵組高約3倍，而過量鐵組肝中DMT1蛋白表達量比適宜鐵組低70%，DMT1 mRNA水平也表現(xiàn)出相同的變化趨勢；鐵過量對胰腺DMT1蛋白水平無顯著影響，但DMT1(-IRE)型表達量降低；缺鐵組大鼠心臟DMT1蛋白表達量比鐵適宜組高4倍，但DMT1 mRNA水平未發(fā)生變化，說明調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后。Ke等[32]也發(fā)現(xiàn)飼糧鐵對大鼠心臟DMT1蛋白表達的影響為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

鐵對DMT1表達的調(diào)控在腦內(nèi)還存在區(qū)域特異性。Ke等[33]報道成年大鼠飼喂高鐵飼糧6周，雖然腦內(nèi)總鐵含量發(fā)生改變，但大腦皮層、海馬、紋狀體和黑質(zhì)中DMT1 的表達均無明顯變化。于鵬等[34]發(fā)現(xiàn)，大鼠側(cè)腦室注射右旋糖酐鐵500 μg / (只·d) 7 d后，腦內(nèi)達高鐵狀態(tài)時大腦皮層DMT1(+IRE)蛋白表達顯著升高，而DMT1(-IRE)蛋白表達無顯著變化；尾殼核和黑質(zhì)中DMT1(-IRE)蛋白的表達顯著降低，而DMT1(+IRE)蛋白表達并未出現(xiàn)顯著變化，這與大腦皮層中發(fā)生變化的DMT1亞型恰恰相反。Siddappa等[35]也發(fā)現(xiàn)，妊娠期及出生后10 d飼喂缺鐵飼糧大鼠海馬和大腦皮層中DMT1的表達增加，但對其他腦區(qū)DMT1的表達沒有影響。這可能由于不同腦區(qū)對鐵的敏感性不同，影響和調(diào)控DMT1蛋白變化的趨勢和分子機制也不盡相同。

在體外培養(yǎng)細胞的來源及分化程度也可能影響DMT1 mRNA的表達。鐵缺乏時，Caco-2中DMT1 mRNA表達量提高10倍，而Hep3B中DMT1 mRNA表達量上調(diào)較少，Hep2G，Hela和LMTK成纖維細胞中DMT1 mRNA的表達卻無影響[24]。

飼糧鐵對DMT1 表達的調(diào)控可能與DMT1 mRNA穩(wěn)定性增加有關。DMT1 mRNA 3’非翻譯區(qū)的IRE可以像TfR一樣受鐵調(diào)控蛋白(iron regulatory protein，IRP)的調(diào)控。當機體鐵缺乏時，IRP緊密地與DMT1 mRNA 3’非翻譯區(qū)IRE結(jié)合，DMT1 mRNA穩(wěn)定性增加，DMT1 mRNA水平增加[36,37,24]，蛋白表達量也增加[37]，高鐵狀態(tài)時正好相反。不同組織中“+IRE”與“-IRE”型所占的比例不同，腦和腸道中“+IRE”型比例高，而脾、胸腺和胰臟中“-IRE”型比例高。“-IRE”型mRNA的穩(wěn)定性是否也受鐵調(diào)控還不清楚，但有證據(jù)表明，缺鐵動物的小腸[38]、腦[3]等組織發(fā)現(xiàn)DMT1 mRNA和蛋白表達量增加。這些都支持“+IRE”型的DMT1表達可能是受IRP/IRE介導的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的觀點。最近的研究發(fā)現(xiàn)，鐵對DMT1表達的調(diào)控可能通過5’端啟動子及外顯子1A和含有IRE的3’外顯子兩個區(qū)域進行，正是這兩個區(qū)域的特異性決定了鐵對DMT1基因表達調(diào)控的組織特異性[19,39]。除了IRP/IRE外，鐵可以誘導Nedd4家族反應蛋白1(Ndfip1)表達，使DMT1泛素化和降解[40]。飼糧鐵對十二指腸中DMT1表達的調(diào)控通過Nedd4家族反應蛋白1(Ndfip1)，而在肝臟中是通過Ndfip2 實現(xiàn)的[41]。

3.3 Mn對DMT1的表達影響

由于Mn過量能選擇性蓄積在腦內(nèi)，作用于錐體外系，從而引起類帕金森癥狀。因此，關于Mn對大鼠組織中DMT1表達的影響多集中在腦部。Garcia等[42]對新生大鼠飼喂高錳(100 mg/kg)飼糧21 d后，大鼠腦中各部位包括大腦皮質(zhì)、海馬、中腦、紋狀體、小腦DMT1蛋白表達量均比對照組(飼糧含錳10 mg/kg)上升了約35%，并無區(qū)域特異性。Wang等[43]在脈絡膜上皮細胞培養(yǎng)基中加入錳100 μmol/L或200 μmol/L，也上調(diào)了DMT1 mRNA和蛋白表達。

