基于UPLC-Q-TOF/MS法分析車前子生品和鹽炙品化學(xué)成分研究＊

谷彩梅，王增繪，鄭司浩，黃林芳

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

基于UPLC-Q-TOF/MS法分析車前子生品和鹽炙品化學(xué)成分研究＊

谷彩梅，王增繪，鄭司浩，黃林芳＊＊

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：利用超高效液相串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）法分析車前子及其鹽炙品的成分，比較鹽炙前后藥物化學(xué)成分種類和含量的變化，探究車前子炮制前后藥效變化的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱；流動(dòng)相：0.1%乙酸水-甲醇體系梯度洗脫；ESI離子源；負(fù)離子模式；基于Markerlynx分析軟件，利用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘判別法（OPLS-DA）分析車前子鹽炙前后指紋圖譜的差異。結(jié)果：鹽炙品中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異 毛蕊花糖苷的含量相對(duì)生品高。京尼平苷酸和毛蕊花糖苷可作為化學(xué)標(biāo)記物區(qū)分生品與鹽炙品。結(jié)論：基于UPLC-Q-TOF/MS法建立了車前子炮制前后的化學(xué)成分分析方法。車前子鹽炙后有效成分含量增加。本實(shí)驗(yàn)的研究成果對(duì)于研究車前 子鹽炙的炮制原理具有重要意義，同時(shí)也為車前子鹽炙品藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了重要依據(jù)。

車前子 鹽炙車前子 UPLC-Q-TOF/MS 化學(xué)成分

車前子最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為常用中藥材，2015年版《中國(guó)藥典》收載其來源于車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressssa Willd.的干燥成熟種子，性甘、寒，歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰的功效，臨床上多用于熱淋澀痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛和痰熱咳嗽[1]。植物化學(xué)方面的研究表明，車前子中主要含有環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、多糖類、甾體類、三萜類、氨基酸及揮發(fā)油等化學(xué)成分[2-4]?，F(xiàn) 代藥理研究證實(shí)，車前子具有止瀉、抗氧化、護(hù)肝、降壓、抑菌、降低血清膽固醇等作用[5-7]。車前子炮制方法主要有炒制、酒炙、鹽炙等[8]，2015版《中國(guó)藥典》（一部）收載了車前子和鹽炙車前子，規(guī)定京尼平苷酸、毛蕊花糖苷作為其指標(biāo)成分。

中藥材在炮制過程中所含的化學(xué)組分往往會(huì)發(fā)生一定變化。超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Ultra Performance Liquid Chromatography-Q-Time Of Flight/Mass Spectrum，UPLC-Q-TOF/MS）具備高效分離能力和定性檢測(cè)能力，在中藥代謝組分分析等研究中已得到較多應(yīng)用[9,10]。本研究首次采用該技術(shù)分析車前子炮制前后成分變化，結(jié)合Markerlynx 4.1軟件進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonality Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA），探討鹽炙法對(duì)車前子炮制前后化學(xué)成分的影響，從化學(xué)成分角度闡述鹽炙車前子增效的科學(xué)內(nèi)涵和炮制機(jī)理，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

UPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用儀（Waters公司）；Mass-Lynx V4.1質(zhì)譜工作站（Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）。甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher）；乙酸（色譜純）。

車前子經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員和黃林芳研究員共同鑒定為車前科植物車前P. asiatica L.干燥成熟的種子，鹽炙車前子為本研究室自行炮制，部分樣品保存在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館。樣品信息詳見表1。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18；柱溫30℃，流速0.25 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A：0.1%乙酸水；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫（0→1 min，95%-85%A；1→10 min，85%→0%A；10→13 min，0%→95%A）。質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源（Electrospray Ionization，ESI），負(fù)離子模式檢測(cè)，m/z離子掃描范圍為50-1 200 Da。

2.2 供試品制備

車前子與鹽水拌勻，室溫下悶潤(rùn)，加熱烘干。方法參考本課題組建立的一種鹽炙車前子的新制備方法（專利申請(qǐng)?zhí)枺?012104264211）。

表1 車前子藥材列表

圖1 車前子及其鹽炙品UPLC-Q-TOF/MS譜圖

按《中國(guó)藥典》2015版車前子“含量測(cè)定”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密稱定車前子及其鹽炙品粉末（過2號(hào)篩）1.0 g，置入具塞錐形瓶中，加入60%甲醇50.0 mL，稱定重量。水浴加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取濾液過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.3 數(shù)據(jù)分析

基于MarkerLynx 4.1軟件分析車前子生品及其鹽炙品的質(zhì)譜峰信息；利用PCA和OPLS-DA法找出化合物譜的差異，經(jīng)分析得到化學(xué)標(biāo)記物。

