周 紅,馬雙姣,陳貝貝,韓正洲,姚 輝**
(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193;2. 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)中心 深圳 518110)
雞血藤、滇雞血藤、大血藤等血藤類藥材的psbA-trnH條形碼分子鑒定*
周 紅1,馬雙姣1,陳貝貝2,韓正洲2,姚 輝1**
(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193;2. 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)中心 深圳 518110)
目的:中國藥典收載的雞血藤、大血藤、滇雞血藤及相關(guān)物種均有“血藤”之稱,其各自的來源不同,功效主治不同,不能混用。為確保其臨床用藥的安全、有效,本研究應(yīng)用DNA條形碼序列psbA-trnH對雞血藤、大血藤、滇雞血藤及其混偽品進(jìn)行鑒定研究。方法:通過對樣本進(jìn)行基因組DNA提取,PCR擴(kuò)增psbA-trnH序列。所得序列經(jīng)拼接后,用MEGA5.0和DNAMAN進(jìn)行種內(nèi)種間序列分析,構(gòu)建NJ樹,對psbA-trnH序列在血藤類藥材中的鑒定能力進(jìn)行評估。結(jié)果:雞血藤、大血藤和滇雞血藤序列長度和GC含量各不相同,psbA-trnH種內(nèi)序列相似度高,均高于它們與混偽品間的序列相似性。雞血藤、大血藤、滇雞血藤與其他非藥典收載的血藤類藥材的種間最小K2P距離分別為0.137、0.426和0.003,均大于其種內(nèi)最大遺傳距離0.014、0.004和0。在NJ樹中,雞血藤、大血藤均單獨(dú)聚為一支,能明顯的與其他混偽品區(qū)分開,滇雞血藤與異形南五味子聚為一支。結(jié)論:psbA-trnH序列能準(zhǔn)確鑒定雞血藤、滇雞血藤、大血藤藥材及其混偽品,該條形碼分子鑒定方法可作為傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充。
psbA-trnH 雞血藤 大血藤 滇雞血藤 DNA條形碼
就藤類藥材而言,凡是皮色發(fā)紅或鮮品被斬?cái)鄷r(shí)有紅色汁液流出的,習(xí)慣用“血”、“赤”、“紅”等字命名,這些混雜重疊的不規(guī)范藥名,給實(shí)際用藥帶來極大的麻煩。有關(guān)報(bào)道顯示,正名、異名作“血藤”的中藥有8種之多[1]。由于藥材功效相近或存在同名異物、同物異名等原因,使之容易混淆,加之市場流通中的部分藥材外形不完整,鑒別特征部分缺失等造成鑒定困難。但他們的基原植物屬于不同的科屬,且功能主治各異,不能混用。例如,2015版藥典中收載的大血藤Sargentodoxae Caulis為木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd. et Wils.的干燥藤莖,滇雞血藤Kadsurae Caulis為木蘭科植物內(nèi)南五味子Kadsura interior A.C. Smith的干燥藤莖[2]。雞血藤Spatholobi Caulis的本草記載存在差異,進(jìn)一步加劇了其用藥的混亂。1960版《中藥志》以豆科植物白花油麻藤M(fèi)ucuna birdwoodiana Tutch.為雞血藤正品[3];《廣州植物志》和《中國植物高等圖鑒》將豆科崖豆藤屬網(wǎng)絡(luò)崖豆藤M(fèi)illettia reticulate Benth.定為雞血藤原植物。1977版《中藥大辭典》[1]、1990版-2015版《中華人民共和國藥典》收載的雞血藤均為豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖[2,4-8]。由于這些植物藤莖被斬?cái)嗪?,木質(zhì)部會(huì)立即出現(xiàn)淡紅棕色,不久慢慢變成鮮紅色汁液流出,因此它們均有“血藤”之稱,也都有“活血調(diào)經(jīng)”的功效,但不同血藤類藥材性味歸經(jīng)及主治各異。如大血藤性苦,平,歸大腸、肝經(jīng),有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效,善散腸中瘀滯,為治療腸癰腹痛要藥[9];雞血藤與滇雞血藤均性苦、甘,溫,歸肝、腎經(jīng)。雞血藤活血作用較強(qiáng),長于舒筋活絡(luò),為風(fēng)濕痹痛及血虛有瘀諸證之常用藥,滇雞血藤補(bǔ)血作用較雞血藤強(qiáng)。為了確?!把佟鳖愃幉牡挠盟帨?zhǔn)確、安全、有效,亟需找到一種快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。
