曾 曉，袁 丁，王 婷，劉苗苗，狄國(guó)杰，張海濱，李 靳，劉朝奇，張長(zhǎng)城

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

隱睪是男性常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)先天畸形，是引起男性不育的主要危險(xiǎn)因素之一，臨床上以手術(shù)治療為主，但隱睪患者精子質(zhì)量在隱睪術(shù)后仍可能繼續(xù)受到損害。中醫(yī)藥對(duì)改善精子數(shù)量和質(zhì)量及運(yùn)動(dòng)功能方面均顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但中藥對(duì)隱睪復(fù)位固定術(shù)后睪丸生精功能恢復(fù)的影響還少有研究。本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)典補(bǔ)腎填精方劑五子衍宗方為研究對(duì)象，觀察該方對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性隱睪復(fù)位固定術(shù)后睪丸生精功能恢復(fù)的影響，從而為臨床運(yùn)用五子衍宗方治療隱睪復(fù)位固定術(shù)后睪丸生精功能恢復(fù)障礙提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)Balb/c小鼠5～6周齡，體質(zhì)量22～25g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 藥物

五子衍宗方組成:枸杞子 400g，菟絲子(炒)400g，覆盆子 200g，五味子(蒸)50g，車(chē)前子(鹽炒)100g，按照傳統(tǒng)方法煎藥濃縮干燥至粉末，總提取率為35%，臨用前用蒸餾水溶解。

1.3 Bouins液

苦味酸飽和水溶液750 mL，甲醛250 mL，冰醋酸 50 mL。精子營(yíng)養(yǎng)液:BWW(NaCl 0.554 g·L－1，KCl 0.0356 g·L－1，CaCl20.025 g·L－1，KH2PO40.0162 g·L－1，MgSO4·7H2O 0.0294 g·L－1，NaHCO30.210 g·L－1，NaPyr 0.003 g·L－1，Nalac 0.370 g·L－1，Glucose 0.100 g·L－1，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.5% 的酚紅1.0mL，青霉素 10000 U，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.3%的 BSA)。其余藥品均為分析純。

1.4 儀器

SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司)，DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(德國(guó) Leica公司)，H-7500型透射式電子顯微鏡(德國(guó) Leica公司)，ULTRACUT R型超薄切片機(jī)(奧地利萊卡公司)，JA2003型電子分析天平(上海天平儀器廠)，COULTZEREPICS XL2MCL流式細(xì)胞儀，Beckman公司。

2 方法

2.1 隱睪模型制備

32只Balb/c雄性小鼠隨機(jī)分為4組，依次為假手術(shù)組、模型組、五子衍宗方 100、200 mg·kg－1劑量組，每組各8只。各組小鼠用2%戊巴比妥鈉80 mg·kg－1麻醉后，腹中線開(kāi)口，將雙側(cè)睪丸提入腹腔，假手術(shù)組即關(guān)閉切口，其余各組切斷韌帶，縫合內(nèi)環(huán)口，關(guān)閉切口。手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)14 d，隱睪所造成的生精功能損害模型即已形成［1］。

2.2 隱睪復(fù)位固定手術(shù)

隱睪模型建立以后，各組小鼠用2%戊巴比妥鈉80 mg·kg－1麻醉，腹中線開(kāi)口，假手術(shù)組即關(guān)閉切口，其余各組將內(nèi)環(huán)口的縫線拆除，擴(kuò)大內(nèi)環(huán)口，用絲線將雙側(cè)腹腔中的睪丸固定在陰囊底部，關(guān)閉切口。于固定術(shù)后第2天給藥，假手術(shù)組和模型組每天灌服純凈水 0.01mL·g－1，五子衍宗方 100、200 mg·kg－1組分別每天灌服相應(yīng)劑量五子衍宗方(對(duì)應(yīng)五子衍宗方生藥含量分別為 285，570 mg·kg－1)，每天1次，各組小鼠連續(xù)給藥14 d。