3 結(jié)果

3.1 車前子及其鹽炙品總離子流圖比較

由車前子及其鹽炙品負(fù)離子模式下總離子流圖（圖1）可見，車前子鹽炙前后化學(xué)成分變化顯著。車前子鹽炙品與車前子生品相比，鹽炙品中的1、2、3、5、6號(hào)離子峰強(qiáng)度明顯升高；4、7、8號(hào)離子峰強(qiáng)度明顯降低；其余變化不明顯。鑒別出1號(hào)峰為京尼平苷酸（tR=3.00 min，m/z 373.082 2），2號(hào)峰為毛蕊花糖苷（tR=5.25 min，m/z 623.329 1），3號(hào)峰為異毛蕊花糖苷（tR=5.55 min，m/z 623.324 5）。其余未鑒定出。

3.2 MarkerLynx結(jié)果分析

MarkerLynx 4.1統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖2-圖3所示。PCA結(jié)果能明顯區(qū)分鹽炙品與生品（圖2）。鹽炙品分布在二維圖的中間左側(cè)，生品分布在二維圖的中間右側(cè)。將兩組樣品中的化學(xué)成分峰信息進(jìn)行OPLS-DA得到散點(diǎn)圖（圖3），散點(diǎn)圖中兩組數(shù)據(jù)的差異主要是由炮制前后成分的含量差異造成的。由此可見，鹽炙前后的成分含量具有顯著性差異。S型曲線兩端的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表樣品中可信度最高的特征化合物。右上方d-f代表車前子生品中含量較高的化合物，左下方a-c代表車前子鹽炙品中含量較高的化合物。點(diǎn)a（tR=5.23 min，m/z 623.328 2）、b （tR=2.99 min，m/z 373.082 4）、c（tR=2.99 min，m/z 747.081 5）、d（tR=11.08 min，m/z 277.121 9）、e （tR=11.25 min，m/z 279.140 2）、f（tR=6.57 min，m/z 713.791 6）是車前子鹽炙品與生品相比差異顯著的化學(xué)成分，可作為潛在的標(biāo)記物并為車前子鹽炙品與生品的鑒定提供依據(jù)。

圖2 車前子生品與鹽炙品負(fù)離子模式下OPLS-DA差異成分鑒別

圖3 車前子鹽生品與炙品OPLA-DA差異成分分析結(jié)果的散點(diǎn)圖

4 討論

通過PCA和OPLS-DA分析，發(fā)現(xiàn)車前子鹽炙后差異顯著的成分為京尼平苷酸（Geniposidic acid）和毛蕊花糖苷（Acteoside），即潛在標(biāo)記物，建議作為區(qū)分鹽炙品與生品的指標(biāo)成分。

鹽炒車前子炮制方法最早記載于清代《幼幼集成》中，“以青鹽水炒七次，治小兒泄瀉”。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載有“車前子，味甘、寒、無毒，主氣窿止痛，利水通小便，除濕痹，久服輕身耐老”。傳統(tǒng)藥方多用鹽炙車前子，一是能益肝明目，兼潤(rùn)心腎；二是能瀉腎濁，利尿而不傷陰，避免藥方中補(bǔ)藥之膩滯，與養(yǎng)陰補(bǔ)血藥同用，相輔相成，能更好地發(fā)揮全方作用[11]?！吨袊?guó)藥典》2015版規(guī)定，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷是車前子的指標(biāo)成分。本實(shí)驗(yàn)中車前子在鹽炙后京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量增加，而且鹽炙品中異毛蕊花糖苷含量也增加。京尼平苷酸屬于環(huán)烯醚萜類成分，毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷屬于苯乙醇苷類成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，環(huán)烯醚萜及其苷類具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其中，以京尼平苷酸活性最強(qiáng)[12]。因此，這可能是車前子鹽炙后增效的物質(zhì)基礎(chǔ)。鹽炙后的車前子兼潤(rùn)心腎，利尿而不傷陰，避免藥方中補(bǔ)藥之膩滯，這些作用可能是基于京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷含量增加而起效的。已有的研究對(duì)車前子炮制方法存在一定的爭(zhēng)議[8,13]，本文研究是基于2015版《中國(guó)藥典》收載的車前子炮制方法——鹽炙法。本文研究方法表明，車前子生品與炮制品在化合物種類和含量上都有較大差異。

5 結(jié)論

本研究基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)考察車前子炮制（鹽炙）前后化學(xué)成分的變化，并通過化學(xué)計(jì)量學(xué)識(shí)別車前子鹽炙前后有效成分變化，該方法能夠直觀和準(zhǔn)確地反映其炮制前后化學(xué)成分的變化。研究表明，車前子鹽炙后主要有效成分含量增加，為車前子炮制后用藥提供了重要依據(jù)。篩選出最佳的炮制工藝為4%鹽量，悶潤(rùn)90 min，160℃烘干35 min。

