荷葉炒炭過(guò)程中金絲桃苷、異槲皮苷與槲皮素含量變化規(guī)律研究＊

李 坤，王明芳，薛非非，國(guó)金鈴，馬俊楠，孟祥龍，張朔生

（山西中醫(yī)學(xué)院制藥與食品工程學(xué)院 晉中 030619）

荷葉炒炭過(guò)程中金絲桃苷、異槲皮苷與槲皮素含量變化規(guī)律研究＊

李 坤，王明芳，薛非非，國(guó)金鈴，馬俊楠，孟祥龍，張朔生＊＊

（山西中醫(yī)學(xué)院制藥與食品工程學(xué)院 晉中 030619）

目的：本研究主要探究不同炒炭程度對(duì)荷葉炭中金絲桃苷、異槲皮苷與槲皮含量變化的影響，并建立HPLC同時(shí)測(cè)定這3種物質(zhì)的方法，通過(guò)模擬炮制來(lái)研究這3種物質(zhì)轉(zhuǎn)變的關(guān)系。方法：本實(shí)驗(yàn)采用Hypersil gold C18（4.6 mm×250 mm，5 μ）色譜柱；以乙腈（A）－0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：35℃。結(jié)果：荷葉炒炭后，金絲桃苷與異槲皮苷含量隨炮制時(shí)間呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)；槲皮素含量隨著炮制時(shí)間呈現(xiàn)先上升、后下降趨勢(shì)，并在280±5℃溫度下炒制10 min左右達(dá)到峰值；另外，在金絲桃苷和異槲皮苷模擬炮制樣品中均檢出槲皮素。結(jié)論：該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明不同炒炭程度對(duì)荷葉炭中金絲桃苷、異槲皮苷與槲皮素含量有顯著影響，在加熱炮制過(guò)程中金絲桃苷和異槲皮苷受熱分解產(chǎn)生槲皮素。

荷葉 炒炭 黃酮 高效液相 模擬炮制 炮制機(jī)理

荷葉（Nelumbinis folium）為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽(yáng)、涼血止血的功效，主治暑熱煩渴、暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、血熱吐衄、便血崩漏等癥[1]。目前廣泛應(yīng)用的飲片有生荷葉和荷葉炭2種，現(xiàn)代藥理研究表明荷葉炭有明確的止血作用[2]，但目前對(duì)荷葉炒炭飲片炮制程度的判斷僅依靠外觀性狀，仍沒(méi)有統(tǒng)一的質(zhì)量控制指標(biāo)。荷葉中主要含有生物堿、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸等成分，黃酮類(lèi)成分主要有金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素，這3種化合物有著共同的母核結(jié)構(gòu)，均為槲皮素[3]，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。荷葉炒炭之后生物堿類(lèi)物質(zhì)幾乎損失殆盡，槲皮素含量增加[4]，荷葉炭中主要有效成分為黃酮類(lèi)化合物。

荷葉在炮制過(guò)程中，黃酮類(lèi)物質(zhì)的變化對(duì)荷葉炭飲片質(zhì)量有顯著的影響。為了更好地控制炮制程度和荷葉炭飲片質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究建立HPLC同時(shí)測(cè)定飲片中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的含量；為了分析在炮制過(guò)程中這3種黃酮類(lèi)化合物的變化規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)對(duì)荷葉生品和8種不同炮制程度的荷葉炭樣品進(jìn)行含量測(cè)定和分析，希望能為荷葉炭飲片炮制標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)該實(shí)驗(yàn)采用模擬炮制的方法對(duì)炮制過(guò)程中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素轉(zhuǎn)變機(jī)制做了進(jìn)一步研究，旨在探討荷葉炮制機(jī)理，并從分子水平研究角度為藥飲片炮制機(jī)理研究提供新的思路和方法。

1 材料

實(shí)驗(yàn)采用UltiMate 3000高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），包括：在線真空脫氣機(jī)、雙三元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器和Chromeleon 7色譜工作站；SB25-12D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；DV215CD型十萬(wàn)分之一電子分析天平（美國(guó)奧豪斯儀器公司）；Optris MS-C012005-B型紅外測(cè)溫儀（德國(guó)Optris儀器公司）；娃哈哈純凈水，乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；其他試劑為分析純。