2.3 小鼠生殖器官質(zhì)量測(cè)定

末次給藥24 h后稱重，處死小鼠取睪丸和附睪并稱濕重。

2.4 小鼠精子密度及精子活率的測(cè)定

將盛有6 mL精子營(yíng)養(yǎng)液［3］的試管置于恒溫水浴箱預(yù)熱至37℃，取單側(cè)附睪去除脂肪，剪碎放入試管中搖勻，37℃保溫10～15 min，使精子充分游離，接著取1滴滴入牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)算每1mL精子數(shù)。用微量移液器吸取10 μL精子懸液，利用SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀進(jìn)行精子活率測(cè)定。

2.5 小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察

取單側(cè)睪丸，石蠟切片(4 μm厚)，HE染色，光鏡觀察睪丸組織內(nèi)精原細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞的分布情況。環(huán)氧樹(shù)脂包埋做超微切片，電鏡觀察睪丸組織內(nèi)曲細(xì)精管及各級(jí)生精細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

2.6 小鼠睪丸各倍體生精細(xì)胞比例影響測(cè)定

取單側(cè)睪丸去除包膜、剪碎，置于3ml pH 7.4的PBS試管中，吹打100次，自然沉淀5min棄上清，1mg·ml－1胰酶 1 ml、37℃ 消化 20 min，用 200 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，取細(xì)胞液 1000 r·min－1離心 5 min，棄上清，加 3 ml PBS 將沉淀懸浮，1000 r·min－1離心 5 min，棄上清，同樣條件重復(fù)洗滌2次，制成單細(xì)胞懸液。PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度至 106～107個(gè)·ml－1，4℃ 、70% 乙醇固定12 h后，低速短時(shí)離心去除固定液，PBS洗2遍，加 40 μg·ml－1的 RNA 酶 400 μL，于 37℃ 水浴 30 min，加入 100 μL PI染液混勻，4℃避光染色 30 min即可上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出不同倍體細(xì)胞的百分比。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后臟器指數(shù)影響

表1顯示，模型組小鼠睪丸質(zhì)量顯著低于假手術(shù)組，五子衍宗方各劑量均可增加生精障礙小鼠的睪丸質(zhì)量。

表1 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸質(zhì)量的影響(±s，n=8)

表1 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸質(zhì)量的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組別 體質(zhì)量(g)睪丸質(zhì)量(mg)睪丸指數(shù)(mg·100g － 1)31.6±2.54 93.3±8.32 287.44±25.26模 型 組 31.6±1.66 49.7±2.98＊＊ 154.43±16.84＊＊五子衍宗方100 mg·kg－1組假手術(shù)組29.2±2.76 55.4±2.75## 181.36±27.98五子衍宗方200 mg·kg－1組29.6±1.29 62.1±3.03## 185.08±22.08#

3.2 對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后精子密度及精子活率的影響

表2顯示，模型組小鼠精子密度、精子活率顯著低于假手術(shù)組。五子衍宗方各劑量均可顯著提升生精障礙小鼠的精子密度和精子活率，且表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

3.3 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

光鏡可見(jiàn)，陰囊睪丸中精子發(fā)生正常，曲細(xì)精管形態(tài)正常(圖1-A)。隱睪小鼠行復(fù)位固定手術(shù)后，部分曲細(xì)精管(“”所示)內(nèi)細(xì)胞增殖明顯，填充整個(gè)管腔;部分曲細(xì)精管內(nèi)(“”所示)僅保留支持細(xì)胞及少量精原細(xì)胞，幾乎未見(jiàn)精母細(xì)胞(圖1-B)。五子衍宗方100mg·kg－1劑量給藥14 d后，生精上皮結(jié)構(gòu)基本完整，可見(jiàn)多數(shù)小管內(nèi)精子細(xì)胞(圖1-C)。五子衍宗方200mg·kg－1劑量給藥14 d后，生精細(xì)胞的有序排列基本不變，部分曲細(xì)精管內(nèi)有正常的精子發(fā)生過(guò)程(“”所示)(圖1-D)。

