怡康片指紋圖譜研究和兩個(gè)指標(biāo)成分定量測(cè)定＊

張海弢，徐振秋，付 娟，王振中，蕭 偉＊＊

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

怡康片指紋圖譜研究和兩個(gè)指標(biāo)成分定量測(cè)定＊

張海弢1，2，徐振秋1，2，付 娟1，2，王振中1，2，蕭 偉1，2＊＊

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

目的：建立怡康片的指紋圖譜，進(jìn)行兩個(gè)指標(biāo)成分的定量分析，為評(píng)價(jià)怡康片提供依據(jù)。方法：采用Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。結(jié)果：得到分離度、重現(xiàn)性均較好的怡康片指紋圖譜，標(biāo)示出19個(gè)共有峰，各批次樣品相似度在0.96以上；通過對(duì)照品比對(duì)，確定了兩個(gè)成分，分別為葛根素和姜黃素，并對(duì)其進(jìn)行定量分析。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)怡康片指紋圖譜和兩個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行分析，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可作為全面評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量的有效方法之一。

怡康片 指紋圖譜 葛根素 姜黃素 高效液相色譜法

怡康片由葛根、靈芝、紅景天、甘草、積雪草等中藥組成，經(jīng)過傳統(tǒng)工藝提取、濃縮、干燥、粉碎后，加入姜黃提取物和適量輔料，經(jīng)過總混、制粒、壓片、包衣等制劑工序制成具有對(duì)化學(xué)性肝損傷起輔助保護(hù)功能的保健食品。葛根黃酮是中藥葛根的主要成分，大量的實(shí)驗(yàn)證明葛根黃酮具有抗氧化、降低血壓、解酒保肝和提高免疫功能等功效[1,2]，葛根黃酮類化合物越來越廣泛地被應(yīng)用于藥物和保健食品[3-5]。姜黃素是姜黃的活性成分，是一種多酚類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化等藥理作用。近年來，中藥姜黃的研究越來越多，其中，對(duì)姜黃素抗肝損傷作用的研究已陸續(xù)展開，其機(jī)理主要表現(xiàn)在抑制肝臟炎癥反應(yīng)、去除自由基等方面[6]。肝病疾病是現(xiàn)今威脅人類健康的主要疾病之一，其預(yù)防和治療受到了廣泛的關(guān)注，它是醫(yī)學(xué)界的重要任務(wù)，也是食品行業(yè)所面臨的巨大挑戰(zhàn)。由此說明，飲食對(duì)人體生命、健康、肝病預(yù)防有著重要的意義[7]。

怡康片是具有對(duì)化學(xué)性肝損傷起輔助保護(hù)功能的保健食品，標(biāo)志性成分為葛根素、粗多糖、總黃酮成分[8]。為了更好地對(duì)怡康片保健食品的質(zhì)量進(jìn)行控制，確保其功能，需建立一個(gè)較為全面的評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量的方法[9,10]。該方中藥味多，都是可以用于制作保健食品的原料，但是其成分復(fù)雜[11-13]，處方經(jīng)合提后，可以最大程度地提取出有效成分。然而，單味藥或者幾味藥所提取到的單一活性成分或兩個(gè)活性成分，并不能客觀地反映出中藥處方可以達(dá)到的整體效果。指紋圖譜的特點(diǎn)是可以解決成分復(fù)雜、有效成分不明確的植物藥質(zhì)量檢測(cè)等問題，因此，可以利用指紋圖譜技術(shù)手段對(duì)怡康片處方進(jìn)行宏觀分析[14-18]。怡康片兩個(gè)指標(biāo)成分分別為葛根素和姜黃素，實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法同時(shí)對(duì)怡康片進(jìn)行指紋圖譜研究和兩個(gè)指標(biāo)成分的定量測(cè)定，可作為一個(gè)有效的方法來全面控制保健食品怡康片的質(zhì)量。

1 儀器和材料

Ultimate 3000 HPLC，DAD紫 外 檢 測(cè) 器（美國賽默飛世爾科技公司）；Centrifuge 5415D高速離心機(jī)（德國艾本德公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Academic純水機(jī)（美國密理博公司）；FA1004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；Mettler AE240電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