圖1 3種荷葉黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)式

藥材：荷葉藥材于2013年10月于山東濟(jì)寧采集，由山西中醫(yī)學(xué)院張朔生教授鑒定為睡蓮科植物蓮N. nucifera Gaertn.的葉。

對(duì)照品：金絲桃苷（批號(hào)：111521-201205）、異槲皮苷（批號(hào)：111809-201102）、槲皮素（批號(hào)：100081-200907）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 荷葉炭樣品制備

取荷葉去除雜質(zhì)，切成絲，分別取凈荷葉絲50 g，置于預(yù)熱至280℃的炒鍋內(nèi)，分別炒制3、5、8、10、12、15、17和20 min，制備出不同炮制程度的荷葉炭飲片，分別編號(hào)為荷葉炭1-8號(hào)。炒制3-8 min的荷葉炭飲片顏色較淺，部分葉片顏色泛綠，未達(dá)到炭藥的炮制標(biāo)準(zhǔn)，炒制10-15 min的荷葉炭飲片表面棕褐色或黑褐色，炒制17-20 min的荷葉炭飲片顏色焦黑已經(jīng)碳化，邊緣部分已經(jīng)灰化。取各荷葉炭樣品，粉碎，過(guò)40目篩，備用。

2.2 金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

Hypersil gold C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0-17 min，15%A；17-35 min，15%-50%A；35 min，15%A；35-40 min，15%A）；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品、供試品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照品（A）、生荷葉樣品（B）和荷葉炭樣品（C）的HPLC圖

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素分別置于5 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度配成單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度分別為：1.246、0.910、0.730 mg·mL-1；分別精密移取適量各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成1 mL含金絲桃苷0.373 8 mg，異槲皮苷0.273 mg，槲皮素0.219 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備[5-7]

精密稱取各樣品粉末0.5 g于三角瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，水浴回流1 h，靜置放冷，用60%乙醇補(bǔ)足重量，搖勻過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、4.0 mL分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻；分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄各被測(cè)成分峰面積，以各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x），以各峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為：金絲桃苷：y=239.13x－0.393 4（r=0.999 9）；異槲皮苷：y=236.51x＋0.111 （r=0.999 9）；槲皮素：y=376.22x-1.830 6（r=0.999 9）。結(jié)果表明金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素分別在7.476-299.040、5.460-218.400、4.380-175.200 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.4項(xiàng)下4號(hào)對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD值分別為：0.32%、0.60%、0.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的峰面積的RSD值分別為：1.7%、1.6%、0.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

平行稱取荷葉炭4號(hào)樣品粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，并測(cè)定含量，計(jì)算得金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素三種物質(zhì)含量的RSD值分別為1.5%、1.8%、1.2%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

表1 3種化合物回收率（n=6）

2.2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的得荷葉樣品（荷葉炭4號(hào)樣）粉末（3種物質(zhì)含量分別為金絲桃苷4.273 8 mg·g-1，異槲皮苷1.319 8 mg·g-1，槲皮素7.164 0 mg·g-1），每份約0.25 g，平行6份，精密稱定。分別依次加入用甲醇配制好的各對(duì)照品溶液適量，揮干甲醇，按2.2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.9 供試品含量測(cè)定

分別取荷葉生品及不同炒制時(shí)間的炮制品粉末各約0.5 g，精密稱定，依法制備成供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算各成分含量結(jié)果見(jiàn)表2，各成分含量動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3。

2.3 模擬炮制試驗(yàn)[8]

金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素具有共同的母核，從上述測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，炮制過(guò)程中金絲桃苷和異槲皮苷含量下降，而槲皮素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。金絲桃苷和異槲皮苷的苷元為槲皮素，所以作者推測(cè)金絲桃苷與異槲皮苷在炮制過(guò)程中受熱分解產(chǎn)生槲皮素，從而導(dǎo)致自身含量下降，槲皮素含量升高。為進(jìn)一步研究，取金絲桃苷及異槲皮苷對(duì)照品在模擬飲片炮制的條件下進(jìn)行炮制，然后利用高效液相色譜進(jìn)行分析。