目前,國內(nèi)外對血藤類中藥材的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用等方面,其鑒定主要依賴性狀、顯微、理化性質(zhì)等方面[10-13]。分子鑒定研究較少,翟明等[14]曾對雞血藤類藥材的種質(zhì)資源進(jìn)行RAPD分析,安冉等[15]基于26S rDNA D1-D3 區(qū)序列差異對雞血藤及其混偽品進(jìn)行分子鑒別。孫稚穎等[16]曾采用硅膠干燥葉片獲得ITS2序列對藥典中收載的14種藤類藥材進(jìn)行鑒定研究。黃瓊林等[17]基于matK基因?qū)﹄u血藤及其混偽品進(jìn)行了分子鑒定。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),psbA-trnH序列在植物中進(jìn)化速率較快,長度適宜,兩端存在保守序列,容易設(shè)計(jì)通用引物,且該片段的引物具有高通用性、高擴(kuò)增成功率等特點(diǎn)[18]。本研究以雞血藤、大血藤、滇雞血藤藥材及其混偽品為研究對象, 分析其psbA-trnH序列種內(nèi)和種間變異,旨在為血藤類藥材的用藥安全及質(zhì)量控制提供分子鑒定依據(jù)。
表1 實(shí)驗(yàn)樣品信息表
1.1 材料
本研究共收集樣品79份,涉及3個(gè)科的8個(gè)不同物種,包括雞血藤42份,大血藤16份,滇雞血藤6份,其他血藤類15份,分別來自越南、廣西、廣東、湖北、云南、河北、安徽、廣州、北京等地。以上所有實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定無誤,樣品詳細(xì)信息見表1。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
實(shí)驗(yàn)藥材用75%乙醇擦試表面后晾干,稱取40-45 mg,用DNA提取研磨儀(Retsch MM400, 德國)研磨2 min(30次/秒)后,參照《中華人民共和國藥典》(2010年版第三增補(bǔ)本)中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則[19]規(guī)定的莖木類藥材DNA提取方法提取總DNA。
1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序
psbA-trnH序列擴(kuò)增用正向引物為5'-GTTAT GCATGAACGTAATGCTC-3',反向引物為5'-CGC GCATGGTGGATTCACAATCC-3'。PCR反應(yīng)體積為25 μL,反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照陳士林主編的著作《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》[20]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,使用ABI 3730XL(Applied Biosystems Co.,美國)測序儀進(jìn)行雙向測序。
1.2.3 數(shù)據(jù)處理
測序峰圖經(jīng)校對拼接,去除引物區(qū)和低質(zhì)量區(qū);將所有序列用軟件MEGA5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析[21],并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離等分析,用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。并利用DNAMAN 6.0對序列進(jìn)行相似性分析。
表2 雞血藤(Sp. suberectus)psbA-trnH序列變異位點(diǎn)
表3 血藤類藥材的psbA-trnH序列特征
2.1 序列信息及變異分析
實(shí)驗(yàn)獲得血藤類藥材psbA-trnH序列長度為240-451 bp,GC含量為22.1%-41.3%,其中雞血藤psbA-trnH序列42條,序列長299 bp,GC含量為22.1%-22.6%,平均GC含量為22.2%,共獲得5種不同的單倍型,出現(xiàn)了7處變異,如表2所示。大血藤psbA-trnH序列16條,序列長240 bp,GC含量為41.3%,共獲得2種不同的單倍型a1(14條)、a2(2條)。僅在38位點(diǎn)處存在A-T變異。內(nèi)南五味子psbA-trnH序列6條,異形南五味子psbA-trnH序列1條,序列長度均為328 bp,6條內(nèi)南五味子序列一致,GC含量為36.3%。內(nèi)南五味子與異形南五味子psbA-trnH序列僅在218位點(diǎn)處存在A-C變異,詳細(xì)序列信息見表3。
2.2 種內(nèi)及種間變異分析
應(yīng)用MEGA 5.0軟件,基于K2P遺傳距離模型,對各種血藤進(jìn)行種內(nèi)種間變異分析,藥典收載的物種雞血藤、大血藤、滇雞血藤與其他非藥典收載的血藤類藥材的種間最小K2P距離分別為0.137、0.426和0.003,均大于其種內(nèi)最大遺傳距離0.014、0.004和0。它們與其他血藤的種間平均K2P距離分別為0.506、0.779和0.822。
應(yīng)用DNAMAN軟件對各種血藤類藥材的psbA-trnH序列進(jìn)行序列相似性比較分析,結(jié)果如表4所示,雞血藤、大血藤psbA-trnH序列種內(nèi)相似度非常高,為98%-100%,遠(yuǎn)高于它們與混偽品間的序列相似性。滇雞血藤psbA-trnH序列種內(nèi)的相似度為100%,與其他血藤類藥材序列相似度為30.7%-99.7%,其中與異形南五味子的序列相似度最高,相似度為99.7%。
2.3 NJ樹分析