怡康片（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：140601、140602、140603、140701、140801、140901、141001、141002、141003和141201）；對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院，姜黃素（批號(hào)：110823-201404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.8%計(jì)），葛根素（批號(hào)：110752-201313，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以95.5%計(jì)）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），色譜甲醇（美國天地公司），其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱采用Kromasil C18（柱長(zhǎng)為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm）；甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?-40 min，5%-56%甲醇，40-55 min，56%-95%甲醇；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL；姜黃素峰計(jì)算理論板數(shù)不低于3 000。詳見色譜圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取姜黃素、葛根素對(duì)照品適量，分析天平精密稱定，置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成含姜黃素35.32 μg·mL-1、葛根素116.86 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品約1 g，研缽研細(xì)，分析天平精密稱定，置150 mL磨口具塞錐形瓶中，精密加入現(xiàn)配的50%甲醇50 mL，稱定重量，置于超聲波清洗器內(nèi)（功率250 W，40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm濾膜，即得。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下制備的供測(cè)試樣品（批號(hào)：140701）10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，以峰面積計(jì)算各指標(biāo)成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Division，RSD）值，結(jié)果顯示，姜黃素為0.96%、葛根素為0.47%。以葛根素為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.76%，19個(gè)共有峰相對(duì)峰面積RSD值均小于2.55%。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系的考察

精密稱取姜黃素、葛根素適量，加甲醇制成含姜黃素191.65 μg·mL-1、葛根素584.15 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，將此儲(chǔ)備液作為母液用甲醇等比稀釋，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取10 μL進(jìn)樣，注入U(xiǎn)ltimate 3000液相色譜儀，測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性擬合，得姜黃素、葛根素線性回歸方程分別為Y=0.553 7X-1.541 1，r=1.000 0；Y=0.521 9X-1.466 3，r=1.000 0。姜黃素、葛根素在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性范圍分別為5.99-191.65、18.25-584.15 μg·mL-1。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取10 μL進(jìn)樣，分別在0、3、6、10、16、20、24 h注入U(xiǎn)ltimate 3000高效液相色譜儀，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算各成分RSD值，結(jié)果顯示，姜黃素為0.55%、葛根素為0.63%。

取同一供試品約1 g（批號(hào)：140701），研缽研細(xì)，分析天平精密稱定，按上述“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于0、3、6、10、16、20、24 h注入U(xiǎn)ltimate 3000液相色譜儀，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算各成分RSD值，姜黃素為1.10%、葛根素為0.61%。以葛根素為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.51%，19個(gè)共有峰相對(duì)峰面積RSD值均小于1.96%。結(jié)果表明，本品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品約1 g（批號(hào)：140701），研缽研細(xì)，分析天平精密稱定，按上述“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，姜黃素、葛根素的含量分別為1.29、4.54 mg·g-1，RSD值分別為1.15%、0.72%。以葛根素為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.27%，19個(gè)共有峰相對(duì)峰面積RSD值均小于2.03%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱定9份同一供試品約0.5 g（批號(hào)：140701），研缽研細(xì)，置具塞錐形瓶中，每3份為一組，9份樣品分別精密加入（含姜黃素0.650 mg·mL-1、葛根素2.253 mg·mL-1）0.8、1.0、1.2 mL的混合對(duì)照品溶液，再精密加入現(xiàn)配的50%甲醇至50 mL，置于超聲波清洗器內(nèi)（功率250 W，40 kHz）提取30 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm濾膜，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，注入U(xiǎn)ltimate 3000高效液相色譜儀，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，姜黃素、葛根素的平均回收率分別為100.12%、99.91%，RSD值分別為0.24%、0.15%。

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果

取10批怡康片，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積，分別計(jì)算姜黃素、葛根素兩個(gè)指標(biāo)性成分的含量。根據(jù)表1可以得出，10批怡康片中姜黃素、葛根素兩個(gè)指標(biāo)性成分的含有量差異較小。

2.9 指紋圖譜的建立與分析

采用國家藥典頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》進(jìn)行分析，經(jīng)過數(shù)據(jù)匹配，標(biāo)定19個(gè)共有峰，建立了10批怡康片樣品的指紋圖譜，具體指紋圖譜見圖2。怡康片10批次所測(cè)供試品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜相似度都在0.96以上，具體批次結(jié)果分別為：0.983、0.990、0.964、0.973、0.978、0.984、0.970、0.989、0.981和0.992。

