桑皮素通過抑制STAT3磷酸化下調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

鄧潔　張小霞　鄧曉楊　彭聰　羅劍波　朱濤

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 四川 成都 610500;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室/呼吸內(nèi)科， 四川 成都 610041)

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桑皮素通過抑制STAT3磷酸化下調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

鄧潔1張小霞1鄧曉楊1彭聰1羅劍波1朱濤2

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 四川 成都 610500;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸病學(xué)研究室/呼吸內(nèi)科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討桑皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用和對(duì)Cyclin D1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及潛在的分子機(jī)制。方法使用不同濃度的桑皮素 (0μM、10μM和50μM)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。在不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、24h和48h)使用MTT法對(duì)SKOV3細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。在干預(yù)48h后，使用qPCR對(duì)在不同濃度桑皮素干預(yù)的SKOV3細(xì)胞Cyclin D1 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。使用western blot對(duì)在不同濃度桑皮素的SKOV3細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)水平和STAT3磷酸化水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果使用不同濃度桑皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性降低，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。桑皮素干預(yù)48h后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及STAT3磷酸化水平水平呈濃度依賴性的下降，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)表明桑皮素可以通過抑制STAT3磷酸化顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖并下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】桑皮素； 卵巢癌； SKOV3細(xì)胞； 細(xì)胞周期蛋白D1； STAT3

Morusin down-regulates Cyclin D1 expression by inactivation of STAT3 in ovarian cancer SKOV3 cellsDENG Jie1, ZHANG Xiaoxia1, PENG Cong1,etal

(1.DepartmentofGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China;

2.DivisionofPulmonaryDiseases,StateKeyLaboratoryofBiotherapyofChina,DepartmentofRespiratoryMedicine,

WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the anti-tumor property of morusin in ovarian cancer SKOV3 cells and its underlying mechanism. MethodsSKOV3 cells were treated with three different concentrations (0μM, 10μM and 50μM) of morusin. At different time points (0h, 24h and 48h), MTT assay was used to detect the cell viabilities. QPCR was performed to measure the mRNA expression of Cyclin D1. The protein expression of Cyclin D1 and phosphorylation of STAT3 were analyzed by Western blot.ResultsThe cell viabilities of ovarian cancer SKOV3 cells were concentration-dependently and time-dependently inhibited by morusin. The mRNA and protein expression of Cyclin D1 and the phosphorylation of STAT3 were all concentration-dependently inhibited by morusin in ovarian cancer SKOV3 cells, after 48 hours interventions. ConclusionsMorusin could suppress the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells and Cyclin D1 expression probably through inactivation of STAT3.

【Key words】Morusin; Ovarian cancer; SKOV3 cells; Cyclin D1; STAT3

研究證實(shí)卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有病理類型多樣，惡性程度高的生物學(xué)特點(diǎn)[1-4]。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(American Cancer Society, ACS)的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)美國(guó)卵巢癌患者5年生存率僅44%左右[1-7]。桑皮素(morusin)是中藥桑枝的主要藥理成分之一。目前發(fā)現(xiàn)桑皮素具有促進(jìn)和改善糖脂代謝、抑制氧化應(yīng)激、抗病毒、促進(jìn)腫瘤凋亡、抑制腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等多種藥理活性[8-11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)桑皮素的生物活性與抑制STAT3活化密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討桑皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用和對(duì)Cyclin D1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及潛在的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自日本Takara公司；iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System購買于美國(guó)百樂公司；鼠抗人Cyclin D1抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國(guó)Cell Signaling公司；桑皮素購買于美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購買于美國(guó)Gibco公司；小牛血清購買于杭州四季清公司；MTT試劑盒購買于美國(guó)Promega公司；超純水；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞常規(guī)接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL約含5×103個(gè)細(xì)胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細(xì)胞16h至24h，使細(xì)胞同步化。加入不同終濃度(0μM、10μM和50μM)的桑皮素，在37℃，5 % CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，0μM DAPT干預(yù)組細(xì)胞作為對(duì)照組。使用MTT比色試驗(yàn)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48 h)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性(%)=(OD干預(yù)組/OD對(duì)照組) ×100(%)[12]。

1.2.3細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)檢測(cè)按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。Cyclin D1正義 5′-CGTGGG CTCTAAGA TGAAGG-3′，反義5′-TGCGG ATGATCTGTT TGTTC-3′；β-actin正義：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反義：5′-GCTCAGGAG GAGCAAT GATCT-3′。使用β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-△△CT公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt = (Ct,目標(biāo)-Ct,β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標(biāo)-Ct,β-actin)對(duì)照組[13]。

1.2.4Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)水平和STAT3磷酸化水平按試劑盒操作先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體鼠抗人Cyclin D1抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法結(jié)果分析在不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預(yù)后，使用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48h)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)給予桑皮素干預(yù)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞活性呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性下降，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表1。

Table 1Cell viabilities of SKOV3 cells in different time points

藥物濃度MTT不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)(×10-2)0h24h48h0μM10010010010μM103.41±2.1978.15±14.09①51.12±9.18①50μM102.66±2.0655.67±10.25①②34.26±6.04①②

注：對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與0μM相比較①P<0.05，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與10μM相比較②P<0.05。