以研究樣本的單倍型構(gòu)建NJ樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雞血藤、大血藤均單獨(dú)聚為一支,且具有較高的自展支持率,分別為100%、93%,能明顯與其他血藤類物種區(qū)分開。滇雞血藤藥材的基原物種內(nèi)南五味子與異形南五味子在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支,與其他血藤類藥材可明顯區(qū)分(如圖1所示)。
表4 雞血藤、大血藤、滇雞血藤及其混偽品的序列相似性分析/%
圖1 基于psbA-trnH序列構(gòu)建的雞血藤、大血藤、滇雞血藤及其混偽品的鄰接(NJ)樹
由于本草記載的差異和地方用藥習(xí)慣的不同導(dǎo)致中藥的學(xué)名、別名繁多混亂,出現(xiàn)“異藥同名”和“同名異藥”的現(xiàn)象,它是導(dǎo)致藥材誤用或混用的主要原因之一,給中藥材的流通與監(jiān)管帶來不便。藥材的誤用、混用又會(huì)造成“病準(zhǔn)-方對-藥不靈”的現(xiàn)象,嚴(yán)重影響中醫(yī)臨床療效,延誤中醫(yī)治療,甚至損害患者健康,曾經(jīng)的“關(guān)木通事件”和“廣防己事件”就引發(fā)了全世界的關(guān)注和討論。為確保中藥材的質(zhì)量、療效和安全性,對中藥材的準(zhǔn)確鑒定可從源頭上提供保障。DNA條形碼分子鑒定方法具有獨(dú)特的3大優(yōu)勢:方法通用性強(qiáng)、鑒定結(jié)果可重復(fù)性好、可構(gòu)建統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫和鑒定平臺(tái),易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化[22],該方法對于同名異藥、異藥同名藥材的鑒定已有較多的研究報(bào)道。辛天怡[23]等基于DNA條形碼序列ITS2成功鑒定了“胡麻”類藥材,馬曉沖[24]、夏葉[25]等分別應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)成功鑒定了“木香”類藥材和“功勞葉”藥材。psbA-trnH序列因其序列變異性高,是ITS2序列的補(bǔ)充,共同作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。在中藥材的鑒定中也有較多的應(yīng)用,Yao等[26]、楊培等[27]、Sun 等[28]、He等[29]、Li等[30]分別應(yīng)用psbA-trnH序列對石斛類藥材、藥食同源肉桂類藥材、金銀花和山銀花等藥材、烏頭屬藥材、桑寄生藥材進(jìn)行鑒定研究。本研究基于psbA-trnH序列,應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)通過計(jì)算K2P遺傳距離、序列相似性分析及構(gòu)建NJ樹的方法對“血藤”類藥材進(jìn)行鑒定并獲得成功,復(fù)核樣本[31]YC0001MT29*、YC0279MT17*、YC0279MT18*、YC0699MT02*、YC0699MT05*由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所進(jìn)行復(fù)核,同一實(shí)驗(yàn)樣本獲得的序列一致,說明采用DNA條形碼技術(shù)鑒定血藤類藥材具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。psbA-trnH序列可有效鑒定不同種的血藤類藥材,對Pang 等[32]、He等[29]研究中發(fā)現(xiàn)的psbA-trnH序列存在的inversion現(xiàn)象,在本研究的幾個(gè)物種中暫未發(fā)現(xiàn)。
滇雞血藤基原植物內(nèi)南五味子K. interior在《Flora of China》中已被合并至異形南五味子K. heteroclita中。Saunders[33]也于1998年將K. interior歸并入K. heteroclita。有研究者對兩個(gè)物種的葉表皮形態(tài)特征[34]、種子形態(tài)[35]進(jìn)行了對比,認(rèn)為它們應(yīng)為同一物種,且其化學(xué)成分和藥理作用[36]也比較相似。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)南五味子與異形南五味子的psbA-trnH序列差異很小,序列相似度高,在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為一支,從系統(tǒng)發(fā)育的角度看,此兩種植物的親緣關(guān)系很近。由于內(nèi)南五味子K. interior僅分布于云南西南部(保山、鳳慶、臨滄、耿馬),而異形南五味子K. heteroclita的分布較為廣泛,在中國華南至西南地區(qū)均有分布。因此,此兩種植物的合并對擴(kuò)大中藥材滇雞血藤的藥材來源具有十分重要的意義。
致謝
感謝復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院盧燕副教授提供部分實(shí)驗(yàn)樣品及中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所對部分樣品進(jìn)行的復(fù)核實(shí)驗(yàn)!
