二肽酰肽酶-4抑制劑通過PKA/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)的實驗研究*

黃玉芳　鄧文　朱濤

(遂寧市中心醫(yī)院，1.呼吸中心;2.骨科中心, 四川 遂寧 629000;3.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室/呼吸內(nèi)科， 四川 成都 610041)

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二肽酰肽酶-4抑制劑通過PKA/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)的實驗研究*

黃玉芳1鄧文2朱濤3

(遂寧市中心醫(yī)院，1.呼吸中心;2.骨科中心, 四川 遂寧 629000;3.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室/呼吸內(nèi)科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討二肽酰肽酶-4(DPP-4)競爭性抑制劑沙格列汀對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞(RAW264.7細胞)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)的分子機制。方法將RAW264.7細胞分為4組，分別為對照組(Control組)、LPS組、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS+沙格列汀+PKA抑制劑H-89組(LPS+SAX+H-89組)。在干預(yù)6小時后使用qPCR法和western blot法對細胞ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平進行檢測；并采用western blot法對細胞PKA和NF-κB p65活化水平進行分析。結(jié)果與Control組相比較，在LPS干預(yù)6小時后 RAW264.7細胞ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平及NF-κB p65活化水平均明顯上升，而PKA活化水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；但LPS組較LPS+SAX組ICAM-1表達和NF-κB p65活化水平的增加更明顯，而PKA活化下降更加明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下沙格列汀對于ICAM-1表達和NF-κB p65活化水平的抑制作用和PKA活化水平的促進作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論本研究顯示DPP-4抑制劑可以通過調(diào)控PKA/NF-κB信號通路下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的炎癥反應(yīng)，為DPP-4抑制劑應(yīng)用于炎癥性疾病的治療奠定了初步的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】沙格列?。?RAW264.7細胞； 細胞內(nèi)細胞黏附分-1 (ICAM-1)； 蛋白激酶A (PKA)； 核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)

DPP-4 inhibitor modulates LPS-induced inflammation via PKA/NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cellsHUANG Yufang1, DENG Wen2, ZHU Tao3

(1.DepartmentofRespiratory,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan,China;

2.DepartmentofOrthopedics,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan,China;

3.DivisionofPulmonaryDiseases,StateKeyLaboratoryofBiotherapyofChina,Departmentof

RespiratoryMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the anti-inflammatory property of DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4) inhibitor saxagliptin in LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and its underlying mechanism. MethodsRAW264.7 cells were separated into Control group, LPS group, LPS+saxagliptin group (LPS+SAX group) and LPS+saxagliptin+PKA inhibitor H-89 group (LPS+SAX+H-89 group). After 6 hours interventions, qPCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of ICAM-1. Then, the phosphorylation of PKA and NF-κB p65 were also measured by western blot. ResultsAfter 6 hours LPS stimulation, the mRNA and protein expression of ICAM-1 was significantly up-regulated, the phosphorylation of NF-κB p65 was markedly enhanced and the phosphorylation of PKA was largely reduced in RAW264.7 cells. Our data showed that LPS-induced expression of ICAM-1, LPS-enhanced phosphorylation of NF-κB p65 and LPS-reduced the phosphorylation of PKA were all substantially improved by saxagliptin. Meanwhile, we also found that these effects of saxagliptin were noticeably abrogated by PKA inhibitor H-89 in RAW264.7 cells. ConclusionsDPP-4 inhibitor saxagliptin could attenuate LPS-induced inflammation via modulation of PKA/NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cells.