2015版《中國(guó)藥 典》明確規(guī)定京尼平苷酸、毛蕊花糖苷為成分標(biāo)準(zhǔn)?；诒疚牡难芯堪l(fā)現(xiàn)，異毛蕊花糖苷是炮制過程中含量變化明顯的組分，對(duì)異毛蕊花糖苷含量標(biāo)準(zhǔn)的研究可以進(jìn)一步完善車前子藥材質(zhì)量控制。中藥材中諸多 成分都有光譜吸收的特征，因此，在液相與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的同時(shí)，可以聯(lián)用光譜檢測(cè)器，如PDA紫外檢測(cè)器等。光譜檢測(cè)器與質(zhì)譜檢測(cè)器的聯(lián)用可以同時(shí)對(duì)一些重要的成分進(jìn)行精確的定量和定性分析，在中藥炮制方面會(huì)有更廣泛的運(yùn)用。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2015版(一部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015： 68-69.

2 Romero A L, West K L, Zern T, et al. The seeds from Plantago ovata lower plasma lipids by altering hepatic and bile acid metabolism in guinea pigs. J Nutr, 2002, 132(6)： 1194-1198.

3 何永婷,朱賀年.車前子的研究進(jìn)展.北方藥學(xué), 2011, 8(1)： 55-57.

4 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草:精選本(下冊(cè)).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1998： 1781.

5 王劭華,羅光明,曾金祥,等.中藥車前子的化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進(jìn)展.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2008, 4(9)： 133-135.

6 賈丹兵,孫佩江,孫麗濱.車前草的藥理研究.中草藥, 1990, 21(1)： 24-26.

7 張振秋,李鋒,孫兆姝,等.車前子的藥效學(xué)研究.中藥材, 1996, 19(2)： 87-89.

8 李果,張的鳳,王文凱,等.車前子炮制歷史沿革.中藥材, 2008, 31(5)： 776-779.

9 Li S L, Lai S F, Song J Z, et al. Decocting-induced chemical transformations and global quality of Du-Shen-Tang, the decoction of ginseng evaluated by UPLC-Q-TOF-MS/MS based chemical profiling approach. J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(4)： 946-957.

10 高洋,陳海敏,徐繼林,等. κ-卡拉膠寡糖的反相離子對(duì)-超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜研究.分析化學(xué), 2009, 37(11)：1590-1595.

11 葉定江,張世臣.中藥炮制學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社, 1999： 531-532.

12 Toda S, Miyase T, Arichi H, et al. Natural antioxidants.Ⅱ. Antioxidative components isolated from seeds of Plantago asiatica LINNE. Chem Pharm Bull, 1985, 33(3)： 1270-1273.

13 劉川玉,唐建紅.車前子炮制方法和用法考析.中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育, 2010, 8(11)： 87.

Analysis on Chemical Compositions of Crude and Salt-processed Plantago asiatica L. by UPLC-Q-TOF/MS

Gu Caimei, Wang Zenghui, Zheng Sihao, Huang Linfang
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

This study was aimed to investigate the changes of chemical compositions and contents of crude and salt-processed Plantago asiatica L. by the ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupoletime-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) in order to explore the material basis of effect changes before and after the processing. The chromatography separation was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18column with gradient elution of 0.1% water (acetic acid)-methanol. The mass spectrometry was equipped with electrospray ionization (ESI) source. The detection was under the negative ion mode. Based on the Markerlynx software, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLSDA) were used in the analysis of the differences on fingerprint before and after the salt-processing. The results showed that in the salt-processed P. asiatica L., the contents of geniposidic acid, acteoside and isoacteoside were higher than the crude material. Geniposidic acid and acteoside can be used as the chemical markers for thedifferentiation between the crude and salt-processed materials. It was concluded that the chemical composition analysis method based on UPLC-Q-TOF/MS was established on the study of crude and processed P. asiatica L. After salt-processing, the effective contents in P. asiatica L. were increased. The experiment results played an important role in the processing principle study of salt-processed P. asiatica L. It also provided important evidences for the interpretation of effective material basis on salt-processed P. asiatica L.

Plantago asiatica L., salt-processed P. asiatica L., UPLC-Q-TOF/MS, chemical composition

10.11842/wst.2016.01.013

R284.1

A

2014-08-27

修回日期：2015-10-27

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目-中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所資源中心項(xiàng)目（81274013）：西洋參不同產(chǎn)地品質(zhì)相關(guān)“地理特異基因群”的發(fā)掘，負(fù)責(zé)人：黃林芳。

＊＊ 通訊作者：黃林芳，研究員，主要研究方向：中藥資源學(xué)。

（責(zé)任編輯：劉馨雨 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）