2.2Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)在給予卵巢癌SKOV3細(xì)胞不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預(yù)48h后，使用qPCR和western blot法對(duì)細(xì)胞Cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。與為干預(yù)細(xì)胞相比較，給予桑皮素干預(yù)的細(xì)胞Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見圖1，表2。

圖1SKOV3細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 1Western blot result of the protein expression of Cyclin D1 in SKOV3 cells

Table 2The mRNA and protein expression levels of Cyclin D1 and the phosphorylation of STAT3 in SKOV3 cells

藥物濃度CyclinD1mRNACyclinD1蛋白STAT3磷酸化水平0μM10.98±0.05 0.95±0.07 10μM0.57±0.22①0.64±0.14①0.58±0.12①50μM0.31±0.13①②0.29±0.06①②0.36±0.09①②

注：與0μM相比較①P<0.05，與10μM相比較②P<0.05

2.3STAT3磷酸化水平在給予SKOV3細(xì)胞不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預(yù)48h后，使用western blot法對(duì)細(xì)胞STAT3磷酸化水平(phospho-STAT3/total STAT3)進(jìn)行檢測(cè)。與未干預(yù)細(xì)胞相比較，給予桑皮素干預(yù)后的SKOV3細(xì)胞STAT3磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2，表2。

圖2SKOV3細(xì)胞STAT3磷酸化的western blot結(jié)果

Figure 2Western blot result of the phosphorylation of STAT3 in SKOV3 cells

3討論

研究證實(shí)卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌[1-7, 14, 15]。由于卵巢組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且均可發(fā)生腫瘤性病變，目前認(rèn)為卵巢是全身器官中腫瘤病理類型最多的器官，其主要包括漿液性腫瘤、粘液性腫瘤和宮內(nèi)膜樣腫瘤最為常見。卵巢癌惡性程度普遍較高，同時(shí)由于卵巢位置處于盆腔深處，故發(fā)現(xiàn)一般較晚，約61%的患者診斷時(shí)已處于進(jìn)展期，預(yù)后多不理想[1-7, 14, 15]。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(American Cancer Society, ACS)的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)美國(guó)卵巢癌患者平均年齡為63歲，5年生存率低于50%[1-7, 14, 15]。

桑皮素(morusin)是中藥桑枝的主要藥理成分之一。目前發(fā)現(xiàn)桑皮素具有促進(jìn)和改善糖脂代謝、抑制氧化應(yīng)激、抗病毒、促進(jìn)腫瘤凋亡、抑制腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等多種藥理活性[8-11]。金曉明等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桑皮素可有效改善鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖、胰島素及糖化血紅蛋白等指標(biāo)[16]。Syahdi RR等發(fā)現(xiàn)桑皮素具有抑制HIV-1病毒逆轉(zhuǎn)錄的作用[17]。Lee HJ等的研究發(fā)現(xiàn)桑皮素對(duì)一氧化氮(NO)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[18]。Lim SL等研究發(fā)現(xiàn)桑皮素可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有效抑制前列腺癌DU145細(xì)胞、M2182細(xì)胞和PC3細(xì)胞的增殖[19]。Lin WL等報(bào)道證實(shí)桑皮素對(duì)人肝癌SK-Hep1細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)以及腫瘤增殖有顯著的抑制作用[20]。本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度(0μM、10μM和50μM)的桑皮素干預(yù)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，并采用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48h)的SKOV3細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)給予桑皮素干預(yù)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞活性呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性下降，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。該結(jié)果表明桑皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖有抑制作用。研究表明，桑皮素的抗腫瘤作用與其抑制STAT3磷酸化密切相關(guān)[19, 20]。Lim SL等在對(duì)前列腺癌的研究中證實(shí)桑皮素主要是通過抑制STAT3的活化下調(diào)了包括survivin、Cyclin D1、Bcl-2以及Bcl-xl等在內(nèi)的多種腫瘤增殖重要分子的表達(dá)，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖[19]。同時(shí)，Lin WL等的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)桑皮素對(duì)人肝癌SK-Hep1細(xì)胞的抑制作用也與調(diào)節(jié)STAT3的活化密切相關(guān)[20]。由于Cyclin D1在腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)過程中扮演著重要的角色，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)STAT3信號(hào)通路對(duì)其有關(guān)鍵的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)Cyclin D1的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予卵巢癌SKOV3細(xì)胞不同濃度(0μM、10μM和50μM)桑皮素干預(yù)48h后，與未干預(yù)細(xì)胞相比較，給予桑皮素干預(yù)的細(xì)胞Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05) (圖1，表2)。進(jìn)一步對(duì)STAT3的活化水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)與未干預(yù)細(xì)胞相比較，給予桑皮素干預(yù)后的SKOV3細(xì)胞STAT3磷酸化水平呈劑量依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05) (圖2，表2)。該結(jié)果表明桑皮素可以有效的抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)和STAT3磷酸化水平。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)表明，桑皮素可以通過抑制STAT3磷酸化顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖并下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)。為桑皮素應(yīng)用于卵巢癌等惡性腫瘤的臨床治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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(收稿日期：2015-04-14; 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：鄧曉楊E-mail:dengxiaoyang2014@sina.com

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金(2014M552369);四川省醫(yī)學(xué)會(huì)科研課題(171140342)

【中圖分類號(hào)】R 737.32

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.005