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Zhou Hong1, Ma Shuangjiao1, Chen Beibei2, Han Zhengzhou2, Yao Hui1
(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Research Center, China Resources of Sanjiu Medical & Pharmaceutical Co., Ltd., Shenzhen 518110, China)
Identification of Spatholobi Caulis, Kadsurae Caulis and Sargentodoxae Caulis UsingThe psbA-trnH Barcode
Spatholobi Caulis,Sargentodoxae Caulis and Kadsurae Caulis recorded in the Chinese Pharmacopoeia were all called “Xueteng”. Because of their different sources and efficacies, they cannot be misused. In order to ensure their clinical safety and efficacy, the psbA-trnH region was used to identify Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis and their adulterants. Total genomic DNA was extracted, and the psbA-trnH region was amplified and sequenced. The intra- and inter-specific genetic distances were computed using MEGA5.0 and DNAMAN. The neighbor-joining (NJ) tree was constructed.The identification competence of psbA-trnH in “Xueteng” herbs was assessed. The results showed that these quence lengths and GC contents of Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis were different.The intraspecific sequences had high similarities, which was higher than its interspecific sequence similarity compared to its adulterants. The minimum interspecific distances of Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis were 0.137, 0.426 and 0.003, respectively. All of them were more than their maximum intraspecific distances,which were 0.014, 0.004 and 0. In NJ tree, Spatholobi Caulis and Sargentodoxae Cauliswere formed into one single branch, which can be clearly distinguished from other adulterants. Kadsurae Caulisand Kadsura heteroclite were formed into one single branch. It was concluded that the psbA-trnH region can accurately distinguish Spatholobi Caulis, Kadsurae Caulis, Sargentodoxae Caulisfrom their adulterants. This DNA barcoding molecular identification method can be used as an effective complement to the traditional identification methods.
psbA-trnH, Spatholobi Caulis, Sargentodoxae Caulis, Kadsurae Caulis, DNA barcoding
10.11842/wst.2016.01.007
R931.5
A
(責(zé)任編輯:馬雅靜 張志華,責(zé)任譯審:王 晶)
2015-06-16
修回日期:2015-12-01
* 科學(xué)技術(shù)部“863”計(jì)劃(2012AA021602):基于DNA條形碼的珍稀藥用、野生等資源快速檢測技術(shù)及產(chǎn)品研發(fā),負(fù)責(zé)人:陳士林。
** 通訊作者:姚輝,副研究員,碩士生導(dǎo)師,主要研究方向:中藥資源與分子鑒定。