【Key words】Saxagliptin; RAW264.7 cells; ICAM-1; PKA; NF-κB

巨噬細胞(macrophages)作為重要的固有免疫參與者，其過度激活在包括重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)、膿毒血癥休克(sepsis shock)和急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)等多種炎癥性疾病中扮演著重要的角色[1-5]。過度活化的巨噬細胞一方面有利于致炎因子和損傷因子的清除，另一方面其合成和分泌大量的炎癥介質(zhì)和炎癥分子又對炎癥部位的組織細胞產(chǎn)生直接和間接的損傷，最終導(dǎo)致器官的二次損害[6-8]。目前大量的研究發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)和二肽酰肽酶-4抑制劑(dipeptidyl peptidase-4 inhibitor)對炎癥反應(yīng)有重要的調(diào)節(jié)作用，且進一步的實驗表明DPP-4抑制劑的抗炎作用與調(diào)控PKA信號通路密切相關(guān)[9-11]。該基礎(chǔ)研究的目的是探討DPP-4競爭性抑制劑沙格列汀對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞(RAW264.7細胞)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，及其潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料TRIzol試劑和qPCR試劑盒均購買于日本Takara公司；兔抗鼠ICAM-1抗體、兔抗鼠磷酸化-PKA抗體、兔抗鼠PKA抗體、兔抗鼠磷酸化-NF-κB p65抗體、兔抗鼠NF-κB p65抗體和兔抗鼠β-actin抗體均購于美國Santa Cruz公司；沙格列汀購于上海施貴寶公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，超純水。其余試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100 g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代2次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。RAW264.7細胞分為對照組(Control組)、LPS組、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS+沙格列汀+PKA抑制劑H-89組(LPS+SAX+H-89組)。其中對照組細胞加入PBS；LPS組、LPS+SAX組和LPS+SAX+H-89組加入終濃度為1 μg/ml 的LPS溶液進行干預(yù)；LPS+SAX組加入終濃度為0.5 μM的沙格列汀進行干預(yù)；LPS+SAX+H-89組加入終濃度為1μM的PKA抑制劑H-89進行干預(yù)。

1.2.2細胞ICAM-1 mRNA表達檢測 qPCR法檢測MCP-1和HMGB1 mRNA表達水平，按照試劑盒說明書提取細胞的總RNA并合成cDNA。然后進行熒光定量PCR擴增，反應(yīng)體系為25 μl，使用β-actin作為內(nèi)參照。引物序列如下：ICAM-1正義5′-AGGTGT GATATCCG GTAGAT-3′，反義5′-CCTT CTAAGT GGTTGGAACA-3′；β-actin：正義：5′-CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT-3′，反義：5′-ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA-3′。使用2-ΔΔCt法對ICAM-1 mRNA表達水平進行測定，ΔΔCt = (Ct,目標-Ct, β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[3]。

1.2.3Western blot法檢測細胞中ICAM-1蛋白表達水平以及PKA活化水平和NF-κB p65活化水平干預(yù)6h后，按照試劑盒操作要求，首先提取RAW264.7細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入抗ICAM-1抗體(1∶1200)、抗磷酸化-PKA抗體(1∶1200)、抗PKA抗體(1∶1200)、抗磷酸化-NF-κB p65抗體(1∶1200)、抗NF-κB p65抗體(1∶1200)和抗β-actin抗體(1∶1500)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶ 1000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 11.0進行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ICAM-1 mRNA和蛋白的表達干預(yù)6h后，對RAW264.7細胞ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平使用qPCR法和western blot法進行檢測。與Control組相比較，在LPS干預(yù)后ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+SAX組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達增加更加明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時，在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下SAX對于ICAM-1 mRNA和蛋白的表達的抑制作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表1和圖1。

表1　RAW264.7細胞MCP-1 mRNA和蛋白表達水平及PKA與NF-κB p65活化水平

注：與對照組相比較①P<0.05；與LPS組相比較②P<0.05；與LPS+SAX組相比較③P<0.05。

圖1RAW264.7細胞ICAM-1蛋白表達的western blot結(jié)果

Figure 1The western blot results of ICAM-1 expression in RAW264.7 cells

2.2PKA的活化水平干預(yù)6h后，對RAW264.7細胞PKA的活化水平使用western blot法進行檢測。與Control組相比較，在LPS干預(yù)后PKA的活化水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+SAX組PKA的活化水平下降更加明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時，在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下SAX對于PKA的活化水平的促進作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),見表1和圖2。

圖2RAW264.7細胞PKA磷酸化水平的western blot結(jié)果

Figure 2The western blot results of the phosphorylation of PKA in RAW264.7 cells

2.3NF-κB p65的活化水平干預(yù)6h后，對RAW264.7細胞NF-κB p65的活化水平使用western blot法進行檢測。與Control組相比較，在LPS干預(yù)后NF-κB p65的活化水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+SAX組NF-κB p65的活化水平增加更加明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時，在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下SAX對于NF-κB p65的活化水平的抑制作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1和圖3。

3討論

直到目前急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的發(fā)病機制至今仍未完全闡明，治療仍以支持治療和對癥治療為主，無特異手段，病死率極高，據(jù)美國胸科協(xié)會(ATS)數(shù)據(jù)顯示ARDS的全因死亡率高達45%~65%，而部分的數(shù)據(jù)顯示我國ARDS的死亡率在60%~85%左右[12~15]。

圖3RAW264.7細胞NF-κB p65磷酸化水平的western blot結(jié)果

Figure 3The western blot results of the phosphorylation of NF-κB p65 in RAW264.7 cells

