羊肚菌液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

季向陽，羅孝坤

（中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

羊肚菌液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

季向陽，羅孝坤

（中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

研究了羊肚菌（Morchella esculenta）在液體發(fā)酵過程中不同培養(yǎng)條件（裝液量、接種量、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間）對菌絲體生物量的影響。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法對羊肚菌發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了其液體發(fā)酵的最佳條件。結(jié)果表明：羊肚菌液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)條件為初始pH 6.0，裝液量100mL/300mL三角瓶，接種量10%，旋轉(zhuǎn)頻率140 r·min－1，25℃恒溫培養(yǎng)120 h。

羊肚菌；液體發(fā)酵；菌絲生物量

羊肚菌 [Morchella esculenta(L.)Pars]屬子囊菌亞門（Ascomycotina） 盤菌綱（Discomycetes） 盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaccac）羊肚菌屬（Morchella）[1]，俗稱羊蘑、美味羊肚菌、羊肚菜、羊肚蘑等。其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，并且含有多種氨基酸、酶類、多糖類、吡喃酮抗生素、脂肪酸類等成份，在提高機(jī)體免疫力和抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗疲勞等方面功效顯著[2－3]。羊肚菌子實(shí)體生長環(huán)境和繁衍條件要求比較復(fù)雜，規(guī)?；斯ぴ耘嘁草^困難，導(dǎo)致羊肚菌生產(chǎn)量低下，造成市場價(jià)格一直偏高[4]。研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌絲體營養(yǎng)成分與子實(shí)體相似，具有子實(shí)體獨(dú)特的風(fēng)味，而且可以通過規(guī)?；a(chǎn)菌絲體，具有產(chǎn)量穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短、成本低、效益高等優(yōu)點(diǎn)[5]。本試驗(yàn)對羊肚菌液體發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行研究，篩選得到適合菌絲體生長的發(fā)酵培養(yǎng)條件，為更進(jìn)一步開發(fā)羊肚菌深加工產(chǎn)品提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

羊肚菌菌種來自于中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）母種培養(yǎng)基

綜合馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。

（2）種子培養(yǎng)基

葡萄糖 2%、蛋白胨 0.2%、酵母膏 0.1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、維生素 B110 mg/ 100mL。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉3%、黃豆粉2%、葡萄糖1%、酵母膏 0.4%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%、維生素B110 mg·L－1。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子液制備

采用300 mL三角瓶裝100 mL種子培養(yǎng)基，滅菌后接入黃豆粒大小活化后的羊肚菌斜面菌種，旋轉(zhuǎn)頻率140 r·min－1，25℃培養(yǎng)4 d。

1.2.2 發(fā)酵條件篩選試驗(yàn)

采用300 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基，無菌條件下接種種子液，置往復(fù)式搖床，進(jìn)行最適培養(yǎng)條件試驗(yàn)，如裝液量、接種量、初始pH和培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.3 發(fā)酵條件正交優(yōu)化

根據(jù)發(fā)酵條件單因素篩選結(jié)果，設(shè)定培養(yǎng)溫度25℃，旋轉(zhuǎn)頻率140 r·min－1，以裝液量、接種量、培養(yǎng)基初始pH為主要影響因素，選用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳發(fā)酵條件。

表1 發(fā)酵條件L9(34)正交試驗(yàn)的因素及水平Tab.1 Levels and factors of L9(34)orthogonal test for liquid condition

1.3 生長量的測定

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液3 500 r·min－1離心30 min，棄去上清液，所得菌絲體用蒸餾水清洗后再離心，反復(fù)3次后，置于干燥箱中65℃烘干，分析天平稱量，計(jì)算菌絲體生物量（g·L－1）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組比較，新復(fù)極差檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對羊肚菌菌絲體生物量的影響

2.2.1 裝液量對菌絲體生物量的影響

選擇300 mL三角瓶裝液量分別為60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、150 mL進(jìn)行試驗(yàn)，每個試驗(yàn)做3次重復(fù)，取平均值。5組裝液量羊肚菌菌絲體生物量其及顯著水平見表2。

表2 裝液量對羊肚菌菌絲體生物量的影響Tab.2 Influence of culture volume on the mycelium biomass of Morchella esculenta

從表2可以看出，在300 mL三角瓶中裝液量為120 mL時(shí)，發(fā)酵菌絲體生物量最高，因此選用裝液量120 mL進(jìn)行發(fā)酵。

2.2.2 接種量對菌絲體生物量的影響

選擇接種量分別為1%、5%、10%、15%、20%進(jìn)行試驗(yàn)，每個試驗(yàn)做3次重復(fù)。5組接種量羊肚菌菌絲體生物量其及顯著水平見表3。

從表3可以看出，接種量10%時(shí)，羊肚菌發(fā)酵菌絲體生物量最高，因此選用10%接種量進(jìn)行接種。

2.2.3 初始pH值對菌絲體生物量的影響

表3 接種量對羊肚菌菌絲體生物量的影響Tab.3 Influence of inoculum size on the mycelium biomass of Morchella esculenta