表2 供試品中3種成分測(cè)定結(jié)果

圖3 三種物質(zhì)隨炮制時(shí)間變化趨勢(shì)圖

2.3.1 模擬炮制樣品制備

精密稱取金絲桃苷和異槲皮苷適量，分別置于坩堝中，將坩堝置于調(diào)溫電熱套中，用紅外測(cè)溫計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)坩堝底部溫度，調(diào)節(jié)溫度從室溫升至280±5℃，并保持5 min，取出坩堝靜置至室溫，加入甲醇適量使其溶解，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.3.2 定性分析

按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，精密吸取模擬炮制樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜圖見(jiàn)圖4。

2.3.3 結(jié)果

從圖4中可以看出，金絲桃苷和異槲皮苷模擬炮制產(chǎn)物中峰面積最大是槲皮素，其他峰面積較小，說(shuō)明在加熱炮制的過(guò)程中，金絲桃苷及異槲皮苷分解產(chǎn)生槲皮素，從而使得自身含量降低，槲皮素含量升高。

圖4 金絲桃苷模擬炮制樣品（A）、異槲皮苷模擬炮制樣品（B）的HPLC圖

3 討論

3.1 炮制條件確定

在前期的研究中，本研究團(tuán)隊(duì)利用熱分析技術(shù)，通過(guò)熱重法及微商熱重法對(duì)金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素在模擬空氣氣氛條件下進(jìn)行加熱失重實(shí)驗(yàn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷和異槲皮苷在溫度升至280℃左右時(shí)失重速率明顯增加，金絲桃苷重量降低19.52%，異槲皮苷失重18.33%；當(dāng)溫度升至320℃時(shí)，槲皮素失重速率開(kāi)始增加，表明此時(shí)槲皮素呈現(xiàn)出熱不穩(wěn)定狀態(tài)開(kāi)始分解，基于此作者認(rèn)為荷葉炒炭溫度以280℃左右為宜，不宜超過(guò)300℃。

3.2 色譜條件的確定

由于金絲桃苷和異槲皮苷2種化合物結(jié)構(gòu)相似，很難實(shí)現(xiàn)完全分離，有報(bào)道曾在荷葉黃酮測(cè)定中用磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動(dòng)相[10]，緩沖鹽溶液為pH=4.0的0.2%的磷酸-10%氫氧化鈉溶液，實(shí)現(xiàn)了金絲桃苷與異槲皮苷的分離，但流動(dòng)相配制過(guò)程復(fù)雜，洗脫梯度長(zhǎng)達(dá)70 min，因此本文作者重新考察了甲醇－水，乙腈-水，甲醇-冰乙酸水溶液，甲醇-磷酸水溶液，乙腈-冰乙酸水溶液，乙腈-磷酸水溶液等多組流動(dòng)相系統(tǒng)，并對(duì)酸水溶液的濃度進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液時(shí)目標(biāo)化合物峰形及分離度良好。另選擇多種梯度洗脫程序進(jìn)行比較，對(duì)出峰時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，最終確定本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相條件。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法，方便快捷、分離度好、測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠同時(shí)測(cè)定金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素3種黃酮類(lèi)化合物，可以為荷葉藥材品質(zhì)鑒定以及飲片炮制過(guò)程中的質(zhì)量控制提供借鑒。

3.3 結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)生荷葉及8種不同炒炭程度的荷葉炭飲片中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素含量進(jìn)行了測(cè)定，從測(cè)定結(jié)果及圖3可知，荷葉炒炭之后金絲桃苷和異槲皮苷含量大幅降低，并隨著炮制時(shí)間呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，最后幾乎損失殆盡；槲皮素含量也出現(xiàn)大幅變化，隨著炮制時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在280±5℃溫度下炒制10 min左右含量達(dá)到峰值，最高可達(dá)生品含量12倍之多，但是隨著持續(xù)加熱炮制使得槲皮素也呈現(xiàn)出不穩(wěn)定的狀態(tài)，逐漸開(kāi)始分解，導(dǎo)致其含量下降。說(shuō)明加熱炮制對(duì)荷葉中金絲桃苷、異槲皮苷以及槲皮素含量有顯著影響，炮制的溫度和時(shí)間成為影響炮制品質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