2.10 指紋圖譜中共有峰的歸屬

在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，將中藥葛根、靈芝、積雪草、紅景天、甘草、姜黃藥材分別取樣后，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定上述供試品溶液，通過保留時(shí)間和DAD掃描結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，指紋圖譜中標(biāo)定的19個(gè)共有峰分別來自葛根、紅景天、甘草、姜黃藥材，其中1、4、5、6、7、10、11、15、18號(hào)峰來源于葛根，3、13號(hào)峰來源于紅景天，2、8、9、12、14號(hào)峰來源于葛根和紅景天，14號(hào)峰來源于甘草、葛根和紅景天，16號(hào)峰來源于甘草和葛根，17號(hào)峰來源于甘草，19號(hào)峰來源于姜黃，結(jié)果見色譜圖3。

3 討論

表1 10批怡康片兩個(gè)指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)果（n=2，mg·g-1）

對(duì)190-400 nm范圍掃描的各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，250 nm波長(zhǎng)下記錄的色譜圖基線平穩(wěn)，各色譜峰分離較好，此波長(zhǎng)下反映出的信息全面，而且葛根素在250 nm波長(zhǎng)下有較強(qiáng)吸收，所以選擇250 nm波長(zhǎng)作為怡康片指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

通過考察怡康片供試品的提取方法、提取時(shí)間、提取溶劑及其提取溶劑用量，最終確定了怡康片采用50%甲醇超聲提取30 min效果較好，適用于指紋圖譜分析；通過比較流動(dòng)相甲醇-0.01%磷酸、乙腈-水、甲醇-水系統(tǒng)對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果顯示，甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)所得指紋圖譜中各色譜峰的分離情況和峰形優(yōu)于另外兩種系統(tǒng)；比較了使用色譜柱Waters XBridge C18（4.6×250 mm，5 μm）、Kromasil C18（4.6×250 mm，5 μm） 和 Thermo syncronis C18（4.6×250 mm，5 μm）3種色譜柱對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果顯示，使用色譜柱Kromasil C18（4.6×250 mm，5 μm）時(shí)指紋圖譜中各色譜峰分離較好，用3支該類型的色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)性較好，因此選擇該類型色譜柱來測(cè)定怡康片指紋圖譜；比較了柱溫為25、30、35℃所得圖譜，結(jié)果顯示，柱溫為30℃時(shí)所得指紋圖譜中各色譜峰分離較好；比較了流動(dòng)相流速為0.8、1.0和1.2 mL·min-1所得圖譜，結(jié)果顯示，流速為1.0 mL·min-1時(shí)所得指紋圖譜中各色譜峰分離較好。方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法耐用性良好。

圖2 10批怡康片指紋圖譜

圖3 怡康片指紋圖譜中各共有峰歸屬色譜圖

本試驗(yàn)的含量測(cè)定結(jié)果和指紋圖譜顯示，10批怡康片（140601、140602、140603、140701、140801、140901、141001、141002、141003和141201批）中姜黃素、葛根素兩個(gè)指標(biāo)性成分的含有量差異較小，且兩個(gè)指標(biāo)成分質(zhì)量較穩(wěn)定。根據(jù)怡康片中葛根、靈芝、紅景天、甘草、積雪草等中藥材特性，建立了指紋圖譜及姜黃素、葛根素兩個(gè)指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法，為全面控制怡康片的質(zhì)量提供了依據(jù)，本試驗(yàn)可作為全面評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量的有效方法之一。

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Fingerprint and Two-component Quantitative Determination of Yi-Kang Tablet

Zhang Haitao1,2, Xu Zhenqiu1,2, Fu Juan1,2, Wang Zhenzhong1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process New-tech for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China)

This study was aimed to establish a HPLC fingerprint and quantitative determination on two components of Yi-Kang (YK) tablet in order to provide evidences for its evaluation. The Kromasil C18column (4.6 mm× 250 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of methanol-water gradient elution. The flow rate was 1.0 mL ·min-1. The column temperature was 30℃. And the detection wavelength was 250 nm. The results showed that the degree of separation and reappearance of YK tablet fingerprint was relatively good. There were 19 mutual peaks. The similarity among different batches was more than 0.96. Compared with the controls, two components, which were puerarin and curcumin, were identified. The quantitative analysis was given on these two components. It was concluded that the experiment simultaneously analyzed the fingerprint and two components. This method was rapid, simple and accurate, which can be used as one of the effective methods in the comprehensive quality evaluation of this preparation.

Yi-Kang tablet, fingerprint, puerarin, curcumin, HPLC

10.11842/wst.2016.01.017

R284.1

A

（責(zé)任編輯：劉馨雨 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-06-24

修回日期：2015-10-13

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，研究員級(jí)高級(jí)工程師，博士，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。