錳對其他動物組織中DMT1表達的影響不盡一致。Bai等[44]報道，在55周齡臨界缺錳蛋雞飼糧中添加300 mg/kg錳，飼喂12周后，加錳組十二指腸、心臟和肝臟中DMT1 mRNA水平明顯降低。Bai等[17]用肉雞結(jié)扎十二指腸段灌注120 mg/L錳，發(fā)現(xiàn)腸粘膜中DMT1 mRNA水平降低；但在肉雞飼糧中添加100 mg/kg無機硫酸錳或有機錳，飼喂21 d后，加錳組十二指腸粘膜中DMT1 mRNA水平升高，且添加中等和強絡合強度有機錳組十二指腸粘膜中DMT1 mRNA水平顯著高于無機硫酸錳。Li等[45]報道，體外培養(yǎng)Caco-2細胞培養(yǎng)液中加入錳800 μmol/L，DMT1 mRNA表達水平降低。但造成這種差異的原因，可能與錳添加水平不同有關。

3.4 其他金屬離子對DMT1表達的影響

哺乳動物后期幼鼠膳食高鋅時睪丸DMT1 mRNA水平顯著降低，表達量約為缺鋅或適鋅組的1/3～1/4[46]。Yamaji等[47]發(fā)現(xiàn)，鋅上調(diào)Caco-2中DMT1蛋白和mRNA表達量。Caco-2細胞暴露于含鋅50，100，200 mol/L環(huán)境24 h后，細胞中DMT1 mRNA表達量分別比對照組上調(diào)了32%，79%，134%[48]。上述結(jié)果提示，補鋅后小腸細胞對鐵的攝取增加。

Caco-2對銅的攝取與細胞內(nèi)鐵含量成負相關，去鐵銨處理細胞對銅的攝取量增加，而高銅處理則降低DMT1 mRNA及蛋白表達量[49]。但在肉牛的小腸研究中添加和不添加銅對小腸中DMT1兩種亞型mRNA表達量沒有明顯影響，對DMT1蛋白表達量也沒有明顯影響[50]，提示銅是被DMT1轉(zhuǎn)運的，但轉(zhuǎn)運方式為Cu1+，并且轉(zhuǎn)運量很小。

鉛與體內(nèi)某些二價金屬離子相似，可以取代蛋白內(nèi)金屬的位置而發(fā)揮作用。新生大鼠鉛暴露3周海馬和皮層的DMT1表達量隨鉛濃度增加而增多，而生后70周大鼠隨鉛濃度增加而減少[51]。生長大鼠同時灌服鉛鎘6周后，海馬、小腦和皮層組織中DMT1蛋白表達增多且具有協(xié)同效應[52,53]。

3.5 非金屬離子對DMT1表達的影響

徐君等[54]發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白與β-伴球蛋白對小鼠腸上皮細胞DMT1基因的表達有抑制作用。由于抗原蛋白引起上皮細胞過敏反應，炎性細胞因子的增加，細胞內(nèi)代謝發(fā)生紊亂，DMT1的基因轉(zhuǎn)錄所需要的物質(zhì)比正常情況下降低，也在一定程度上影響了DMT1的基因表達,從而影響了二價金屬離子的吸收。Ludwiczek等[55]研究證明，炎癥因子和脂多糖(LPS)影響巨噬細胞DMT1表達。DMT1基因表達的調(diào)控因素還有很多，炎癥介質(zhì)，TNF-α，INF-γ，蛋白激酶C和發(fā)育階段等因素均參與調(diào)控[56]。

4 今后的研究方向

現(xiàn)在的研究水平多見與在mRNA水平的研究，而機體直接起作用是在蛋白水平，DMT1蛋白水平研究是大勢所趨。

目前對DMT1的研究，大多是體外實驗，體外模擬體內(nèi)環(huán)境實驗與體內(nèi)真實環(huán)境有很大差距。因此，應加強體內(nèi)試驗研究。

應進一步深入研究DMT1在多種金屬元素轉(zhuǎn)運過程中的作用機制及其信號傳導途徑。

DMT1在小腸中是否也參與有機金屬元素的轉(zhuǎn)運。

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(責任編輯：朱寶昌)

DMT1：A Transporter for Multiple Metals

(1 College of Animal Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600; 2 Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences；China)

The molecular structure, distribution, physiological function, and molecular mechanism of divalent metal transporter 1(DMT1) in divalent metals transport were mainly summarized in this paper, aimed at improving the absorption and utilization of trace elements in animals.

DMT1; divalent metal ion; transporter

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.04.013

國家自然科學基金資助項目(項目編號：31272465)。

2016-04-27; 修改稿收到日期: 2016-06-30

R151.2

A

1672-7983(2016)04-0078-07

唐家明(1988-)，男，碩士研究生。主要研究方向：動物營養(yǎng)生理。

*通訊作者，男，研究員，博士研究生導師。主要研究方向：家禽礦物元素營養(yǎng)與分子生物學。E-mail：wlysz@263.net。

**通訊作者，女，教授，碩士研究生導師。主要研究方向：動物營養(yǎng)生理。E-mail：lisufen88@aliyun.com。