金絲桃苷和異槲皮苷的苷元均為槲皮素，推測(cè)金絲桃苷與異槲皮苷在炮制過(guò)程中受熱分解產(chǎn)生槲皮素，為探究3中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量轉(zhuǎn)化關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了模擬炮制，圖4結(jié)果可以看出在金絲桃苷和異槲皮苷模擬炮制樣品中均檢出槲皮素，說(shuō)明金絲桃苷與異槲皮苷在炮制過(guò)程中受熱分解產(chǎn)生槲皮素。有藥理研究表明槲皮素可顯著縮短兔血漿活化部分凝血活酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，有較好凝血活性[11]，炒炭之后槲皮素含量明顯增加，這與荷葉制炭后用于出血癥的傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)是吻合的。

本實(shí)驗(yàn)選用的色譜條件能夠同時(shí)測(cè)定荷葉中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素3種黃酮類(lèi)化合物，可以比較全面的分析在炒炭過(guò)程荷葉中黃酮類(lèi)成分的含量變化；并借鑒模擬炮制方法，對(duì)金絲桃苷、異槲皮苷在模擬荷葉飲片炮制條件下的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，更加明確了荷葉炒炭過(guò)程中這3種黃酮成分的變化規(guī)律。通過(guò)對(duì)藥材中單體成分的模擬炮制，能夠?qū)?fù)雜的炮制環(huán)境簡(jiǎn)單化，清晰的呈現(xiàn)模擬炮制與飲片炮制過(guò)程中成分變化的相關(guān)性，有助于明確炮制過(guò)程中成分的變化途徑及其規(guī)律，對(duì)于闡明飲片炮制的科學(xué)內(nèi)涵和從分子水平研究中藥飲片炮制機(jī)理提供新的思路和方法。

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Study on Content Variations of Hyperoside, Isoquercitrin and Quercetin in Fried Charcoal Lotus Leaf

Li Kun, Wang Mingfang, Xue Feifei, Guo Jinling, Ma Junnan, Meng Xianglong, Zhang Shuosheng
(College of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China)

This study was aimed to analyze the content changes of hyperoside, isoquercitrin and quercetin in charred lotus leaf at different fried charcoal processing degrees. The simultaneous determination on 3 substances by HPLC was established. The material change relation among 3 substances was studied through the simulated processing. Hypersil gold C18column (4.6 mm × 250mm, 5 μm) was used in the study. The mobile phase was acetonitrile (A)-0.1% phosphoric acid (B) with gradient elution. The flow speed was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 360 nm. The column temperature was 35℃. The results showed that after the lotus leaf was fried charcoal, the contents of hyperoside and isoquercitrin decreased gradually along with the processing time. The content of quercetin increased first and then decreased with the increase of processing time. The content of quercetin in lotus leaf achieved the highest when it was processed for 10 min at the temperature of 280 ± 5℃. Quercetin was detected in both the hyperoside and isoquercitrin simulated processing samples. It was concluded that different processing degrees of fried charcoal lotus leaf had remarkable effects on the contents of hyperoside, isoquercitrin and quercetin. During the heating process, quercetin was decomposed from both hyperoside and isoquercitrin.

Lotus leaf, fried charcoal, flavonoids, HPLC, simulated processing, processing mechanism

10.11842/wst.2016.01.019

R943.1

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-09-13

修回日期：2015-11-07

＊ 山西省研究生優(yōu)秀創(chuàng)新項(xiàng)目（20133123）：基于熱分析技術(shù)對(duì)炒炭工藝與“炒炭存性”相關(guān)性研究，負(fù)責(zé)人：馬俊楠；山西中醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（YCX-1408）：荷葉不同炮制品藥理作用與物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)性研究，負(fù)責(zé)人：李坤。

＊＊ 通訊作者：張朔生，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥炮制現(xiàn)代研究。