選擇初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0進(jìn)行試驗(yàn)，用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)。每個試驗(yàn)做3次重復(fù)。5組羊肚菌菌絲體生物量其及顯著水平見表4。

表4 初始pH值對羊肚菌菌絲體生物量的影響Tab.4 Influence of initial pH value on the mycelium biomass of Morchella esculenta

從表4可以看出，初始pH值6.0時(shí)有利于羊肚菌菌絲體的生長，菌絲體生物量最大，因此羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值選擇6.0最佳。

2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對菌絲體生物量的影響

選擇培養(yǎng)時(shí)間分別為96 h、108 h、120 h、132 h、144 h進(jìn)行試驗(yàn)，每個試驗(yàn)做3次重復(fù)。

5種培養(yǎng)時(shí)間羊肚菌菌絲體生物量其及顯著水平見表5。

表5 培養(yǎng)時(shí)間對羊肚菌菌絲體生物量的影響Tab.5 Influence of culture time on the mycelium biomass of Morchella esculenta

從表5可以看出，羊肚菌發(fā)酵菌絲體在培養(yǎng)120 h時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最高9.18 g·L-1，說明培養(yǎng)時(shí)間120 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.2.5 發(fā)酵條件正交優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析。

L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析結(jié)果見表6。

從表6可以看出，正交試驗(yàn)優(yōu)水平組合A2B2C2為最優(yōu)水平組合，即優(yōu)化后的羊肚菌液體發(fā)酵工藝條件為裝液量100 mL/300mL三角瓶，接種量10%，培養(yǎng)液初始pH值6.0，在溫度25℃，搖床旋轉(zhuǎn)頻率140 r·min-1條件下培養(yǎng)120 h。

表6 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表Tab.6 Intuitive analysis table for the result of L9(34)orthogonal test

3 討論

采用單因素試驗(yàn)確定了適合羊肚菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)液初始pH值為6.0，裝液量120 mL/300mL三角瓶，接種量10%，培養(yǎng)時(shí)間120 h。正交優(yōu)化后確定其最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)液初始pH值6.0，接種量10%，裝液量100 mL/300 mL三角瓶，旋轉(zhuǎn)頻率140 r·min-1，25℃恒溫培養(yǎng)120 h。

本試驗(yàn)結(jié)論與前人研究結(jié)論存在差異，王瑩等得出羊肚菌的最適生長條件是搖床頻率120 r·min-1、250 mL三角瓶裝料50 mL、pH值自然、28℃震蕩培養(yǎng)5 d，劉士旺等[6]發(fā)現(xiàn)羊肚菌的最適生長條件為發(fā)酵溫度25℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1、裝液量150 mL/ 500mL。存在如此差異的原因主要是因?yàn)橥N羊肚菌的不同菌株之間對環(huán)境條件的要求存在較大差異，不同的培養(yǎng)條件下得到的液體發(fā)酵產(chǎn)物成分也會存在較大差異。因此，可以根據(jù)不同發(fā)酵目的選擇不同菌株，從而使目的產(chǎn)量最大化。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羊肚菌發(fā)酵過程中裝液量的多少直接影響培養(yǎng)基的通氣情況。若裝液量過少則通氣量太大，菌絲會生長緩慢；裝液量過多通氣量太小，菌絲體生長需要的基本通氣量不能保證，反而影響菌絲體生物量。因此，羊肚菌液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體過程中對通氣量的控制非常重要，直接影響產(chǎn)品產(chǎn)量。

[1]蘭進(jìn)，曹文苓，徐錦堂.中國羊肚菌屬真菌資源[J].資源科學(xué)，1999，21（2）：56－61.

[2]雷艷，曾陽，唐勛，等.羊肚菌化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（2）：59－65.

[3]才曉玲，何偉，何福全，等.羊肚菌生物活性研究進(jìn)展[J].中國食用菌，2013（5）：59－65.

[4]熊艷，車振明.羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀和展望[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（1）：165－1658.

[5]王瑩，孫永海，王笑丹，等.粗柄羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].食用菌，2007（6）：6－8.

[6]劉士旺，毛建衛(wèi)，吳元鋒，等.粗柄羊肚菌液體發(fā)酵條件研究[J].中國釀造，2008（23）：25－28.

Optimization of Liquid Culture Condition for Morchella esculenta

JI Xiang-yang,LUO Xiao-kun
（Science Institute of Yunnan Province Supply and Marketing Cooporatives,Kunming 6502213,China）

To study different culture condition on the effect of mycelium biomass during the liquid fermentation of Morchella esculenta.The fermentation condition of M.esculenta was optimized using L9(34)orthogonal design method for determing the optimal condition of liquid fermentation.The result demonstrated that the optimal fermentation condition is initial pH 6.0,liquid medium volume (100/300 mL),inoculation amount(10%),rotary speed (140 r·min－1)and culture time (25℃for 120 h).

Morchella esculenta;liquid fermentation;mycelium biomass

S646.9

A

1003-8310（2016）02-0021-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.02.005

季向陽（1963－），男，本科，工程師，主要從事食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究。E－mail:Jixy418@sohu.com

2016－01－18