目前認為多種基本病理過程如細胞自噬、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡失衡等均參與了ARDS的發(fā)生與發(fā)展[12-15]。但研究發(fā)現(xiàn)過度的自我放大而失控的肺部炎癥反應(yīng)是ARDS發(fā)生的始發(fā)因素和根本原因，其中單核-巨噬細胞為主的炎癥細胞過度激活是ARDS發(fā)病的起始環(huán)節(jié)[12-15]。目前大量研究表明阻斷炎癥細胞激活可有效的改善ARDS的病理變化，對肺組織產(chǎn)生保護作用[12-17]。

GLP-1是腸道內(nèi)分泌L細胞(L cells)分泌的一種腦腸肽。目前研究證實GLP-1與糖代謝密切相關(guān)，高脂肪和高碳水化合物食物是促進GLP-1分泌的主要調(diào)節(jié)因素，同時發(fā)現(xiàn)DPP-4 (dipeptidy-peptidase 4, DPP-4)是代謝GLP-1的限速酶，目前GLP-1擬似物如利拉魯肽和艾塞那肽以及DPP-4抑制劑沙格列汀和維格列汀等均已應(yīng)用于2型糖尿病的臨床治療[9-11, 18]。近來大量的研究發(fā)現(xiàn)除糖脂代謝外，GLP-1擬似物和DPP-4抑制劑還具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激及改善器官纖維化等藥理學(xué)作用[19-21]。Steven S等的研究顯示DPP-4抑制劑沙格列汀和GLP-1擬似物利拉魯肽均可以有效減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠炎癥反應(yīng)水平并改善其生存率[19]。Krasner NM等的研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可以有效的抑制LPS或TNF-α誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細胞(human aortic endothelial cells, HAECs) 炎癥分子VCAM-1和E-Selectin表達[20]。同時有研究顯示炎癥狀態(tài)下巨噬細胞ICAM-1的合成顯著增加，上調(diào)的ICAM-1可以有效的促進巨噬細胞與炎癥部位組織細胞的粘附和聚集，并認為ICAM-1的表達水平與炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)[21]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，在LPS干預(yù)后ICAM-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯增加；但LPS組較LPS+SAX組ICAM-1 mRNA和蛋白的表達增加更加明顯。該結(jié)果表明DPP-4抑制劑沙格列汀可以有效下調(diào)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的炎癥反應(yīng)水平。

近期研究表明GLP-1擬似物和DPP-4抑制劑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和改善脂代謝等生物學(xué)作用與調(diào)節(jié)蛋白激酶A (PKA)的活化密切相關(guān)[9~11]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，在LPS干預(yù)后PKA的活化水平明顯下降。但LPS組較LPS+SAX組PKA的活化水平下降更加明顯。同時，在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下沙格列汀對于KA的活化水平的促進作用可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗。同時進一步的研究顯示在多種炎癥狀態(tài)下PKA活化狀態(tài)與NF-κB的磷酸化水平密切相關(guān)，而后者在炎癥調(diào)控中扮演著重要的角色，抑制NF-κB活化或下調(diào)其表達均可有效的改善炎癥反應(yīng)水平[23]。且NF-κB信號通路在炎癥狀態(tài)下對于巨噬細胞ICAM-1的表達有關(guān)鍵的調(diào)控作用[24]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，在LPS干預(yù)后NF-κB p65的活化水平明顯增加；但LPS組較LPS+SAX組NF-κB p65的活化水平增加更加明顯。同時，在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下沙格列汀對于對于ICAM-1 mRNA和蛋白的表達以及NF-κB p65活化水平的抑制作用均可被PKA抑制劑H-89顯著拮抗。以上結(jié)果表明在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥狀態(tài)下DPP-4抑制劑沙格列汀可以通過促進PKA的活化有效的下調(diào)NF-κB p65的磷酸化水平，并下調(diào)炎癥分子ICAM-1的表達。

4結(jié)論

本研究顯示，DPP-4抑制劑可以通過調(diào)控PKA/NF-κB信號通路下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的炎癥反應(yīng)，為DPP-4抑制劑應(yīng)用于臨床炎癥性疾病治療奠定了初步的理論基礎(chǔ)。

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(收稿日期：2015-06-29； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：朱濤，E-mail:zhutao063020@163.com

基金項目：中國博士后科學(xué)基金(2014M552369) ；四川省醫(yī)學(xué)會科研課題(171140342)

【中圖分類號】R 446.62

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.007