表2 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后精子計(jì)數(shù)和活率的影響(±s，n=8)

表2 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后精子計(jì)數(shù)和活率的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組別 精子計(jì)數(shù)/×108·L－1 精子活率/%假 手 術(shù) 組34.54±3.60 42.20±9.18模型組 11.46 ±1.80＊＊ 6.40 ±1.52＊＊五子衍宗方100mg·kg－1組 20.68±0.84## 20.80±1.92##五子衍宗方200mg·kg－1組 22.84±2.06## 31.20±2.39##

圖1 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響(HE×200)

3.4 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡下可見(jiàn)，陰囊睪丸中可見(jiàn)形態(tài)正常的精子細(xì)胞，精子發(fā)生正常(圖2-A，8K)。隱睪小鼠行復(fù)位固定手術(shù)后，可見(jiàn)精子細(xì)胞胞核皺縮，核周線粒體脊受損(“”所示)，部分線粒體內(nèi)空泡(圖2-B，8K)。五子衍宗方給藥14 d后，可見(jiàn)精母細(xì)胞處于活躍的增殖期，核染色變深，胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡明顯減少(圖 2-C、D，7K)。

3.5 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸各級(jí)生精細(xì)胞比例的影響

表3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠1N和4N細(xì)胞百分比顯著下降，2N細(xì)胞百分比相應(yīng)升高。五子衍宗方各劑量均可顯著增加小鼠睪丸內(nèi)1N和4N細(xì)胞的百分比，而2N細(xì)胞比例相對(duì)下降。

4 討論

我們前期研究顯示［2］，小鼠進(jìn)行隱睪造模后可致睪丸內(nèi)生精細(xì)胞發(fā)生退化，生精上皮變薄，生精功能明顯降低。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，模擬臨床手術(shù)治療方式，將隱睪回納入陰囊并固定于陰囊底部，于術(shù)后給予五子衍宗方，以探討隱睪復(fù)位固定術(shù)后五子衍宗方對(duì)睪丸生精功能恢復(fù)作用的影響。

圖2 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

表3 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸各級(jí)生精細(xì)胞比例的影響(±s，n=8)

表3 五子衍宗方對(duì)隱睪小鼠復(fù)位固定術(shù)后睪丸各級(jí)生精細(xì)胞比例的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組別29.77±2.85 26.07±3.15 23.73±1.25模 型 組 0.63±0.10＊＊ 59.50±4.29＊＊ 15.83±3.06*五子衍宗方100 mg·kg－1組 6.44±1.17## 44.67±2.55## 21.37±0.67#五子衍宗方200 mg·kg－1組 9.11±0.68## 42.17±4.99# 32.37±2.03 1N/% 2N/% 4N/%假手術(shù)組##

精子在睪丸中發(fā)生，經(jīng)由精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞而成形，精子的數(shù)量和活率是評(píng)價(jià)精液質(zhì)量的重要指標(biāo)，是影響受孕的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠隱睪進(jìn)行睪丸復(fù)位固定手術(shù)后，睪丸重量、精子密度、精子活率等顯著下降，其生精上皮呈現(xiàn)部分過(guò)度增殖而使管腔阻塞，部分不能增殖而使生精小管退化萎縮。流式結(jié)果顯示，初級(jí)精母細(xì)胞(4N)與精子細(xì)胞和精子(1N)比例顯著降低。五子衍宗方能夠增加模型小鼠的睪丸重量，提高精子密度與精子活率，恢復(fù)生精小管內(nèi)生精上皮結(jié)構(gòu)，促進(jìn)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞的進(jìn)一步分化，并促進(jìn)次級(jí)精母細(xì)胞向精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而恢復(fù)睪丸內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞百分比。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)于隱睪復(fù)位固定術(shù)后促進(jìn)睪丸生精功能恢復(fù)的輔助用藥具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

［1］曾曉，張長(zhǎng)城，狄國(guó)杰，等.五子衍宗方對(duì)實(shí)驗(yàn)性隱睪小鼠生精功能的保護(hù)作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(24):170-173.